Propietats fotoprotectores i antimelanogèniques de diferents extractes de Kadsura Coccinea

Contacte:joanna.jia@wecistanche.com/ WhatsApp: 008618081934791

La radiació solar ultraviolada (UV), caracteritzada per UVA (320–400 nm), UVB (280–320 nm) i UVC (100–280 nm), és el factor ambiental més crític que causa càncer de pell i fotoenvelliment derivat de la citotoxicitat, la genotoxicitat. i fototoxicitat. Concretament, la radiació UVA i UVB representen més del 95% i el 3% de la irradiació UV diària, respectivament [8]. La irradiació UVA i UVB pot induir espècies reactives d'oxigen (ROS) indirectament o directament penetrant les capes epidèrmiques i/o dèrmiques de la pell, provocant danys oxidatius i mort cel·lular. En les últimes dècades, la radiació UV s'ha convertit en un problema greu per a la salut de la pell i encara s'està estenent de manera perillosa per tot el món [9–11]. La irradiació UV és un estimulant directe i consistent dels queratinòcits, que representen aproximadament el 95 per cent de la massa cel·lular epidèrmica de la pell. Els queratinòcits actuen com a primera barrera contra els perills microbians, químics i físics i ajuden a defensar-se de la radiació UVA i UVB. Quan els queratinòcits estan exposats a UVA i UVB, es generen ROS intracel·lulars, provocant així l'apoptosi [12–14].

Els melanòcits són els responsables de la producció i quantitat de pigments de melanina, que són actors importants en la defensa biològica de l'epidermis de la pell; la seva desregulació pot provocar hiperpigmentació o trastorns d'hipopigmentació [15,16]. Els melanòcits es distribueixen a l'estrat basal de l'epidermis de la pell, que també es veu afectat per l'exposició a la llum solar, les espècies reactives d'oxigen (ROS) i les hormones estimulants dels melanòcits (-MSH) [17,18]. La tirosinasa, membre de la família de proteïnes de coure tipus-3, és una metaloproteïna conservada evolutivament que juga un paper crucial en la melanogènesi i en les activitats de la monofenol monooxigenasa, catecolasa i difenols. La regulació a la baixa de la tirosinasa, la proteïna relacionada amb la tirosinasa-1 (TRP-1) i la proteïna relacionada amb la tirosinasa-2 (TRP{-2) tenen efectes catalítics diferents. TRP-1 és una 5,6-dihidroxiindol-2-oxidasa d'àcid carboxílic, i TRP-2 és una DOPAcrom tautomerasa [19,20]. A més, el factor de transcripció relacionat amb la mioftalmosi (MITF) i la proteïna d'unió a l'element sensible a cAMP (CREB) són factors de transcripció que regulen principalment la melanogènesi i codifiquen informació sobre el mode i la intensitat de l'estimulació [17,21]. Diversos estudis han afirmat que les vies MITF i CREB regulen la melanogènesi. MITF és un factor clau en la transcripció d'enzims relacionats amb la melanogènesi i el regulador central de la melanogènesi. -MSH condueix a l'expressió de MITF mitjançant un mecanisme de senyalització que implica la proteïna d'unió relacionada amb cAMP (CREB). Aleshores, MITF entra al nucli amb la seqüència de caixa M (AGTCATGTGCT) per promoure la transcripció de gens i enzims melanogènics específics. També se sap que el CREB fosforilat és estimulat per -MSH, que s'uneix a l'element de consens CRE al promotor Mitf per regular la transcripció de Mitf [21–24].

En aquest estudi, es van comparar exhaustivament extractes d'arrel KC (KCR), tija (KCS), fulla (KCL) i fruita (KCF) i es van realitzar múltiples avaluacions de les seves propietats fotoprotectores i anti-melanogèniques.

2. Materials i Mètodes

2.1. Preparació d'extractes de KC

Una planta KC 15 de tres anys es va cultivar en un test de plàstic de 9 L al campus de Miryang de la Universitat Nacional de Pusan. KC va ser identificat pel professor Young Whan Choi, l'autor d'aquest estudi. Aquestes mostres es van dipositar com a exemplars de val (número d'adhesió KC-PDRL-1) a l'herbari del Departament de Biociència Hortícola, Col·legi de Recursos Naturals i Ciències de la Vida, Universitat Nacional de Pusan. Les plantes es van regar suficientment amb una solució nutritiva completa amb un nivell de conductivitat d'1.0 mS·cm−1 i que contenia els elements següents (en me·L−1): NO3-N, 16; NH4-N, 1,34; P, 4; K, 8; Ca, 8; i S, 4. La bata KC al port es va collir el desembre de 2020 classificant arrels, tiges, fulles i fruits (figura 1A). Les mostres collides es van liofilitzar immediatament en un assecador de congelació i es van emmagatzemar en bosses de vinil a 20 ◦ C fins a l'anàlisi. Les arrels, tiges, fulles i fruits secs de KC (20 g) es van triturar fins obtenir una pols fina i es van extreure a temperatura ambient amb alcohol etílic. Breument, la filtració i l'evaporació d'extractes d'EtOH de KC es van realitzar a pressió reduïda a 45 ◦ C seguida de liofilització. Finalment, l'extracte sòlid (50 mg/mL) es va dissoldre en dimetilsulfòxid (DMSO) per a més experiments.

