Part 2: la molècula de lesió renal-1 és un receptor potencial per al SARS-CoV-2

Per a més informació. contactetina.xiang@wecistanche.com

Manifestacions clíniques del coronavirus

1. El període d'incubació és llarg, i els principals símptomes són febre, cansament, mal de coll i tos. La febre pot ser febre alta, febre moderada o febre baixa;

2. Els nadons i la gent gran no són típics i sovint s'acompanyen de sibilàncies i dispnea. En casos greus, es poden produir danys en diversos sistemes;

3. La tos seca en la fase inicial és principalment paroxística i severa, semblant a la tos ferina, que afecta el son i les activitats; en l'etapa posterior, la tos és d'esput, l'esput és viciós, de vegades conté una petita quantitat de sang i algunes s'acompanyen de sibilàncies;

4. Alguns pacients presenten símptomes lleus i poden no tenir febre. La majoria dels pacients tenen un bon pronòstic, i un petit nombre de pacients estan greument malalts o fins i tot moren;

5. Síndrome de dificultat respiratòria aguda, xoc sèptic, acidosi metabòlica refractària i disfunció de la coagulació.

Com prevenir el nou coronavirus, millorar la pròpia immunitat és el mitjà més eficaç perquè les persones lluitin contra el virus. Cistanche, que s'ha utilitzat com a tresor nutritiu des de l'antiguitat, es coneix com "desertginseng" i és el rei de reforçar la immunitat. Cistanche - El rei de reforçar la immunitat

La investigació mèdica moderna ha demostrat que, a més de les funcions de nodrir i enfortir el cos, Cistanche té efectes curatius significatius en la prevenció de tumors, anti-envelliment, anti-arítmia, inhibició de l'apoptosi i millora de la immunitat. favor.

Elglucòsids totals de Cistanchesón els components actius del ginseng per regular la funció immune, que pot millorar la funció immune no només per a persones normals, sinó també per a persones amb funció immune baixa.

L'observació clínica ha confirmat que Cistanche té un cert efecte curatiu sobre els tumors malignes i té l'efecte evident d'augmentar els leucòcits. Prendre ginseng durant la radioteràpia i la quimioteràpia pot reduir els efectes tòxics i secundaris de la radioteràpia i la quimioteràpia, accelerar la reparació del teixit danyat i prevenir la leucopènia;

Discussió

Per lluitar contra elpandèmia COVID-19, una comprensió profunda de comSARS-CoV-2envaeix cèl·lules humanes està justificat. Els estudis han indicat la infecció directa del SARS-CoV-2 alronyóa més del pulmó (Braun et al., 2020; Farkash et al., 2020). Tanmateix, l'ACE2 segueix sent l'únic receptor ben reconegut que pot mediar aquesta invasió. A més, el tropisme renal del SARS-CoV-2 i associatlesió renalsembla inexplicable pel nivell relativament reduït d'ACE2 després de la invasió viral (Kuba et al., 2005). Aquí, el nostre estudi suggereix que KIM1, un biomarcador dràsticament regulat per a lesions renals (Yang et al., 2015), media la invasió renal del SARS-CoV-2 com a receptor.

També vam trobar que SARS-CoV-2-RBD s'uneix a KIM1 amb una afinitat més gran que la de SARS-CoV-RBD i MERS-COV-RBD, que probablement és la base del contagi més fort del SARS-CoV-2 (Rabaan et al, 2020); per tant, val la pena revisar la infecció renal i els papers de KIM1 en aquestes malalties respiratòries greus. En particular, els nostres resultats suggereixen diferents llocs d'unió de KIM1 i ACE2 a RBD viral, per la qual cosa val la pena investigar si i com KIM1 i ACE2 medien la invasió del SARS-CoV-2 en aquests òrgans. A més, atès que KIM1 s'endocita mitjançant vies dependents de la clatrina (Zhao et al., 2016), també seria interessant explorar més el procés dependent de KIM1-després de la unió viral a la membrana cel·lular.

