Part 2: interaccions de l'àcid ascòrbic, 5-àcid cafeoilquínic i quercetina-3-rutinòsid en presència i absència de ferro durant el processament tèrmic i la influència en l'activitat antioxidant

Per a més informació. contacte:tina.xiang@wecistanche.com

Feu clic a l'enllaç per conèixer els detalls de la part 1:
https://www.xjcistanche.com/news/part1-interactions-of-ascorbic-acid-5-caffeo-54916714.html

3. Discussió

3.1.Relació estructura-activitat de l'àcid ascòrbic, 5-àcid cafeoilquínic i quercetina-3-rutinòsid

Un primer indicador de l'AOA, mesurat per a diferents substàncies en funció de la relació estructura-activitat, va resultar del nombre de grups funcionals. Comparant les tres substàncies analitzades, l'àcid ascòrbic va tenir l'AOA més baix, seguit de l'àcid 5-cafeoilquínic, mentre quequercetina-3-rutinosideva assolir l'AOA més alt. Csepregi et al. [14] va trobar el mateix ordre en comparar l'AOA d'aquests tres compostos. Aquest rànquing es pot explicar per la quantitat total de grups hidroxi: la quercetina-3-rutinòsid en té deu, l'àcid cafeoilquínic 5-en té cinc iàcid ascòrbicen té quatre. Perflavonoides, Burda i Oleszek van mostrar prèviament la quantitat total de grups hidroxi i el seu impacte en els mecanismes d'AOA [15]. Els grups hidroxi són particularment valuosos en les estructures d'enediol, ja que poden oxidar-se fàcilment a dicetones [8]. En les substàncies analitzades, l'estructura de l'endiol també és important per a la capacitat de formar complexos amb ions metàl·lics [16-18]. L'estructura de l'endiol es troba a les molècules de quercetina-3-rutinòsid i 5-àcid cafeoilquínic de l'anell de fenil, que també poden influir en l'AOA més fort d'aquests compostos. Estudis posteriors van trobar que l'AOA també pot estar influenciat per altres estructures de molècules. Els àcids fenòlics poden estar afectats pels grups d'àcids carboxílics, per exemple, l'àcid hidroxifenil acètic (R-CH=CH-COOH) és un grup receptor d'electrons més feble, en comparació amb l'àcid hidroxicinàmic (R-CH,-COOH), com ara com àcid cafeic en 5-àcid cafeoilquínic [19]. En els flavonoides, les aglicones tenien una AOA més alta que els glicòsids corresponents [20, 21], en el cas de la quercetina-3-rutinoside, un glucòsid, l'AOA de l'aglicona.quercetinaés en conseqüència més alt [14]. Hi ha molts grups funcionals diferents que poden influir en l'AOA i, en conseqüència, és important utilitzar diferents assajos de prova amb diferents mecanismes, com ara la transferència d'un sol electró (SET), la transferència d'àtoms d'hidrogen (HAT) i l'electró de pèrdua de protons seqüencial. transferència (SPLET) per a la detecció. Cada mecanisme i fins i tot el reactiu d'assaig utilitzat pot detectar diferents estructures de compostos bioactius [22].

3.2.Influència del processament tèrmic i la interacció d'antioxidants estructuralment diferents en l'activitat antioxidant en absència del ferro mineral