cistancheherba epimedium sagittatumextracte

2.2. Continguts totals de polifenòlics i flavonoides dels extractes de KC

Tal com es va descriure anteriorment [25], el contingut total de polifenols i flavonoides dels extractes d'arrel, tija, fulla i fruita de KC es van mesurar mitjançant els mètodes colorimètrics Folin-Ciocalteu (polifenol total) i clorur d'alumini (flavonoide). L'absorbància es va mesurar a 700 nm (polifenol total) mitjançant Ultrospec 6300 Pro (GE Healthcare Life Sciences, Buckinghamshire, Regne Unit) i a 510 nm (flavonoide) mitjançant el lector de plaques VICTOR Multilabel (Perkin-Elmer, Waltham, MA, EUA) .

Es van construir corbes estàndard utilitzant àcid gàlic (polifenol total) i quercetina (flavonoide) com a estàndards, i els resultats es van expressar com a equivalents d'àcid gàlic per gram (GAE/g) d'extractes d'arrel, tija, fulla i fruita de KC i equivalent de quercetina. per gram (QE/g) d'extractes d'arrel, tija, fulla i fruita de KC, respectivament.

2.3. Assaig DPPH i ABTS

Les activitats d'eliminació de radicals DPPH i ABTS d'extractes d'arrel, tija, fulla i fruita de KC ({{0}},5 mg/mL) es van mesurar segons un mètode descrit anteriorment [25] amb lleugeres modificacions. Els extractes d'arrel, tija, fulla i fruita de KC (0,5 mg/mL) es van barrejar amb una solució de DPPH (60 µM) en microplaques. Després de sacsejar les mostres vigorosament, es van mantenir a la foscor a 25 ◦ C durant 0,5 h. Es van preparar solucions stock de 7 mM ABTS i 2, 6 de persulfat de potassi en aigua destil·lada a temperatura ambient a la foscor durant 18 hores. Els extractes d'arrel, tija, fulla i fruita de KC (0,5 mg/ml) es van barrejar amb la solució de treball i després es van deixar reposar durant 0,5 h a temperatura ambient a la foscor. L'absorbància de les mescles de mostres es va controlar a 510 nm (DPPH) o 734 nm (ABTS).

2.4. Cultiu cel·lular

Els queratinòcits adherits (HaCaT) i els melanòcits adherits (B16F10) es van inocular en una solució de cultiu DMEM (Invitrogen Corporation, Carlsbad, CA, EUA) que contenia un 10 per cent de FBS (Invitrogen Corporation, Carlsbad, CA, EUA) i un 1 per cent de penicil·lina / estreptomicina (Invitrogen). Corporation, Carlsbad, CA, EUA) i cultivat a 37 ◦C amb un 5% de CO2. El creixement de cèl·lules HaCaT i B16F10 adherides es va observar regularment i el medi es va canviar cada dos o tres dies. Les cèl·lules de la fase de creixement logarítmica es van utilitzar per a experiments posteriors.

2.5. Irradiació UVA i UVB

Els queratinòcits van ser exposats a la irradiació UVA o UVB (Bio-Link BLX-365, Villber-Lourmat, Eberhardzell, Alemanya) amb tubs 5 8 W que emeten la major part de la seva energia en un pic d'emissió a 365 nm ( UVA) o 312 nm (UVB). Les dosis d'irradiació UVA eren de 20 J/cm2 i les dosis d'irradiació UVB de 50 mJ/cm2.

