Part Ⅱ: La sobreexpressió de PKD1 provoca la malaltia renal poliquística

Contacte: Audrey Hu Whatsapp/hp: 0086 13880143964 Correu electrònic:audrey.hu@wecistanche.com

Caroline Thivierge, Almira Kurbegovic, Martin Couillard, Richard Guillaume, Olivier Coté i Marie Trudel

Els mecanismes patogenètics subjacentsautosòmica dominant malaltia poliquística del ronyó(ADPKD) queden per dilucidar. Tot i que hi ha proves que PKD1 (malaltia poliquística del ronyó 1) l'haploinsuficiència gènica i la pèrdua d'heterozigositat poden provocar la formació de quists en ratolins, nivells paradoxalment alts de PKD1 (malaltia poliquística del ronyó 1) s'han detectat expressió en els ronyons de pacients amb ADPKD (malaltia renal poliquística autosòmica dominant). Per determinar si PKD1 (malaltia poliquística del ronyó 1) el guany de funció pot ser un procés patogenètic, un PKD1 (malaltia poliquística del ronyó 1) cromosoma artificial bacterià PKD1 (malaltia poliquística del ronyó 1)-BAC) es va modificar per recombinació homòloga per dirigir-se únicament a un PKD1 sostingut (malaltia poliquística del ronyó 1) expressió preferentment al ronyó adult. Es van generar diverses línies transgèniques que sobreexpressaven específicament el PKD1 (malaltia poliquística del ronyó 1) transgen als ronyons 2- per 15-plegar sobre PKD1 (malaltia poliquística del ronyó1) nivells endògens. Tots els ratolins transgènics van desenvolupar de manera reproducible quists tubulars i glomerulars i insuficiència renal i van morir per insuficiència renal. Aquest model demostra que la sobreexpressió de PKD1 de tipus salvatge (malaltia poliquística del ronyó 1) només és suficient per desencadenar una cistogènesi semblant a l'ADPKD humana (autosòmica dominantmalaltia poliquística del ronyó). Els nostres resultats també van descobrir un sorprenent augment de l'expressió renal de c-Myc en ratolins de totes les línies transgèniques, cosa que indica que c-Myc és un efector crític in vivo aigües avall del PKD1 (malaltia poliquística del ronyó 1) via molecular. Aquest estudi no només va produir un primer i inestimable PKD（malaltia poliquística del ronyó）model per avaluar la patogènesi molecular i les teràpies, però també proporciona proves que el guany de funció podria ser un mecanisme patogenètic en l'ADPKD (malaltia renal poliquística autosòmica dominant).

Cistanche tractant la malaltia renal

FEU CLIC AQUÍ PER PART Ⅰ

RESULTATS

Producció de PKD1 (malaltia poliquística del ronyó 1)-Ac-BAC per recombinació homòloga. Per determinar si PKD1 (malaltia poliquística del ronyó 1) només el guany de funció és suficient per produir el fenotip ADPKD (malaltia renal poliquística autosòmica dominant), primer vam aïllar un clon genòmic que conté tot el PKD1 (malaltia poliquística del ronyó 1) en una biblioteca de vectors BAC 129/Sv. Aquesta biblioteca es va examinar per PCR amb dos conjunts d'encebadors per al PKD1 (malaltia poliquística del ronyó 1) gen que abastava l'exó 1 a l'extrem 5' i els exons 39 a 40 cap a l'extrem 3' (figura 1). Un clon BAC positiu per al PKD1 (malaltia poliquística del ronyó 1) es va identificar el gen que incloïa tot el cos del gen Tsc2 adjacent. La inserció PKD1 (malaltia renal poliquística 1) es va caracteritzar amb detall per garantir que l'estructura genòmica coincideix amb la del PKD1 endogen (malaltia poliquística del ronyó1) gen de la soca de ratolí 129/Sv de la qual es va derivar la inserció i de la soca endogàmica C57BL/6J. Mapes genòmics del PKD1 (malaltia poliquística del ronyó 1) al BAC i en aquestes soques endogàmiques mitjançant anàlisi Southern blot, amb quatre digestions d'enzims de restricció i set sondes que cobreixen tot el PKD1 (malaltia poliquística del ronyó 1), semblava idèntic sense evidència de reordenaments (Fig. 1). Aquest BAC contenia una inserció de -121-kb que incloïa ~37 kb de seqüència aigües amunt i -39 kb d'una seqüència aigües avall del PKD1 (malaltia poliquística del ronyó1) gen determinat per electroforesi i seqüenciació.