L'AOA estable durant un temps prolongat de 40 minuts de processament tèrmic indica que la degradació tèrmica és de menys importància de la que es va plantejar inicialment. A més, les dades d'HPLC van mostrar que l'{1}}àcid cafeoilquínic pur i la quercetina-3-rutinósida eren estables, amb una degradació màxima del 20 per cent, durant el processament tèrmic. Estudis anteriors van demostrar l'estabilitat de l'5-àcid cafeoilquínic fins al punt d'ebullició normal de l'aigua [23], mentre que Dawidowicz i Typek[24] van trobar nou compostos derivats, després d'escalfar 5-àcid cafeoilquínic durant 5 h a sota. reflux. Per a la concentració d'àcid ascòrbic, es va trobar una degradació després de 40 min de cocció. Els factors que influeixen, que donen lloc a la degradació de l'àcid ascòrbic sense ferro en una solució aquosa, podrien ser els valors de pH, l'exposició a la llum, l'oxidació, la temperatura i diferents concentracions [25,26]. En aquest estudi, els factors temperatura i concentració probablement van jugar el paper principal, ja que els processos oxidatius es van reduir al mínim a causa del mínim espai de gas als microtubs. És possible que la fase gasosa restant sigui encara suficient per a la degradació en condicions aeròbiques. Les diferents condicions donen lloc a diferents productes [27,28], de manera que en aquest estudi, després de 40 minuts de cocció, es van poder trobar productes d'ambdues condicions. Yuan i Chen [28] van informar que furfural, 2-àcid furoic, 3-hidroxi-2-pirona i una substància desconeguda són productes de degradació importants de l'àcid ascòrbic en una solució aquosa depenent del valor del pH. . Shinoda et al. [29,30] van trobar al suc de taronja els productes de degradació furfural, 2-àcid furoic, 5-hidroximaltol, 3-hidroxi{-2-pirona i 5-(hidroximetil )furfural. Hsu et al. [31] van analitzar l'àcid ascòrbic en solucions etanòliques i van detectar 2-àcid furoic i 3-hidroxi-2-pirona. Depenent de les condicions aeròbiques o anaeròbies, els derivats de l'àcid ascòrbic detectats (pics 3 i 4) poden ser furfural, 2-àcid furoic o 3-hidroxi-2-pirona o intermedis. L'àcid ascòrbic va disminuir en una relació dosi-resposta, i les concentracions més altes d'àcid ascòrbic van mostrar proporcions de degradació més baixes durant la cocció. L'àcid ascòrbic sembla estabilitzar-se en concentracions més altes, presumiblement a causa dels enllaços d'hidrogen i l'energia de van de Waals [32].

En les mescles binàries i ternàries, es van trobar principalment efectes addicionals sobre l'AOA. En les mescles binàries, si la substància amb més AOA augmentava la seva concentració, també augmentava l'AOA de la seva combinació. Altres estudis també van trobar efectes additius entre (a més)-catequina (200 um) amb àcid ascòrbic (50-200 mg/L)[33] i entre mescles binàries de diferents monoterpens[34]. Només en l'assaig de DPPH, es van trobar efectes antagònics en 5-àcid cafeoilquínic combinat amb quercetina-3-rutinòsida i en mescles ternàries amb concentracions de quercetina-3-rutinòsids duplicades. Això podria ser causat per l'orientació de les molècules a l'espai, especialment la quercetina-3-rutinoside, com a molècula bastant gran, i l'accessibilitat estèrica de la molècula radical DPPH [35]. En l'assaig TPC, la combinació d'àcid ascòrbic i àcid 5-cafeoilquínic va donar lloc a forts efectes antagònics en una proporció 1:2, mentre que les mescles invertides amb una proporció de 2:1 van donar lloc a forts efectes sinèrgics, superant la suma de les respectives AOA. L'àcid ascòrbic de doble concentració pot donar, en aquestes condicions, un impuls addicional a l'AOA, a causa de l'autoestabilització seguida de l'estabilització d'altres molècules, demostrada per l'àcid 5-cafeoilquínic en aquest experiment. En el suc de magrana-nectarina, entre els fenols naturals i l'àcid ascòrbic, es va trobar la mateixa interacció, mentre que en el suc de raïm es van observar efectes antagònics augmentant en augmentar la concentració d'àcid ascòrbic [36]. Aquests resultats suggereixen que les mescles d'àcid ascòrbic, 5-cafeoilquínic i quercetina-3-rutinòsida aconsegueixen el potencial d'AOA més alt quan són més potents.antioxidantsestan abundantment disponibles.

Feu clic per obtenir més informació sobre els productes

3.3. Influència del ferro mineral

The addition of iron to the samples had the most influence on changes in their AOA. Contrary to the hypothesis, based on the pro-oxidative activity of iron, the AOA increased, compared to the same substance or substance mixture without iron. Iron may act like a catalyst itself or forms metal chelates, which are effective catalysts. The changed stoichiometry of the chelates can form additional radical-scavenging metal centers [18], which explains the increased AOA. Further tests showed that reduced ferrous iron (50-100%,v/o)itself interacts with the TEAC(0.266-0.538 mol TE/mol iron), DPPH(0.210-0.495 mol TE/mol iron), and TPC(16.65-31.82g GAE/mol iron) assay reagents, while oxidized ferric iron does not (data not shown). In the presence of iron, 5-caffeoylquinic acid had the highest AOA, followed by quercetin-3-rutinoside and ascorbic acid in TEAC and DPPH assays. This may be due to the changed stoichiometry by metal chelation. The AOA ranking detected by the TPCassay stayed the same, as in the absence of iron: quercetin-3-rutinoside >5-caffeoylquinic acid>àcid ascòrbic. Tanmateix, l'addició de ferro a les mescles va influir en els resultats dels assaigs TEAC i DPPH, mentre que els assajos TPC no es van veure afectats. Per aquest motiu, és important utilitzar diferents assajos de prova amb diferents mecanismes de treball quan es treballa amb mostres riques en ferro.