L'ACE2 és el receptor més ben estudiat del SARS-CoV-2, però no és un objectiu terapèutic ideal per a la COVID-19, ja que s'expressa àmpliament en múltiples òrgans i juga un paper crucial en la regulació de la pressió arterial. i prevenir la lesió cardíaca/renal (Imai et al., 2005; Li et al., 2020d). En canvi, KIM1 té una associació més forta amb la funció renal i només s'expressa molt despréslesió renal(Kondratowicz et al, 2011; Yuan et al, 2015; Costafreda i Kaplan, 2018), cosa que el converteix en un objectiu terapèutic més específic i potser també més segur per als pacients amb COVID-19 amb malalties renals.

En resum, les nostres dades suggereixen un paper crucial de KIM1 en el tropisme renal del SARS-CoV-2 com a receptor potencial del SARS-CoV-2. Aquí, proposem un model de "cicle viciós" mediat per KIM1 i ACE2 (figura 5G), que pot explicar el tropisme renal del SARS-CoV-2 en pacients amb COVID-19. Durant l'etapa inicial de la invasió del SARS-CoV-2, el nivell fisiològic més alt (figura suplementària S1) i l'afinitat d'unió (taula suplementària S1) fan que l'ACE2 sigui l'objectiu principal, que no és específic del ronyó. Tanmateix, després de l'aparició de l'AKl induït pel virus, el KIM1 dràsticament regulat afavoreix ràpidament una infecció viral secundària mediada per KIM1 i ACE2, que és més específica del ronyó i, en conseqüència, agreuja el dany renal en un cicle viciós (figura 5G). Els enfocaments que poden trencar la interacció entre SARS-CoV-2 i KIM1, inclosos els anticossos anti-KIM1, els inhibidors de molècules petites i els pèptids antagonistes derivats de KIM1-, poden aportar llum sobre COVID-19 tractament.

Materials i mètodes

Materials

Recombinant SARS-CoV-2-RBD (T80302) was obtained from Genscript. Antagonist peptide 1 (AP1, SCSLFTCQNGIV, purity >95%) and antagonist peptide 2 (AP2, SCSLFTCQNGGGWF, purity >95 per cent) van ser sintetitzats químicament per Genscript. L'anticossos anti-ratolí-lgG (p/n 18-8816-33) i l'anticòs anti-conill-lgG (p/n 18-8817-33) es van obtenir de Rockland. IgG amb SureBeads" Les perles magnètiques de proteïna G (J2112LB-02) es van comprar a Bio-Rad. DAPI (D9542) era de Sigma. Alex Flour 594 etiquetada amb fal·loidina (C2205S) era de Beyotimes. Anticossos contra KIM1 (NBP{{{{{ 15}}, Novus Biologicals), Flag (F1804, Sigma), HA (H6908, Sigma) i ACE2 (2115-1-AP, Proteintech).

Adquisició i anàlisi de perfils d'expressió de KIM1 i ACE2

Per obtenir els perfils complets de transcriptoma i proteïnes de KIM1 i ACE2 per a teixits humans, vam recollir i analitzar les dades del transcriptoma i els perfils de proteïnes basats en immunohistoquímica de Human Protein Atlas (HPA, https://www.proteinatlas.org), que va mostrar el expressió i localització de proteïnes humanes a través de teixits i òrgans, basada en la seqüenciació profunda d'ARN (ARN-seq) de 37 teixits normals i immunohistoquímica en microarrays de teixits que contenen 44 tipus de teixits (Uhlen et al., 2015). El teixit HPA RNA-seq del gen codificador de proteïnes es va registrar com a transcripcions mitjanes de codificació de proteïnes per milió (pTPM), corresponents als valors mitjans de les mostres de cada teixit. Els nivells d'expressió de proteïnes basats en histologia es van analitzar manualment en quatre nivells (no detectat, baix, mitjà i alt). A la figura suplementària S1, s'enumeren els 10 nivells transcripcionals tissulars principals i els nivells d'expressió de proteïnes basats en la histologia de KIM1 i ACE2, respectivament, i es resumeix el perfil d'expressió superposat de KIM1 i ACE2.