FIG. 2.Producció de construccions SBPkdlrAc i ratolins transgènics. ( a ) Es van dur a terme successius esdeveniments de recombinació homòloga al Pkdl-BAC murí per introduir dues modificacions: els elements reguladors SB inserits immediatament aigües amunt del codó d'inici Pkdl i una mutació puntual silenciosa d'EcoRI (RI *) introduïda a l'exó (ex) 10. El vector de recombinació BAC conté un origen de replicació R6Ky, un gen resistent a l'ampicil·lina, un gen SacB, un gen RecA i un lloc de clonació Smal únic en el qual es van clonar els elements reguladors "SB" (o la mutació puntual silenciosa de l'exó 10). amb braços del gen Pkd1 flanquejant. El vector de recombinació BAC es va electroporar a cèl·lules E, coli (DH10B) que contenien el tipus salvatge Pkdl-BAC i, després de la selecció, es va produir un primer esdeveniment de recombinació homòloga mitjançant un dels dos braços Pkd1 per produir cointegrats de BAC. El vector de recombinació i les regions Pkdl duplicades dels cointegrats de BAC es van eliminar en un segon pas de selecció. Els Pkdl-BAC resolts poden tornar al tipus salvatge o incloure la modificació prevista. Aleshores es pot introduir la recombinació homòloga posterior en el BAC recent modificat. (b) (l'ADN de l'enomc ot el mxce SBPkd l-etransgènic es va analitzar per la taca Sou thern. AVicToiD1ecLon de fragments linealitzats va provocar la inserció del transgen en un cap a cap. orientació -a la cua i/o de la cua a la cua. L'extrem 5' es va analitzar mitjançant la digestió de l'ADN genòmic amb HindIII i es va hibridar amb la sonda transgènica SB específica (tauler esquerre). Les tres línies de ratolí transgènics van generar el 10 esperat. Banda de .9-kb per a la inserció de cap a cua; la banda addicional observada a la línia 39 probablement representa un fragment d'unió entre SB i el genoma del ratolí. La integritat interna del transgen es va controlar mitjançant diverses digestions d'enzims de restricció i Es mostra una taca representativa d'ADN genòmic digerit amb EcoRI i hibridat amb la sonda Pkdl (exó 7-15) (tauler central).

Aquest SBPKD1 (malaltia poliquística del ronyó 1El clon )-BAC es va modificar per dos successius esdeveniments de recombinació homòloga a E. coli. El gen PKD1 (malaltia renal poliquística 1) es va etiquetar a l'exó 10 substituint un nucleòtid (G a A) per crear un nou lloc EcoRI a la posició 2355 del mapa d'ADNc. Aquesta mutació puntual silenciosa es va produir per distingir el PKD1 (malaltia poliquística del ronyó 1) gen i transcripció del BAC del d'origen endogen. A més, hem substituït els 5'elements reguladors del PKD1 (malaltia poliquística del ronyó 1)-BAC aprofitant els elements específics de l'epiteli renal "SB" identificats prèviament del gen SBM (enllaçat a c-Myc) o SBF vinculat a c-fos) constructe-trans per restringir l'expressió als ronyons(36, 38)(Fig. 2a).

Aquest nou SBPkdlrAG-BAC es va digerir amb NotL, un lloc únic situat immediatament aigües amunt dels elements SB, i ClaI dins del cos del gen Tsc2, truncant els elements reguladors de Tsc2 i la meitat 5' del cos del gen per assegurar la manca de T'sc2. expressió exògena a tots els teixits i eliminar les seqüències del vector BAC procariotes (Fig.1 i 2). Aquest fragment linealitzat de 70-kb NotI-ClaI es va aïllar i es va purificar. i quantificat per a la microinjecció d'oòcits (36).

BENEFICIA DE CISTANCHE: TRACTAMENT DE MALALTIES RENOLÓS

Producció i anàlisi de ratolins transgènics SBPkdl-ac. Quatre fundadors transgènics que porten diverses còpies del transgen SBPkdlrAc van desenvolupar constantment PKD. Dels quatre SBPKD1 (malaltia poliquística del ronyó 1)Ratolins fundadors de RAC determinats per anàlisi Southern, tres SBPKD1 (malaltia poliquística del ronyó 1) Les línies transgèniques TAG es van establir amb dues a nou còpies del transgène (Fig. 2b). La caracterització de la integritat del transgen en aquestes línies es va controlar amb sondes 5', internes i 3', tal com es mostra en exemples representatius a la figura 2b. Línies transgèniques revelades amb la sonda 5'"SB" una banda de 10,9 kb coherent amb el SBPkdlrAc el gen trans està integrat en una orientació cap a cua i es va revelar amb la sonda 3' una banda de 7.1-kb (Fig.2b). A més, la sonda interna va detectar la banda endògena PKD1 (malaltia renal poliquística 1) de 9,4-kb, així com les bandes de 6,9-kb i 2,5-kb del transgène a causa del lloc d'inserció EcoRI a l'exó 10 (Fig. 2b). Aquests ratolins contenien còpies completes del transgen basades en l'anàlisi de l'estructura genòmica superposada.