Només en l'assaig DPPH, l'AOA del rutinòsid de quercetina pura, i en combinació amb àcid ascòrbic, equimolar o no equimolar amb concentracions duplicades de quercetina-3-rutinòsid, van tenir valors més baixos en presència de ferro. Boligon et al. [351 va explicar que l'assaig DPPH detecta millor els antioxidants més petits, a causa de l'accessibilitat estèrica d'aquests radicals. Presumiblement, la quercetina-3-rutinósida amb els dos costats d'unió pot crear complexos força grans amb ferro i, per tant, ser inaccessible per a l'assaig. Tal com han esmentat Kejic et al. [8], això es podria explicar per la formació de complexos supramoleculars mitjançant la coordinació d'ions metàl·lics. En combinació amb l'àcid ascòrbic, que és capaç de construir complexos de valència mixta en una proporció 1:2 [12], presumiblement, aquests complexos mixtos més grans no poden interactuar amb el radical DPPH. Contràriament als resultats d'aquest estudi, altres estudis [18,37,38] van trobar, utilitzant l'assaig DPPH, que els complexos de quercetina-3-rutinoside són antioxidants més efectius que la quercetina-3-rutinósida pura. Se sap que els complexos quelats de flavonoides i ions metàl·lics poden negar l'activitat radical dels ions metàl·lics complexats [39]. L'única diferència va ser que en aquest estudi es va utilitzar sulfat d'amoni de ferro (II), en lloc de clorur o sulfat de ferro (ⅡI), utilitzat en el treball de Symonowics i Kolandek [39].

Es van trobar efectes sinèrgics entre l'àcid ascòrbic i l'àcid 5-cafeoilquínic en presència de ferro en la proporció 2:1 i efectes antagònics en la proporció 1:2. La combinació de 5-àcid cafeoilquínic amb ferro no es va recomanar in vivo [6]. Tanmateix, aquest estudi va demostrar que, in vitro, la quantitat duplicada d'àcid ascòrbic en comparació amb l'àcid cafeoilquínic pot fins i tot tenir efectes sinèrgics sobre l'AOA. Investigacions posteriors sobre les proporcions podrien demostrar si també es poden aconseguir efectes positius in vivo.

Segons les dades d'HPLC, afegir ferro a la mostra tindrà un efecte mínim sobre la seva activitat catalítica, ja que només va disminuir la concentració d'àcid ascòrbic en mostres cuites de 0 min. A les mostres d'àcid ascòrbic cuites, a diferència de les mostres sense ferro, les concentracions més altes d'àcid ascòrbic van provocar una proporció de degradació més alta.5-L'àcid cafeovlquínic i la quercetina-3-rutinòsid necessiten els factors addicionals temperatura i temps, així com interaccions en mescles, perquè funcioni l'activitat catalítica del ferro. La quercetina-3-rutinósida, en presència de ferro, només va disminuir en les mescles binàries amb àcid ascòrbic després del processament tèrmic. Això podria ser degut al fet que el flavonoide actua com a antioxidant primari i després el radical compost resultant reacciona amb l'àcid ascòrbic, regenerant el compost original [18]. 5-L'àcid cafeoilquínic sembla ser especial, perquè protegeix la quercetina-3-rutinósida, mentre que l'àcid ascòrbic no és capaç de protegir la quercetina-3-rutinósida. Per tant, 5-àcid cafeoilquínic pot ser la molècula clau per estabilitzar el sistema en combinació amb el ferro i el processament tèrmic. Aquesta hipòtesi de l'àcid 5-cafeoilquínic com a molècula estabilitzadora es va confirmar encara més a les mescles ternàries. Aquí, la quercetina-3-rutinòsida sempre es va estabilitzar amb l'àcid 5-cafeoilquínic, de manera que fins i tot en presència d'àcid ascòrbic no es va observar cap reducció de la concentració de quercetina-3-rutinósid. En un altre estudi, 5-àcid cafeoilquínic va demostrar propietats protectores contra la degradació de les antocianines mitjançant un mecanisme de co-pigmentació [40]. De les tres substàncies van aparèixer nous productes de degradació, possiblement amb un AOA més elevat, en presència de ferro. L'àcid cafeic (pic 6) es va identificar com un 5-producte de degradació de l'àcid cafeoilquínic (dades no mostrades). Això va fer suposar que l'altra substància podria ser l'àcid quínic o un dels nou derivats possibles descrits per Dawidowicz i Typek [24]: àcid quínic;(1S,3R,4R,5R)-5-[{{24] }}(3,4-dihidroxifenil)-2-hidroxipropanoil]-1,4,5-àcid trihidroxi-ciclohexà carboxílic;(1S3R,4R,5R)-5- Àcid [3-(3,4-dihidroxifenil)-3-hidroxipropanoil]-1,4,5 trihidroxiciclohex-anecarboxílic; trans 3-àcid O-cafeoilquínic; trans 5-àcid O-cafeoilquínic; trans 4-àcid O-cafeoilquínic; àcid cafeic; àcid cis-5-O-cafeoilquínic; àcid 4,5-dicafeoilquínic. Per a la quercetina-3-rutinoside, apareix un producte de degradació al cromatograma, que no s'ha pogut identificar.