Acoblament molecular i simulacions dinàmiques

Els acoblaments es van realitzar mitjançant Z-Dock (http://zdock.umassmed.edu/). Estructures cristal·lines de SARS-CoV-RBD (PBD ID 2AJF), ​​SARS-CoV-2-RBD (PDB ID 6MOJ), MERS-COV-RBD (PDB ID 4L3N), ACE2 (PDB ID 1R42) i KIM1 Ig El domini V (PDB ID 5DZO) es va utilitzar per buscar models d'enllaç potencials. Els complexos de proteïnes millor puntuats es van seleccionar per a les següents simulacions de dinàmica molecular, que van ser realitzades pel servidor Desmond i analitzades per Pymol2.3 i Maestro11.8.012. El diagrama de simulacions de dinàmica de 50 ns es va aplicar per estudiar els paràmetres dinàmics dels complexos de proteïnes. . HawkDock va calcular l'energia lliure d'unió MM-GBSA (Misini lgnjatovic et al., 2016).

Desviació quadrada mitjana (RMSD) i fluctuació quadrada mitjana (RMSF)

Es va utilitzar RMSD per estimar el canvi mitjà en el desplaçament d'una selecció d'àtoms per a un marc particular tal com es descriu (Li et al., 2011). RMSF es va realitzar per estudiar els canvis de desplaçament a la cadena de proteïnes (Li et al., 2011) .

Models de ratolí AKI i qPCR

La lesió I/R es va realitzar en ratolins C57BL/6 tal com hem descrit anteriorment (Chen et al, 2015, 2017). Per a l'IRA induïda per cisplatí, es va injectar cisplatí de 30 mg/kg de pes corporal per via intraperitoneal a ratolins mascles 8-d'una setmana, i els ratolins es van sacrificar 3 dies després. Es van recollir mostres de sang i ronyó per a una anàlisi posterior, amb n=4 per a cada grup d'animals experimentals. L'ARN total es va aïllar dels ronyons mitjançant RNAiso Plus (TaKaRa) i es va transcriure inversament a ADNc mitjançant el sistema de síntesi de primera cadena M-MLV (Invitrogen). L'abundància de transcripcions de gens específics es va avaluar mitjançant qPCR. Es proporcionen els primers utilitzats en l'estudi (taula complementària S4).

Construeix

Plàsmids d'expressió de mamífers per a KIM1 humà, KIM1 Ig V (resídus KIM1 aa 20-127), KIM1 △lg V (KIM1 truncat sense residus aa 20-127), KIM1-CFP, KIM1 lg V-CFP, ACE2, SARS-CoV-2-RBD(SARS-CoV-2-S residus aa 319-541), SARS-CoV-2-S, SARS-CoV{{20 }}RBD-YFP i TIM4-YFP es van construir. Els productes d'amplificació per PCR dels fragments d'ADNc corresponents es van clonar en un vector basat en el promotor pRK que contenia l'etiqueta HA o FLAG. Els plasmidis-2-relacionats amb el SARS-CoV van ser regals amables del doctor PHWang de la Universitat de Shandong.

Cultiu cel·lular i transfecció

La línia de cèl·lules tubulars de ronyó humà HK-2 (obtinguda del Centre de col·lecció de cultius de tipus de la Xina) es va cultivar en medis DMEM/F12 (Hyclone) que contenia 17,5 mM de glucosa i un 10 per cent de sèrum boví fetal. Per avaluar l'impacte del SARS-CoV-2 a les cèl·lules, les cèl·lules HK-2 es van transfectar amb plasmidis SARS-CoV{-2-S i SARS-CoV{-2-RBD i després es van recollir per a detecció posterior.

Co-IP

Les cèl·lules HK-2/HEK293T indicades (1 × 10) es van lisar en 1 ml de tampó pre-lisi (25 mM Tris-HCl, pH 7,4, 150 mM NaCl, 1 per cent de NP-40, 1 mM EDTA, 5 percentatge de glicerol), que està formulat per a assajos de pulldown i IP i com a tampó de rentat per a comptes. Per IP, el lisat cel·lular es va immunoprecipitar amb l'anticòs indicat o el gG respectiu amb les perles magnètiques SureBeadsTM Protein G durant la nit a 4ºC. Després de rentar-se amb un tampó de pre-lisi que contenia 500 mM de NaCl, les perles es van bullir en un tampó de càrrega i es van sotmetre a immunoblot (Wan et al., 2017).