PKD1 (malaltia poliquística del ronyó 1) guany de funció en ratolins transgènics SBPkdl-Ac adults. Expressió del SBPkdl-AG. transgen i PKD1 (malaltia poliquística del ronyó 1) es va investigar el gen en diversos òrgans. La quantificació dels nivells de transcripció del transgen i/o el gen endogen es va dur a terme mitjançant l'anàlisi Northern blot (Fig. 3a). Com era d'esperar, les transcripcions de gens transgènics i endògens eren de longitud similar (14, 2 kb). A partir de l'expressió de control de GAPDH, els ronyons de totes les línies de ratolí SBPkd 1 A havien augmentat constantment l'expressió de transcripció en comparació amb PKD1 normal (malaltia poliquística del ronyó 1) nivells en ronyons adults (n=3) d'edat similar. El transgen renal i l'expressió endògena per a les diferents línies transgèniques mostraven un rang de 2- a 15-plegament per sobre del control PKD1 endògen renal.(malaltia renal poliquística 1)(Fig. 3a). En particular, la línia transgènica39 (n=4) va mostrar un PKD1 més alt (malaltia poliquística del ronyó 1) que les línies 3 (n=3) i 41 (n=4). A més, PKD1 (malaltia poliquística del ronyó 1) els nivells d'expressió mesurats mitjançant l'anàlisi de Northern blot es correlacionen amb els obtinguts per PCR en temps real mitjançant cebadors als exons 1 i 2 (Fig. 3b).

FIG.3.Anàlisi de l'expressió renal de ratolins SBPkdlrA. ( a ) Anàlisi d'expressió de les transcripcions de transgènics (Tg) endògens de Pkd1 i SBPkdlrA als ronyons de tres línies transgèniques mitjançant Northern blotting. Es van comparar dues mostres de cada línia transgènica, 3, 39 i 41, amb una transcripció Pkdl renal endògena de ratolins de control normal coincidents amb l'edat del mateix fons genètic (C5BI 6I × CBA/DE, es van obtenir mostres d'ARN renal de ratolins transgènics abans de Malaltia renal terminal. Les transcripcions d'endo i Tg tenen -14,2 kb de longitud. Es va observar una sobreexpressió sistemàtica de les transcripcions en els ronyons de tots els ratolins transgènics en relació amb els controls no transgènics. Es va utilitzar GAPDH com a control intern La quantificació de l'expressió renal en aquests ratolins transgènics va oscil·lar entre 2- i 15- vegades en relació amb els nivells endògens de Pkd1 dels ratolins control establerts arbitràriament en 1. (b) La representació esquemàtica del transgène i els primers SBPkdl-. s'utilitza per amplificar Pkdl total incloent endògens i transgènics (exó 1 i exó 2) i només transgènics Pkd1 (B. exon 2) mitjançant PCR en temps real i RT-PCR semicuantitativa, l'anàlisi RT-PCR de l'expressió transgènica SBPkdlAc es va quantificar en renal. i extra teixits renals. Es mostra una avaluació semiquantitativa representativa del transgen SBPkdl.Ac (Tg) que inclou una mostra de teixit renal (K) d'un ratolí de les tres línies transgèniques (3. 39 i 41) i de teixits extrarenals. H, cor; Lu, pulmó; B. cervell; Li, fetge; i S. melsa d'un ratolí de la línia 39. L'expressió del transgen és fàcilment detectable als ronyons de tots els ratolins transgènics, mentre que és baixa o indetectable en teixits extrarenals. L'expressió del transgen SBPkd1rAc va produir un amplicó de 307-bp específic, mentre que el control intern S16 va generar un amplicó de 102-bp. Marcador M,100-bp; H, O, control negatiu per a l'amplificació per PCR. (c) Anàlisi de l'expressió PCR en temps real del SBPkdlr. El transgen es va determinar a partir de diversos ratolins independents. El transgène SBPkdl.Ac de les tres línies transgèniques de ratolí 3 (n=5), 39 (n =7) i 41 (n=5) va mostrar que les línies 39 i 41 tenien les més altes nivells d'expressió renal. L'expressió del transgen SBPkdlrAc en teixits extrarenals de ratolins (n ​​= 3) de les tres línies transgèniques es va avaluar mitjançant PCR en temps real. En comparació amb els ronyons de cada línia transgènica (100 per cent), l'anàlisi dels teixits extrarenals va mostrar que els nivells d'expressió transgènica eren constantment inferiors entre 10- i 1,000- vegades al cervell, al cor, al fetge i al pàncrees. , melsa i pulmó. (d) Expressió del gen c-mc endògen als ronyons SBPkdl.Ac mitjançant RT-PCR semicuantitativa. Una il·lustració esquemàtica mostra els primers utilitzats per amplificar c-Myc. Com era d'esperar, l'expressió de c-Myc és mínima en els ronyons no transgènics adults (controls). En canvi, es detecta un augment de l'expressió de c-Mye en tots els ronyons SBPkdlrAc adults de les tres línies, tal com s'observa en els ronyons SBM transgènics adults utilitzats com a control positiu. L'amplicó de c-Myc era de 250 pb; l'amplicó de S16, un control intern, era de 102 bp.M, marcador 100-bp.