3.4. Capacitat de formar quelats amb fèrric (Fe3 plus) i ferro ferro (Fe2 plus)

En totes les mostres que contenien àcid ascòrbic, el ferro fèrric es va reduir a ferro fèrric. En aquest procés,àcid ascòrbicagafa un electró del ferro fèrric i el redueix a ferro fèrric, i es converteix en un radical. El radical inestable es converteix ràpidament en àcid deshidroascòrbic i altres productes de degradació [12]. A causa de la falta de peròxid d'hidroxi, no és possible una reacció al ferro fèrric mitjançant el cicle de Fenton. En mescles binàries cuites de 0 minuts, més del 20% del ferro es va unir en presència d'àcid ascòrbic. Se sap que l'àcid ascòrbic forma complexos amb espècies de ferro i altres ions metàl·lics per quelació mitjançant els nuclis 3-O i 2-O després del desplaçament d'hidrogen dels 3-OH i 2- Grups OH [16,17,41. També pot formar complexos de ferro-ascorbat de valència mixta [42]. Tanmateix, l'àcid ascòrbic és un agent quelant feble i, després de la cocció, només es van detectar traces de ferro lligat en mostres pures i mixtes quan hi havia àcid ascòrbic. A més, a causa del procés de cocció, l'àcid ascòrbic es descompon en productes de degradació, que semblen incapaços de quelar-se amb el ferro.

5-L'àcid cafeoilquínic és un reductor relativament pobre. El ferro fèrric es va reduir amb l'5-àcid cafeoilquínic i, amb la cocció prolongada, la reducció va augmentar.5-L'àcid cafeoilquínic es quelat amb ferro fèrric en una transferència de càrrega de lligand a metall [17].5-Àcid cafeoilquínic porta un possible costat d'unió a l'estructura 3,4 endiol de l'àcid cafeic. Això podria ser un indicador de per què l'àcid cafeic és la part bioactiva de l'àcid 5-cafeoilquínic, mentre que l'àcid quínic gairebé no té AOA [43]. Els endiols van inhibir la formació d'OH a causa de la formació d'un complex de ferro[41] en una proporció d'un a un [44,45]. Lamy et al.[46]conclouen que 5-àcid cafeoilquínic forma complexos monomèrics, mentre que Kiss et al. [47] van trobar espècies oligomèriques. Contràriament als estudis anteriors [17,48], només es van trobar restes de ferro lligat en presència d'àcid cafeoilquínic pre i post-tèrmic. Això es pot explicar per les condicions de pH neutre d'aquest estudi, mentre que altres estudis van treballar en un medi àcid, basant-se en un valor de pH de 1-2.5 a l'estómac humà [48]. Es va trobar un precipitat negre a les mostres emmagatzemades després de diverses hores, que és un indicador dels complexos 5-àcid cafeoilquínic-ferro fèrric. Per a l'anàlisi es van utilitzar mostres barrejades recentment, de manera que la formació d'aquests complexos a pH neutre requereix un període de temps més llarg. Els complexos de ferro amb àcid cafeic van mostrar poca activitat de depuració [49]. A més, no hi ha proves espectrofotomètriques d'una reacció entre l'àcid quínic i el ferro fèrric [48]. Al contrari de l'àcid 5-cafeoilquínic, a la mostra de quercetina-3-rutinòsida, es va trobar ferro lligat, fins i tot després del processament tèrmic.