assaig FRET

La interacció intracel·lular entre KIM1 i SARS-CoV-2-RBD es va detectar mitjançant un assaig estàndard basat en FRET (Karpova i McNally, 2006) mitjançant KIM1-CFP i SARS-CoV-2-RBD-YFP . Breument, els plasmidis d'expressió de mamífers que expressaven KIM1-CFP o KIM1 Alg V-CFP es van cotransfectar amb SARS-CoV-2-RBD-YFP en cèl·lules T-293. Per a la detecció basada en espectrofotòmetres de fluorescència, les cèl·lules es van recollir i lisar 24 hores després de la transfecció, i el lisat es va detectar mitjançant un espectrofotòmetre de fluorescència F-2700 (Hitachi) mitjançant exploració de longitud d'ona (500-600nm) i exploració de temps (435). /527 nm, excitació/emissió). Per a la detecció basada en confocal, es van fotografiar cèl·lules amb un microscopi confocal Leica TCS SP8 sota una lent objectiu d'alta potència (40×) (canal CFP: 435/485 nm, excitació/emissió; canal YFP). : 485/527 nm, excitació/emissió; canal FRET: 435/527 nm, excitació/emissió) (Li et al, 2020b). La cotransfecció de CFP i YFP no conjugada es va incloure com a control negatiu tal com es descriu (Karpova i McNally, 2006). La interacció entre KIM1 i el seu lligand TIM4 es va detectar mitjançant un assaig FRET com a control positiu (Rong et al, 2011).

CRISPR-Cas9-va mediat el nocaut de KIM1

Els protocols basats en CRISPR-Cas9-per a l'enginyeria del genoma es van utilitzar tal com es descriu (Zhang et al., 2017). Es proporcionen seqüències diana d'ARN guia per a KIM1 (taula suplementària S4).

Etiquetatge FITC i microscòpia confocal

L'etiqueta FITC es va realitzar tal com hem descrit anteriorment (Li et al, 2020b; Zhang et al., 2020). Breument, el SARS-CoV-2-RBD es va incubar amb FITC (proporció molar 1:5) durant la nit i després es va afegir NHCl 5 mM per aturar la reacció i apagar el FITC no reaccionat. La solució es va dialitzar dues vegades i es va liofilitzar per a un ús posterior.

Les cèl·lules HEK293T (5 × 109) o les cèl·lules HK-2 (1 × 107) es van incubar amb FITC lliure o FITC-SARS-CoV-2-RBD (100 ug/ml per a 2). Per als assajos d'internalització basats en pèptids, AP1 o AP2 (50 μM) es va afegir conjuntament amb FITC-SARS-CoV-2-RBD (100 ug/m). Després de fixar-se amb un 4 per cent (p/v) de formaldehid, les membranes cel·lulars es van tacar amb fal·loidina marcada amb Alex Flour 594 (2 ug/ml), i els nuclis es van tacar amb DAPI (1 ug/m) i després es van fer imatges amb un Leica TCS. Microscopi confocal SP8. Per a cada grup, es van incloure a l'avaluació almenys 100 cèl·lules de cinc camps sota una lent objectiu d'alta potència (64 ×). Es van presentar imatges representatives. La quantificació de les imatges es va dur a terme per ImageJ1.8.0.

Assajos de viabilitat cel·lular

Les cèl·lules es van xapar a 3000-4000 cèl·lules per pou en plaques de 96-pous. A la confluència del 80 per cent, les cèl·lules incubades amb SARS-CoV -2-RBD （100 ug/ml） es van tractar amb o sense AP1 o AP2 (10,50,100 μM). Després d'això, es van afegir 10 ul MTT (5 mg/ml a cadascun).

bé durant 4 h, es va eliminar el medi i es va afegir DMSO. L'absorbància mesurada a 490 nm es va normalitzar al grup de control respectiu.

Anàlisi estadística

Les dades es van expressar com a mitjana ± SD. Les diferències significatives es van avaluar mitjançant una prova de Student de dues cues. Un valor P de dues cares<0.05 was="" considered="" statistically="" significant.="" analyses="" were="" performed="" with="" excel="" 2017="" and="" graphpad="" prism="">