La quantificació dels nivells d'expressió transgènica es va dur a terme específicament mitjançant PCR en temps real i RT-PCR semicuantitativa a les tres línies transgèniques a l'edat adulta mitjançant cebadors a la regió 5' no traduïda (promotor B, -globina) i a l'exó 2 de PKD1. (malaltia poliquística del ronyó 1)(Fig.3b). El SBPKD1 (malaltia poliquística del ronyó 1) L'expressió de RAC en ratolins transgènics es va comparar amb el producte del gen de la proteïna ribosòmica S16 com a estàndard intern. Les condicions utilitzades per a l'amplificació semiquantitativa de RT-PCR estaven dins del rang lineal. L'expressió transgènica per PCR en temps real i RT-PCR semicuantitativa va mostrar de manera coherent i específica la més alta expressió al ronyó de totes les línies transgèniques en relació amb altres òrgans (Fig. 3b i c). Els nivells d'expressió renal d'una mostra individual eren reproduïbles amb qualsevol de les tècniques de detecció utilitzades. Els nivells més alts de PKD1 (malaltia poliquística del ronyó 1) es va mesurar l'expressió renal transgènica per a les línies 39 i 41. Per controlar si l'expressió augmentada de PKD1 (malaltia renal poliquística 1) resultava del transgen o del gen endogen, es va comparar el mateix grup de ratolins de les tres línies transgèniques per a la PKD1 renal ( malaltia renal poliquística 1) expressió transgènica i per a PKD1 renal (malaltia renal poliquística 1) expressió total (transgènica i endògena) mitjançant PCR en temps real. Curiosament. les línies 39 i 41 en relació amb la línia 3 van mostrar que l'augment de PKD1 (malaltia poliquística del ronyó 1)l'expressió renal del transgen era similar o superior a la de l'expressió renal total de PKD1 (malaltia renal poliquística 1), assenyalant el transgen com a responsable específicament d'aquesta expressió induïda. En diversos òrgans (incloent-hi cor, pulmó, cervell, fetge, pàncrees i melsa), el SBPKD1 (malaltia poliquística del ronyó 1) RAC; el transgen va mostrar una expressió molt feble detectada ocasionalment a la melsa i al pulmó, amb poca expressió o indetectable en altres òrgans (Fig. 3b). La quantificació mitjançant PCR en temps real va demostrar un nivell 10-a 1,000- vegades inferior de l'expressió transgènica als teixits extrarenals en relació amb l'expressió renal (figura 3c). Els elements reguladors "SB" del transgen SBPkdlrAc van conferir una expressió renal preferencial; aquesta distribució d'òrgans en particular també es va determinar quan s'utilitzava en transgens vinculats a c-Myc (SBM) i c-fos (SBF) (36, 38). c-Mye, un efector aigües avall de PKD1 (malaltia poliquística del ronyó 1) vies de senyalització en SBPkdlrAc: ratolins. Per conèixer el mecanisme patogenètic intracel·lular dels ratolins transgènics SBPkdlrAc, a continuació vam intentar controlar el nivell d'expressió renal de c-Myc basant-nos en la nostra observació prèvia de la desregulació de c-Myc en ronyons ADPKD (malaltia renal poliquística autosòmica dominant) humana (22). L'anàlisi dels ronyons es va dur a terme a partir de les tres línies transgèniques 3(n=4).39(n=7)i 41 (n=4), així com els controls (n{{9}). }}). Tal com es mostra a la figura 3d, hi ha una expressió substancial de c-Mye endògena induïda en ratolins SBPkdlrAa en relació amb ratolins control d'edat similar. Curiosament, el nivell d'expressió de c-Myc en alguns ronyons SBPkdlrAG, en particular la línia 39, va assolir nivells comparables als observats en el model de ratolí transgènic PKD SBM produït per l'expressió renal de c-Myc.