La quercetina-3-rutinòsid va reduir el ferro fèrric a ferro fèrric amb un augment mínim en un temps de cocció prolongat. Aquesta activitat reductora moderada de la quercetina-3-rutinoside va ser descrita anteriorment per Mira et al. [50]. L'activitat reductora fèrrica de la quercetina-3-rutinósida es va detectar en 3-rutinòsida, 5,7,3',4'-OH [50]. La interacció moderada amb el ferro fèrric es pot explicar per un nombre menor de grups -OH, que va donar lloc a una menor densitat de càrrega negativa al costat de la quelació [50]. Els flavonoides es poden quelar amb ions metàl·lics en tres possibles costats de coordinació: (i) entre grups 5-hidroxi i 4-carbonil, (ii) entre grups 3-hidroxi i 4-carbonil, i (ii) entre grups 3', A'-hidroxi a Bring [39]. La quercetina-3-rutinòsida utilitza els costats d'unió (i) i (i)[9], i al grup 3-hidroxi, el rutinòsid està unit. Les dades espectrals fins i tot van mostrar que els ions metàl·lics només estan units al grup 3', A'-hidroxi [18]. Els quelats són més efectius amb el ferro en la seva forma bivalent [50]. En les mescles binàries, la quercetina-3-rutinósida no és capaç de formar complexos quan hi ha àcid ascòrbic, al contrari de les mescles ternàries. Si hi ha 5-àcid cafeoilquínic, es troben petites quantitats de ferro lligat. Això indica que la 5-cafeoilquínica protegeix les molècules de quercetina-3-rutinòsid en presència d'àcid ascòrbic, de manera que la quercetina-3-rutinósida pot formar complexos amb el ferro.

4. Materials i Mètodes

4.1.Químics

ABTS(2,2'-azinobis (3-ethylbenzothiazoline-6-sulfonic acid)diammonium salt)(≥98%)was obtained from Sigma-Aldrich (Steinheim, Germany), DPPH*(2,2-diphenyl-1-picrylhydrazyl) radical (95%) and Trolox(97%)were obtained from Thermo Fisher (Kandel, Germany). Folin-Ciocalteu phenol reagent was purchased from Merck(Darmstadt, Germany). HPLC grade methanol, acetonitrile(HPLC grade), glacial acetic acid (100%, p.a.), sodium acetate trihydrate (≥99.5% p.a.), potassium thiocyanate (≥98.5%, p.a., ACS),2,2'-dipyridyl (≥95%), hydrochloric acid (≥25%, p.a., ISO), gallic acid monohydrate (≥99%), potassium persulfate (≥99%), rutin trihydrate (working standard), chlorogenic acid (working standard), L-(+)-ascorbic acid (working standard), sodium carbonate(>99 per cent), sulfat d'amoni fèrric dodecahidrat i sulfat d'amoni fèrric hexahidrat es van comprar a Carl Roth (Karlsruhe, Alemanya).

4.2.Mostres

Es van preparar solucions aquoses i mescles d'estàndards autèntics d'àcid ascòrbic, {{0}}àcid cafeoilquínic i quercetina-3-rutinoside com a solucions pures i mescles en diferents proporcions. Totes les mescles binàries possibles es van fer en proporcions equimolars, i les proporcions no equimolars amb un compost es van duplicar. També es van preparar mescles ternaris en proporcions equimolars, així com en proporcions no equimolars amb un o dos compostos duplicats, respectivament. Les concentracions finals dels antioxidants van ser de 0,3 mM per a cada solució de prova. A més, tots els experiments es van repetir després de l'addició de 0,3 mM de ferro ({{10}},15 mM de ferro fèrric i 0,15 mM de ferro fèrric) en total per barreja. Les quantitats escollides d'antioxidants i ferro no es basen en nivells fisiològics o alimentaris, es basen en masses molars per estudiar l'efecte de la interacció molecular. En conseqüència, es va establir una relació equimolar entre els antioxidants totals i el ferro. Totes les mescles es van cuinar durant 0, 10, 20 i 40 min en aigua bullint, i després es van refredar amb gel per aturar el procés d'escalfament. Això es va fer per a tres rèpliques independents.