2.6. Mesura de la viabilitat cel·lular i la citotoxicitat mitjançant l'anàlisi de CCK-8 i LDH

Per a l'anàlisi de la viabilitat cel·lular, es va afegir una solució de Cell Counting Kit-8 (CCK-8) del kit d'assaig CCK-8 (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, EUA) als queratinòcits HaCaT i suspensions de cèl·lules de melanoma B16F10 segons les instruccions del fabricant i incubades a 37 ◦ C durant 4 h. Breument, es van sembrar cèl·lules 2 104 a cada pou d'una placa de 24-pou i es van incubar amb un 5% de CO a 37 ◦C durant 24 h. Breument, es van sembrar 2 104 cèl·lules a cada pou d'una placa de 24-pou i es van incubar amb un 5% de CO a 37 ◦ C durant 24 h. Després de 24 h d'incubació, es va afegir el reactiu CCK-8 a cada pou i les cèl·lules es van incubar més durant 4 h. Es va utilitzar un kit de detecció de citotoxicitat (Roche Applied Science, Suïssa) per determinar l'alliberament de lactat deshidrogenasa extracel·lular (LDH) al medi de cultiu de queratinòcits HaCaT. L'absorbància es va analitzar a 450 nm (CCK-8) i 490 nm (LDH) mitjançant un lector de plaques VICTOR Multilabel.

2.7. Avaluació de la producció intracel·lular de ROS en queratinòcits

Els nivells de ROS intracel·lulars es van analitzar mitjançant {{0}}(i-6)-clorometil-2′,7′-diclorur-diacetat d'hidrofluoresceïna acetil èster (CM-H2DCFDA; Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, EUA). Tots els procediments es van realitzar segons les instruccions del fabricant. En resum, després del tractament amb altres extractes parcials amb KC (0,5 mg/mL), els queratinòcits (HaCaT) es van rentar amb solució salina tamponada amb fosfat (PBS) i es van incubar amb CM-H2DCFDA (5 µM) durant 0,5 h en la foscor. A continuació, es va visualitzar la generació de ROS intracel·lular mitjançant un microscopi de fluorescència Carl Zeiss; La intensitat de fluorescència es va mesurar a partir d'un colorant fluorescent (CM-H2DCFDA) mitjançant un citòmetre de flux (Fit NXT Flow Cyto, Thermo Fisher Scientific, Pasadena, CA, EUA).

2.8. Anàlisi de l'apoptosi

Després de l'exposició i el tractament, els queratinòcits HaCaT es van tripsinitzar i es van centrifugar. Posteriorment, es va avaluar l'apoptosi de les cèl·lules obtingudes mitjançant el kit Annexin V/Dead CellApoptosis d'isotiocianat de fluoresceïna (FITC) (Invitrogen Life Technologies, Carls-bad, CA, EUA) segons les instruccions del fabricant. Breument, els queratinòcits es van esbandir dues vegades amb PBS i es van obtenir queratinòcits del tampó d'unió a l'annexina i es van barrejar amb una solució de treball FITC/Annexina V (component A) i iodur de propidi (PI). Després de la incubació a temperatura ambient durant 15 minuts a la foscor, es va mesurar l'apoptosi dels queratinòcits i es va calcular el percentatge de cèl·lules apoptòtiques mitjançant un citòmetre de flux (Fit NXT Flow Cyto, Thermo Fisher Scientific, Pasadena, CA, EUA). Es van detectar senyals per als canals FL1 (FITC/Nexin V) i FL3 (PI), i es van establir la tinció de marcadors de quadrant i els diagrames de punts de les cèl·lules tacades.

2.9. Anàlisi del contingut de melanina intracel·lular i de l'activitat de la tirosinasa

El contingut intracel·lular de melanina i els assajos d'activitat de la tirosinasa es van mesurar explicant on es diferenciava el procediment lleugerament modificat [24]. Els melanòcits es van tractar amb una concentració final de 0,5 µM -MSH i els 0,5 mg/mL KC altres extractes parcials durant 48 h. Els pellets de melanòcits es van lisar amb NaOH 1 N en 1 0 per cent de DMSO a 80 ◦ C durant 1 h. El contingut relatiu de melanina es va determinar mesurant l'absorbància a 475 nm mitjançant un lector de plaques VICTORMultilabel. L'activitat de la tirosinasa intracel·lular es va determinar mesurant la taxa de producció de dopacrom mitjançant L-DOPA. Els melanòcits es van rentar amb PBS fred amb gel i es van lisar en PBS que contenia un 1% (p/v) de Tritó X-100. El substrat de la tirosinasa L-DOPA (2 mg/mL) es va preparar en el mateix tampó de lisi de fosfat. Cada extracte es va col·locar en una placa de 96-pous i es va iniciar l'anàlisi enzimàtic afegint una solució de L-DOPA. Després d'una incubació durant 1 h, es va mesurar l'absorbància a 475 nm mitjançant un lector de plaques VICTOR Multilabel per analitzar la producció de dopacrom. El valor de cada mesura es va expressar com a percentatge del control. L'arbutina (A, 0,5 mg/ml) es va utilitzar com a control positiu.