Anomalies renals en SBPKD1 (malaltia poliquística del ronyó 1) ARC mice similar to PKD. To characterize the phenotype caused by the transgene expression, gross and histologic examinations were undertaken on transgenic kidneys. Adult kidneys from all transgenic lines were affected bilaterally. Kidneys contained numerous cortical cysts that varied from microscopic to macroscopic in size (Fig.4a and b). SBPkdlrAc. kidneys were pale, a typical finding in PKD. On histologic examination, all transgenic founder mice and progenies (n = 25;n>6 per a cada línia) van desenvolupar múltiples quists tubulars (T) i glomerulars (G) (Fig. 4d, f i g). Es van observar quists als túbuls de les regions corticals i medul·lars, així com a la recollida de túbuls de la papil·la (Fig 4d i e). Els ratolins transgènics van mostrar hiperplàsia epitelial tubular (punta de fletxa) que implicava tant túbuls quístics com no quístics i hipertròfia freqüent (Fig. 4g i h). però la gravetat variava entre els ratolins individuals. Fibrosi intersticial (F). S'observaven amb freqüència infiltrats limfoides perivasculars i motlles proteïnes (P) (Fig. 4d i e)

Fig. 4

Per definir amb més precisió el lloc de localització de l'augment de PKD1 (malaltia poliquística del ronyó 1)expressió als ronyons, vam realitzar una hibridació in situ mitjançant la sonda d'exó 36-45 utilitzada anteriorment(16). El senyal d'hibridació es va localitzar específicament a les cèl·lules epitelials que recobreixen el quist i els túbuls hiperplàstics, així com els quists glomerulars. A més, es va veure algun senyal sobre l'epiteli de túbuls no quístics o lleugerament dilatats, probablement identificant túbuls predestinats a patir futurs canvis quístics (Fig. 4i i j). L'anàlisi histològica renal també es va realitzar en ratolins transgènics en néixer (n=8), el dia postnatal 10 (P10) (n=3), P20 (n{=5), P35 (n{{ {10}}), i P45(n= 3) en comparació amb els companys negatius del mateix grup d'edat (n =2 a 4). Curiosament, tots els ratolins transgènics acabats de néixer van mostrar una dilatació tubular i glomerular en relació amb controlen els companys de camada negatius (Fig. 4k i 1), cosa que indica que les anomalies renals es van iniciar in utero tal com s'observa en ratolins SBM i en ADPKD (malaltia renal poliquística autosòmica dominant) pacients. La dilatació tubular i glomerular augmentava en grandària i nombre amb l'edat progressiva. Per P35, els ratolins transgènics van mostrar una hiperplàsia més severa i evidència de glomeruloesclerosi Funcions fisiològiques renals alterades en ratolins SBPkdlrsc. Les funcions fisiològiques renals de tots els ratolins transgènics mostraven característiques similars a la PKD, mentre que els companys no transgènics mai van desenvolupar la malaltia. Pocs mesos després del naixement, els animals afectats van desenvolupar una insuficiència renal crònica. Aquests animals es van controlar els paràmetres funcionals renals mitjançant la mesura dels nivells sèrics i urinaris. nitrogen ureic sanguini (BUN) i creatinina, osmolalitat de l'orina, proteïnes de l'orina i excreció d'ions (taula 1). Tots els ratolins de les tres línies en comparació amb els controls mostraven defectes de concentració, una troballa comuna en ADPKD (malaltia renal poliquística autosòmica dominant). i en conseqüència va mostrar una disminució del BUN urinari. concentracions de creatinina, proteïnes i ferro. SBPKD1 transgènic (malaltia poliquística del ronyó 1)rAc.fundadors i descendents (n=6) de cada línia es van controlar qualitativament per a la proteinúria en mostres d'orina mitjançant SDS-PAGE (Fig. 5). Els ratolins de més de 2 mesos van mostrar una proteinúria no selectiva que va progressar amb l'edat. A més, es van augmentar els nivells de BUN sèric i creatinina sèrica, revelant insuficiència renal (taula 2). Com que la insuficiència renal crònica condueix habitualment a alteracions en els paràmetres hematològics, aquests es van examinar en ratolins transgènics SBPkdlAc de 3 a 14 mesos d'edat (taula 2). Aquests ratolins transgènics eren anèmics, com ho demostra el recompte de glòbuls vermells significativament disminuït, amb l'hemoglobina i l'hematocrit que arribaven a la meitat dels nivells normals. Altres paràmetres de glòbuls vermells, com el percentatge de reticulòcits, no es van veure afectats, com s'esperava quan van ser induïts per un defecte renal. Aquests animals van morir constantment d'insuficiència renal a -5,9±2,8 mesos d'edat (n {{12} }) per a la línia transgènica 39 i en edats posteriors,-14,6±3,1 mesos (n{= 20)i-11,7 ±6,5 mesos (n=7) ,per a les línies 3 i 41,respectivament.