4.3.Mesures fotomètriques

Antioxidants(pur o barrejat) en absència i presència de ferro es va mesurar la seva activitat reductora total i l'activitat antioxidant en tres rèpliques tècniques independents mitjançant un mètode d'alt rendiment en 96-plaques de pou (SynergyTM HTX Multi-Mode Microplate Reader, BioTek Instruments, Winooski, VT, EUA). Es van utilitzar diferents assajos de prova, a causa dels diferents mecanismes de reacció: transferència d'un sol electró (SET) i transferència d'àtoms d'hidrogen (HAT). Tot i que l'assaig TEAC i TPC es basa en SET [17,18], per a l'assaig de prova DPPH, la literatura no està del tot clara si es basa en SET, HAT o fins i tot una combinació d'aquests dos mecanismes [{{6} }]. Un estudi recent de Foti[51] va descobrir que els fenols poden reaccionar amb DPPH mitjançant la transferència seqüencial d'electrons amb pèrdua de protons (SPLET), una combinació dels dos mecanismes. Factors, com la polaritat mitjana i el potencial d'ionització, influeixen en el mecanisme predominant.

4.3.1. Contingut fenòlic total (TPC)

El contingut total de fenol (TPC) es va determinar mitjançant el mètode Folin-Ciocalteu en una placa de 96-pou, descrit anteriorment per Bobo-Garcia et al.[52] amb algunes modificacions.

Briefly, 10 μL Folin-Ciocalteu reagents were mixed with a 50 μL sample, and afterward 100 μL Na, CO3 was added. The 96-well plate was incubated at 37 °C（±0.2°C） and with constant orbital shaking at a moderate speed (237 CPM, 4 mm) for 14 min. After a 1 min resting period, the absorbance was measured at 736 nm. Results were expressed as gallic acid equivalents (mg GAE/ mol Antioxidant), using a standard curve ranging from 5.97 to 59.7 ug gallic acid/mL(R~>0.99). El nom comú d'aquesta prova és enganyós perquè el reactiu Folin-Ciocalteu també reacciona amb substàncies no fenòliques, com ara vitamines i minerals [22]. Descriu millor l'"activitat reductora total" dels compostos bioactius.

4.3.2. Capacitat antioxidant equivalent de Trolox (TEAC)

L'activitat antioxidant es va determinar mitjançant l'assaig TEAC en una placa de 96-pou amb algunes modificacions. Es va preparar una solució de reserva amb 9,6 mg d'ABTS i 1,66 mg de persulfat de potassi omplert amb H2O fins a 25 ml i es va incubar a la foscor a temperatura ambient durant 12-16 h. A partir d'aquesta solució d'emmagatzematge, es va preparar una solució de treball TEAC, que contenia una solució d'emmagatzematge de 5 ml plena fins a 25 ml amb MeOH al 100 per cent.

Briefly, 10 μL of the sample was mixed with 150 μL of the TEAC working solution. After a 5 min incubation, the plate was shaken orbitally at a moderate speed for 1 min, followed by a 1 min resting period. The absorbance was measured at a wavelength of 734 nm. The TEAC was expressed as Trolox equivalents (mol TE/mol Antioxidant), using a standard curve ranging from 0.025-0.8 mM Trolox(R->0.98).

4.3.3. DPPH*Radical Scavenging

Elantioxidantactivity was determined using the modified DPPHmethod for 96-well plates. A DPPHworking solution with 7.88 mg DPPH filled up to 100 mL was prepared. Briefly, 20 μL of the sample was mixed with 180 ul of the DPPH working solution and incubated in the dark for 28 min at room temperature. After 1 min orbital shaking at a moderate speed and a 1 min resting time, the absorbance was measured at a wavelength of 515 nm. Results were expressed as Trolox equivalents (mol TE/mol Antioxidant), using a standard curve ranging from 0.025-0.8 mM Trolox(R2>0.98).

4.4. Sinèrgia i antagonisme

Per a l'anàlisi dels efectes sinèrgics i antagònics de l'activitat antioxidant, es va fer una comparació dels resultats obtinguts experimentalment amb els valors teòrics calculats per la suma dels efectes dels components individuals a la concentració corresponent [53]. El sinergisme descriu una interacció de dues o més substàncies de manera que l'acció combinada és més gran que la suma de cadascuna d'elles actuant per separat. Contràriament a això, l'antagonisme és un fenomen on la interacció de dues o més substàncies en combinació té un efecte global que és menor que la suma dels seus efectes individuals.