Cistancheequinacòsidés un inhibidor de la tirosinasa.

2.10. PCR quantitativa en temps real

L'ARN total es va aïllar de cada grup de melanòcits mitjançant el RNeasy Mini Kit (QIAGEN, Hilden, Alemanya). La transcripció inversa es va realitzar mitjançant el kit de transcripció inversa d'ADNc d'alta capacitat (Thermo Fisher Scientific, Miami, OK, EUA), segons les instruccions del fabricant, per obtenir la primera cadena d'ADNc. A continuació, les cadenes es van utilitzar com a plantilles per a la PCR quantitativa en temps real (qRT-PCR) mitjançant un instrument Bio-Rad Chromo4TM i una mescla mestra de qPCR SYBR Green (Thermo Fisher Scientific, Miami, OK, EUA). La PCR es va realitzar sota desnaturalització prèvia a 95 ◦ C durant 5 min, desnaturalització a 95 ◦ C durant 15 s i recuit a 55-58 ◦ C durant 30 s. L'ARNm de GAPDH es va utilitzar com a referència interna per a l'ARNm de tirosinasa, TRP-1 i TRP-2. El valor relatiu de l'expressió del gen objectiu=2−∆∆CT. Les seqüències de cebador eren les següents: sentit de tirosinasa (5′-ggccagctttcaggcagaggt-3′), antisens de tirosinasa (5′-tggtgcttcatgggc aaaatc-3′), sentit de TRP-1- (5 ′-agccccaactctgtcttttc-3′), TRP-1-anti-sentit (5′-ggtctccctacatttccagc-3′), TRP-2-sentit (5′- tccagaagtttgacagccc-3 ′), TRP-2-antisentit (5′-ggaaggagtgagccaagttatg-3′), GAPDH-sentit (5′-aggtggtctcctctgacttc{-3′) i GAPDH-antisentit (5′-taccaggaaatgagcttgac -3′).

2.11. Western Blotting

Els melanòcits es van recollir i lisar mitjançant un reactiu d'extracció de proteïnes de mamífers (Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, EUA). Tots els procediments es van realitzar segons les instruccions del fabricant. Totes les concentracions de proteïnes es van determinar mitjançant un kit d'assaig de proteïnes Bio-Rad (Bio-Rad, Hercules, CA, EUA). A continuació, es va afegir tampó de càrrega al sobrenedant de proteïna i es va barrejar. La barreja es va bullir durant 10 min i les proteïnes es van separar mitjançant gels prefabricats Mini-PROTEAN (Bio-Rad, Hercules, CA, EUA) i es van transferir a una membrana de difluorur de polivinilidè Hybond (Amersham Biosciences, Piscataway, NJ, EUA). La immunodetecció es va realitzar mitjançant tirosinasa (1:1000), TRP-1 (1:1000), TRP-2 (1:1000), MITF (1:1000), CREB fosforilada (p-CREB 1: 1000), CREB (1:1000) i -tubulina (1:1000) (Cell Signaling Technology, Beverly, MA, EUA) mitjançant el kit de reforç de la immunoreacció SignalBoost (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, EUA). La membrana es va incubar durant la nit amb els anticossos primaris a 4 ◦ C. L'anticòs secundari de cabra anti-conill (IgG) (1:5000, Cell Signaling Technology) es va afegir a la membrana i es va incubar a temperatura ambient durant 1 h. Les bandes de proteïnes es van observar mitjançant un substrat de tacació occidental de Pierce ECL millorat (Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, EUA) i es van quantificar com a relació entre la intensitat de la banda de proteïnes objectiu i la intensitat de la banda de tubulina.

2.12. Anàlisi estadística

Tots els assajos es van repetir de manera independent almenys tres vegades. Tots els paràmetres estadístics es presenten com a error estàndard mitjà de la mitjana (SEM). Les anàlisis estadístiques es van realitzar mitjançant l'anàlisi de variància unidireccional (ANOVA), seguida de la prova post-hoc de Dunn. Es va considerar significatiu un valor de p < 0.01="" o="" p=""><>