EFECTES DEL CISTANC: TRACTAMENT DE MALALTIES RENOLÓS

DISCUSSIÓ

A continuació informem de l'aïllament i caracterització d'un PKD1 murí (malaltia poliquística del ronyó 1)-BAC. Aquest PKD1 (malaltia poliquística del ronyó 1) es va etiquetar el gen i es van substituir els elements reguladors per dirigir l'expressió específicament als ronyons per dos successius esdeveniments de recombinació homòloga. Els ratolins transgènics produïts amb aquest nou gen SBPkdlrAG van mostrar un augment 2-a 15-plicat en l'expressió de PKD1 (malaltia renal poliquística 1) i van desenvolupar de manera reproducible alteracions morfològiques renals primerenques típiques de la PKD. La insuficiència renal és evident a l'edat mitjana i els ratolins moren prematurament per insuficiència renal. Els nostres resultats també indiquen que el mecanisme de sobreexpressió PKD1 (malaltia renal poliquística 1) responsable d'aquest fenotip està mediat per la senyalització de l'activació de c-Myc in vivo. Aquest estudi demostra que el guany de funció renal PKD1 (malaltia poliquística renal 1) murí als ronyons és suficient per produir un fenotip renal PKD.

Des de la PKD1 murina (malaltia poliquística del ronyó 1) no es duplica com en humans (27), hem identificat i aïllat directament un clon de BAC que contenia tot el PKD1 (malaltia poliquística del ronyó 1) gen. Caracterització completa de la PKD1 murina 129/Sv (malaltia poliquística del ronyó 1)-BAC. La comparació indirecta amb altres dues soques de ratolí endogàmia va confirmar la integritat del locus PKD1 (malaltia renal poliquística 1). El PKD1 (malaltia poliquística del ronyó 1)-BACinsert contenia-37 a 39 kb de seqüències aigües amunt i aigües avall del gen PKD1 (malaltia renal poliquística 1). La nostra anàlisi va demostrar que el PKD1 (malaltia poliquística del ronyó 1) en aquest BAC era un locus de tipus salvatge muri de bona fe que podria servir per a estudis posteriors.

Tot i que hi ha proves sòlides que la formació de quists en l'ADPKD (malaltia renal poliquística autosòmica dominant) pot resultar de la pèrdua de l'heterozigositat després de la inactivació somàtica del PKD1 normal (malaltia poliquística del ronyó 1) (3.21.32), també hi ha proves suggeridores d'una expressió sostinguda o fins i tot augmentada de policistina-1 a l'epiteli tubular quístic (22.29). Aquesta darrera observació planteja la qüestió de si la sobreexpressió de PKD1 (malaltia renal poliquística 1) per se és una causa proxima suficient de cistogènesi. En ratolins transgènics que porten el PKD1 humà (malaltia poliquística del ronyó 1), TSC2. RAB26. Els gens NTHL1 i SLC9A3R2, només una minoria de ratolins van desenvolupar quists i cap tenia una expressió transgènica detectable a l'edat adulta malgrat les 30 còpies del transgène (31). En aquells ratolins transgènics. va ser difícil establir un paper clar per a la sobreexpressió de PKD1 (malaltia renal poliquística 1) en la cistogènesi. El nostre model difereix, ja que de dues a nou còpies de tipus salvatge de PKD1 (malaltia renal poliquística 1) soles, sense gens contigus, es van integrar en ratolins transgènics. Atès que el gen PKD1 (malaltia renal poliquística 1) té funcions essencials en diversos òrgans o teixits, tal com es descriu per a nombrosos ratolins amb ablació del gen PKD1 (malaltia renal poliquística 1), una sobreexpressió sistèmica de PKD1 (malaltia poliquística del ronyó 1) podria provocar efectes de confusió addicionals. En conseqüència, hem abordat el paper de PKD1 (malaltia poliquística del ronyó 1)guany de funció mitjançant un enfocament que s'orienta a PKD1 (malaltia renal poliquística 1) específicament als ronyons. Per recombinació homòloga, primer hem substituït la regió reguladora aigües amunt PKD1 (malaltia renal poliquística 1) amb els elements reguladors restringits renals "SB", evitant així la disminució de l'expressió gènica que s'observa normalment per a PKD1 (malaltia poliquística del ronyó 1) a l'edat adulta, així com la regulació potencial del bucle de retroalimentació secundària (36,38). En segon lloc, hem marcat el PKD1 murí (malaltia poliquística del ronyó 1) transgen (Pkdlr) amb una mutació puntual silenciosa a l'exó 10, però no va inserir una etiqueta d'epítop per assegurar-se que es produiria una proteïna "de tipus salvatge" totalment funcional amb estructura i integritat conservades. A partir d'aquest BAC modificat, es va purificar un fragment SBPkdlrAG lluny del gen Tsc2 i del vector BAC per evitar la interferència del gen Tsc2, que també pot induir un fenotip quístic (8.20.28). així com per evitar l'efecte inhibidor de les seqüències procariotes(5).