4.5.Determinació del Ferro Jònic

The colorimetric determination of ferrous and ferric iron was modified according to Niedzielski et al. 【54】 for 96-well plates. Briefly, for ferrous iron detection, 20 μL acetate buffer(90 g sodium acetate trihydrate and 48 g acetic acid glacial filled up to 200 mL)and 20 μL 2,2'dipyridyl （0.5%, m/m） and, for ferric iron detection, 20 μL hydrochloric acid （2 M） and 20 μL potassium thiocyanate （5%, m/m）were pipetted into a 200 μL sample in the 96-well plate, incubated there for 10 min at room temperature, and the absorbance was measured for ferrous iron at520nm and for ferric iron at 470nm. Results were expressed in mM ionic iron/mM total iron, using a standard curve ranging for ferrous iron from 0.024-0.214mM(R'>0.99) and for ferric iron from0.005-0.178 mM(R->0.99). La diferència entre el ferro total i el ferro iònic, la suma del ferro fèrric i el ferro fèrric, és el ferro lligat.

4.6.HPLC-DAD

Per quantificar els antioxidants àcid ascòrbic, 5-àcid cafeoilquínic i quercetina-3-rutinosid i els seus productes de degradació en els mateixos extractes utilitzats per a la fotomètrica

measurements, a Shimadzu Prominence 20 high-performance liquid chromatography (HPLC) system equipped with a refrigerated SIL-20AC HT autosampler, CTO-10AS VP column oven, DGU-20A5 degasser, LC-20 AT liquid chromatograph quaternary pump, and an SPD-M20A diode array detector (DAD) was used. As a column for separation, a Supelco Ascentis⑧Express an F5 column (150× 3.0 mm, 5 um)equipped with a Supelco Guard column （5×3.0 mm, 5 μm） and a 0.2 micron SST Frit for UltraLite was used. The column temperature was set to 30°C. UV detection was at 245 nm for ascorbic acid, 320 nm for 5-caffeoylquinic, and 360 nm for quercetin-3-rutinoside. The mobile phase consisted of Eluent A (1% acetic acid (v/o), pH 2.5) and Eluent B(100% ACN). The separation was achieved using the following gradient program: 0-2.5 min.5% B:2.5-15 min.5-20%B:15-20 min,20%B;20-22.5 min, 20-5%B;22.5-30 min,5%B.The flow rate was 0.3 mL/min, and the sample injection volume was 30 μL. Standard calibration curves for the three substances 5-caffeoylquinic （0.5-0.15 μM; R2>0.99）, ascorbic acid （0.35-0.025 uM; R2>0.99）, and quercetin-3-rutinoside（0.35-0.025 μM; R2>0,99） es van preparar. Els compostos derivats es van identificar provisionalment mitjançant l'anàlisi dels estàndards purs en presència i absència de processament pre i posttèrmic del ferro. Per tant, el nou pic ha de derivar de l'estàndard d'inserció. A més, es van mesurar les mescles seleccionades mitjançant HPLC-MS per verificar l'estructura proposada.

4.7. Anàlisi estadística

Microsoft Excel 2016 (Microsoft, Redmond, EUA) i R Statistics (versió 3.6.3, Hold-ing the Windsock, 2020) es van utilitzar per a proves de bioestadística i per presentar i dibuixar resultats de dades. Les estadístiques inferencials per avaluar i enllaçar tractaments es van dur a terme mitjançant una anàlisi de la variància a tres vies (ANOVA), una prova HSD de Tukey post hoc i la correlació de Pearson. Els paquets R utilitzats van ser ggplot2 [55], means [56] i multcomp [57].

5. Conclusions

A partir de les troballes descrites anteriorment, l'AOA de l'àcid ascòrbic, 5-àcid cafeoilquínic i quercetina-3-rutinoside va ser influenciat per la seva estructura de molècules, concentració, proporció i interaccions amb altres antioxidants i ferro. La interacció sembla especialment tenir un paper en l'AOA quan es combina l'àcid ascòrbic i l'àcid 5-cafeoilquínic. Aquí es van detectar efectes sinèrgics i antagònics. La temperatura va tenir una influència mínima sobre l'AOA, mentre que al mateix temps la temperatura va influir en l'estabilitat de tots els antioxidants en determinades mescles, especialment en presència de ferro. Només la concentració d'àcid ascòrbic va disminuir en absència de ferro amb un temps de cocció prolongat i la concentració d'àcid cafeoilquínic va disminuir només en presència de ferro, mentre que la concentració de quercetina-3-rutinòsida només va disminuir en combinació amb àcid ascòrbic en el presència de ferro. En combinació amb el ferro, l'àcid cafeoilquínic va poder protegir altres molècules de la reducció de la seva concentració per processament tèrmic.

A les plantes, les combinacions d'àcid ascòrbic, 5-àcid cafeoilquínic i quercetina-3-rutinòsid no només són possibles, sinó comuns. Per tant, aquests resultats donen coneixements bàsics sobre els processos que es produeixen durant la cocció de les verdures. Les matrius alimentàries són més complexes i contenen infinitat de compostos bioactius, com ara enzims, altres minerals o àcids, que canvien les condicions de reacció o són reactius. Aquestes interaccions complexes estan molt més enllà de l'abast d'aquest estudi i de les concentracions i interaccions beneficiosesantioxidantsen verdures cuites s'han de tractar en el futur.

Referències

1. Mellor, DD; Naumovski, N. Efecte del cacau en la diabetis: el potencial del pàncrees i el fetge com a òrgans objectiu clau, més que un efecte antioxidant? Int. J. Ciència alimentària. Tecnol. 2016, 51, 829–841. [Ref creuat]

2. Crozier, A.; Jaganath, IB; Clifford, MN Fenols, polifenols i tanins: una visió general. Metabòlits secundaris a la planta: aparició, estructura i paper en la dieta humana; Crozier, A., Clifford, MN, Ashihara, H., Eds.; Blackwell Publishing: Hoboken, NJ, EUA, 2006; pàgines 1–24. ISBN 1-4051-2509-8.

3. Miller, D. Els metalls de transició com a catalitzadors de reaccions d'"autoxidació". Radic Lliure. Biol. Med. 1990, 8, 95–108. [Ref creuat]

4. Buchner, N.; Krumbein, A.; Rohn, S.; Kroh, LW Efecte del processament tèrmic sobre els flavonols, la rutina i la quercetina. Comunicació Ràpida. Espectre de masses. 2006, 20, 3229–3235. [Ref creuat]

5. Layrisse, M.; García-Casal, MN; Solano, L.; Baró, MA; Arguello, F.; Llovera, D.; Ramírez, J.; Leets, I.; Tropper, E. Biodisponibilitat del ferro en humans a partir d'esmorzars enriquits amb quelat de ferro bis-glicina, fitats i polifenols. J. Nutr. 2000, 130, 2195–2199. [CrossRef] [PubMed]

6. Hurrell, RF; Reddy, M.; Cook, JD Inhibició de l'absorció de ferro no hemem en l'home per begudes que contenen polifenòlics. Br. J. Nutr. 1999, 81, 289–295. [CrossRef] [PubMed]

7. Kostyuk, VA; Potapovich, AI Efectes antiradicals i quelants en la protecció de flavonoides contra lesions cel·lulars induïdes per sílice. Arc. Bioquímica. Biofísica. 1998, 355, 43–48. [CrossRef] [PubMed]

8. Kejík, Z.; Kaplánek, R.; Masaˇrík, M.; Babula, P.; Matkowski, A.; Filipenský, P.; Veselá, K.; Gburek, J.; Sykora, D.; Martásek, P.; et al. Complexos de ferro de flavonoides-Capacitat antioxidant i més enllà. Int. J. Mol. Ciència. 2021, 22, 646. [CrossRef]

9. Latos-Brozio, M.; Masek, A. Anàlisi de relacions estructura-activitat de polifenols monomèrics i polimèrics (quercetina, rutina i catequina) obtinguts per diversos mètodes de polimerització. Chem. Biodiversos. 2019, 16, e1900426. [CrossRef] [PubMed]

10. Gullón, B.; Lú-Chau, TA; Moreira, MT; Lema, JM; Eibes, G. Rutin: una revisió sobre els mètodes d'extracció, identificació i purificació, activitats biològiques i enfocaments per millorar la seva biodisponibilitat. Tendències Alimentació Ciència. Tecnol. 2017, 67, 220–235. [Ref creuat]