Es van produir quatre ratolins fundadors SBPkdlrActransgènics diferents i tres línies independents amb PKD1 renal específic (malaltia poliquística del ronyó 1)-expressió millorada. És especialment sorprenent la penetració completa del fenotip en aquests ratolins transgènics. El SBPKD1 (malaltia poliquística del ronyó 1) El fundador de rAc i les línies de ratolí compartien diverses característiques fisiopatològiques en comú amb l'ADPKD (malaltia renal poliquística autosòmica dominant). Aquests inclouen el desenvolupament de quists a l'escorça, la medul·la i els glomèruls juntament amb la hiperplàsia epitelial, la fibrosi intersticial i la inflamació intersticial focal.

Com que el fenotip PKD es va observar constantment en tots els diferents ratolins fundadors transgènics i la integració del transgènic al genoma del ratolí és un fenomen aleatori, el fenotip no pot resultar de l'efecte de la posició cromosòmica sinó només de l'augment de PKD1 (malaltia poliquística del ronyó 1)expressió. De fet, es va demostrar que l'expressió del transgen PKD1 (malaltia renal poliquística 1) en totes les línies estava restringida renal. com s'ha observat anteriorment per a altres transgens regulats pels elements "SB" (36,38). A més, aquesta expressió augmentada de PKD1 (malaltia renal poliquística 1) va ser causada pel transgen i no per un PKD1 endògen indirecte (malaltia poliquística del ronyó 1) activació. Per tant, els nostres resultats proporcionen una evidència clara que el guany de funció d'un PKD1 funcional de tipus salvatge (malaltia renal poliquística 1) pot produir múltiples quists renals. És important destacar que aquestes pràctiques de SBPKD1 (malaltia renal poliquística 1) constitueixen el primer model de ratolí generat per l'única sobreexpressió de l'ortòleg del ratolí del PKD1 humà (malaltia poliquística del ronyó 1) gen.

Els ratolins SBPkdl-Ac demostren que PKD1 (malaltia poliquística del ronyó 1La sobreexpressió és un mecanisme patogenètic primari de la cistogènesi renal. És important destacar que els nivells d'expressió transgènics més alts als ronyons semblaven correlacionar-se amb la progressió i la gravetat del fenotip. També vam trobar que la sobreexpressió de PKD1 (malaltia renal poliquística 1) en el desenvolupament de SBPKD1 (malaltia poliquística del ronyó 1És probable que el fenotip )-Ac senyali l'activació de c-Myc in vivo. És concebible que aquesta activació fins i tot podria ser directa a través de la cua C-terminal de la policistina-1 sotmesa a una escissió proteolítica i una translocació nuclear (7), ja que es va demostrar que l'expressió renal millorada de c-Myc en ratolins adults indueix PKD, seria molt coherent per donar suport a c-Myc com a principal efector aigües avall de PKD1 (malaltia poliquística del ronyó 1) vies de senyalització Aquest resultat també es va correlacionar amb les nostres troballes anteriors d'augment de l'expressió de c-Myc als ronyons de tota l'ADPKD humana (malaltia renal poliquística autosòmica dominant) analitzada (22). En conjunt, aquests resultats indiquen que c-Mye és un mediador principal de PKD1 (malaltia poliquística del ronyó 1)cistogènesi.

Els nostres resultats del PKD1 (malaltia poliquística del ronyó 1El model de guany de funció, juntament amb l'haploinsuficiència i la pèrdua de funció murí PKD1 (malaltia poliquística renal 1), indiquen que qualsevol PKD1 (malaltia poliquística del ronyó 1) la desregulació podria conduir a la cistogènesi (2.19.23-26.31.40). Desequilibri greu de PKD1 (malaltia renal poliquística 1) en ratolins induït per PKD1 (malaltia poliquística del ronyó 1) l'ablació o la sobreexpressió transgènica van provocar l'aparició precoç i la progressió ràpida dels quists renals i van afectar una gran proporció de túbuls. Per contra, un PKD1 més lleu (malaltia poliquística del ronyó 1) un desequilibri com l'haploinsuficiència va provocar una progressió més lenta de la PKD amb quists més focals. L'aparent desenvolupament paradoxal d'un fenotip similar mitjançant la desregulació oposada de la policistina-1 podria explicar-se pel resultat comú, és a dir, un desequilibri relatiu de concentració de proteïnes que podria alterar la formació o la funció d'un complex multiproteic de policistina actiu. En conjunt, els nostres resultats i els d'altres investigadors argumenten que el mecanisme de formació de quists en ADPKD (malaltia renal poliquística autosòmica dominant) és probable que sorgeixi de tres mecanismes patogenètics: guany de funció, pèrdua de funció i efectes de dosificació gènica.

La novel·la SBPkdlrAc; Els ratolins constitueixen un model potent de cistogènesi renal que pot proporcionar informació important sobre la fisiopatologia de PKD, PKD1 (malaltia poliquística del ronyó 1) vies de transducció de senyals i socis que interactuen. L'estudi d'aquest model també pot conduir al desenvolupament de noves estratègies terapèutiques per restablir l'equilibri proteic normal dins del PKD1 (malaltia poliquística del ronyó 1) complex multimèric.

Cistanche tracta la malaltia renal i millora la funció renal

REFERÈNCIES

1. Blouin, MJ, H.Beachemin, A Wright, M E. De Paepe, M. Surrette, AM. guapa. B. Nakamoto, CN. Ou, G. Stamatoyannopoulos i M. Trudel. 2000. Correcció genètica de la malaltia de cèl·lules falciformes: coneixements mitjançant models de ratolins transgènics Nat. Med.17-182.

2 Boulter, C, S.Mulroy, S. Webb, S. Fleming, K. Brindle i R. Sandford. 2001.Cardiovascular, esquelètic. i defectes renals en ratolins amb una interrupció dirigida del PKD1 (malaltia poliquística del ronyó 1)gen. Proc. Natl.Acad. Ciència. EUA 9812174-12179.

3. Brasier, JL i EPHenske.1997. Pèrdua de lamalaltia poliquística del ronyó(PKD1）la regió del cromosoma 1φp13 a la cèl·lula del quist renal admet un model de pèrdua de funció per a la patogènesi del quist. J. Clin. Investig.99:194-199.

4. Burn, TC, TD Connars, W. R Dackowski, LR.Petry, TJVan Raay, JMMilhalland, M. Venet, G. Milker, R ML Hakim,G. ML Landes, KW Klinger, F. Qiam, LF. Onuchic, T. Watnick GGGermino i N. A Doggett.1995. Anàlisi de la seqüència genòmica per a lamalaltia renal poliquística autosòmica dominantEl gen prediu la presència d'una repetició rica en leucina. Hum Mol, Genet.4-575-58.

5. Chada, K, J.Magram, K. Raphael, G.Radice, E. Lacy i F.Costantini. 1985. Expressió específica d'un gen de globina estranya a la cèl·lula eritroïdal de ratolins transgènics Nature 337-380.

6. Chauvet, V, F.Qian, N. Bought, Y.Cai B.Phakdeekitacharoen, LF.Onuchi, T. Attie-Bitach, L. Guicharnaud, O.Devuryst,GG Germino i M.-C. Gubler.2002. Expressió de transcripcions i proteïnes PKDI i PKD2 en l'embrió humà i durant el desenvolupament normal del ronyó. Am. J.Pathol. 160973-983.

7.Chaurvet, V, X Tian, ​​H. Husson, DH Grimm, T. Wang T. Hiesberger, P. Igarashi, AMBennett, O.braghimov-Beskrovnaya, S.Somlo i MJ Caplan. 2004 Els estímuls mecànics indueixen el clivage i nuclear translocació de la pobeystin-1 C terminal.J. Cin.Investig 114:1433-1443.

8. Cheadle, JP, MPReeve, JR Sampson i DJ Kwiatkowski 2000. Avanç genètic molecular en l'esclerosi tuberosa. Brunzit. Genet10797-114.

9. Consorci, EPKD1993. Identificació i caracterització del gen de l'esclerosi tuberosa al cromosoma 16.Cell75:1305-1315.

10. Consorci, EPKD1994.Themalaltia poliquística del ronyó 1El gen codifica tot allò que es pot transcriure dins d'una regió duplicada del cromosoma 16, cèl·lula 7781-894.

11. Consorci, L PK D 1995.Malaltia poliquística del ronyó: l'estructura completa del PKD1 (malaltia poliquística del ronyó1) el gen i la seva proteïna. Ce 81:289-298

12. Couillard, M., R Guilkume, N Tanj, V.DAgati i M. Trudel.2002. Apoptosi induïda per c-Myc amalaltia poliquística del ronyóés independent de la interacció FasL/Fas. Càncer Res. 62:2210-2214.

13. De Paepe, M Land M Trudy 1904, Un model de glomerulopatia de cèl·lules falciformes humanes. Ronyó Int. 46:1337-1345.

14. GengL, Y, Segal B.PekseL N.Den Y. Pei, F.Carone, H G. Rennke, AM Glücksman-Kuis, MCSchneider, M Ericsson, STReeders i J.Zhou. 1996. Identificació i localització del polièster, el PKD1 (malaltia poliquística del ronyó 1) producte genètic. J. Clin. Investig. 98-2674-2682