prova de flavonoides

3. Resultats

3.1. Comparació de propietats antioxidants de diversos extractes parcials de KC

The total polyphenol and flavonoid contents and ABTS and DPPH scavenging activities were compared to determine the potential effects of KCR, KCS, KCL, and KCF extracts on antioxidant capacity. As shown in Figure 1B, the KCR extract(197.6 27.2 mg GAE/g) exhibited the highest phenol content, followed by KCL (153.7 6.7 mg GAE/g) and KCS (88.1 7.8 mg GAE/g); the KCF (21.8 4.8 mg GAE/g) extract had the lowest phenol content. Moreover, the results of flavonoid content analyses showed that KCL (94.5 6.3 mg QE/g) had the highest flavonoid content followed by KCR (79.6 4.2 mg QE/g); the KCS (14.9 1.3 mg QE/g) and KCF (6.4 2.0 mg QE/g) extracts had the lowest flavonoid content (Figure 1C). To further investigate the antioxidant properties of KCR, KCS, KCL, and KCF, ABTS and DPPHradical scavenging assays were performed. As shown in Figure 1D, KCL (94.7 ± 2.9%) and KCR (82.8 ± 5.9%) exhibited the highest ABTS radical scavenging activity, followed by the KCS (29.7 ± 2.0%) and KCF extract (15.9 ± 2.0%). DPPH radical scavenging activity was also shown in the order of KCL (99.9 ± 0.1%) > KCR (95.5 ± 3.6%) >KCS (25,7 ± 2,1 per cent) > KCF (8,7 ± 1,1 per cent) (figura 1E).

3.2. Comparació de queratinòcits viables i danyats tractats amb diversos extractes parcials de KC en presència de UVA, UVB o no irradiació

Hem realitzat els següents experiments per explorar els efectes dels onqueratinocits KCR, KCS, KCL i KCF. En primer lloc, tots els extractes es van aplicar als queratinòcits HaCaT en presència de UVA, UVB o no irradiació. L'anàlisi CCK-8 va mostrar que els extractes no van canviar significativament la viabilitat dels queratinòcits a concentracions de 0,5 mg/mL. Més tard, els queratinòcits es van tractar amb KCR, KCS, KCL i KCF en presència d'irradiació UVA o UVB. La irradiació UVA i UVB va inhibir significativament la viabilitat dels queratinòcits, tal com mostra l'anàlisi CCK-8 a la figura 2A. Tanmateix, vam trobar que la viabilitat dels queratinòcits irradiats amb UVA i UVB va augmentar en l'ordre següent: KCL, KCR, KCS i KCF (figura 2A). També vam controlar els queratinòcits danyats mesurant l'alliberament extracel·lular de LDH. Els resultats van mostrar que la irradiació UVA o UVB va facilitar significativament l'alliberament de LDH; tanmateix, KCL, KCR, KCS i KCF van atenuar significativament l'alliberament de LDH amb l'exposició a UVA o UVB en aquest ordre (figura 2B). Els resultats experimentals anteriors van mostrar que els efectes antiproliferatius i citotòxics de la irradiació UVA o UVB sobre els queratinòcits es van alleujar en l'ordre de KCL, KCR, KCS i KCF. En particular, KCL pot restaurar la viabilitat cel·lular per controlar els nivells.

Figura 2. La viabilitat dels queratinòcits i els efectes de citotoxicitat de l'extracte de KCR, KCS, KCL i KCF en presència de UVA, UVB o no irradiació.

3.3. Comparació de la producció intracel·lular de ROS en queratinòcits tractats amb diversos extractes parcials de KC en presència o absència d'irradiació UVA i UVB

Com que la producció intracel·lular de ROS causa danys greus als queratinòcits, es consideren mediadors potencials del dany induït per la radiació UVA o UVB. Diversos estudis han suggerit que la irradiació UVA o UVB indueix la producció endògena de ROS [12, 14]. El nostre objectiu és determinar si hi havia un augment dels nivells de ROS endògens en queratinòcits irradiats amb UVA o UVB. En conseqüència, es va analitzar la intensitat de fluorescència intracel·lular de la sonda CM-H2DCFDA mitjançant microscòpia de fluorescència i citometria de flux. Com a resultat de la microscòpia de fluorescència, les imatges de tinció de CM-H2DCFDA van mostrar una lleugera tinció en els queratinòcits tractats amb KCR, KCS, KCL i KCF i una tinció significativa en queratinòcits irradiats amb UVA o UVB (figura 3A). Segons els resultats quantificats de la citometria de flux, la irradiació UVA i UVB va augmentar els nivells de ROS intracel·lulars als queratinòcits en un 27,2 ± 4,5 per cent i un 34,1 ± 4,2 per cent, respectivament, en comparació amb la del control (5,7). ±0,2 per cent). A més, de manera similar als resultats de la microscòpia de fluorescència, es va confirmar que el nivell de ROS intracel·lular va ser suprimit per extractes de KC en l'ordre de KCL > KCR > KCS > KCF en presència d'irradiació UVA o UVB (figura 3B). Aquests resultats indiquen que diversos extractes parcials de KC van inhibir significativament el dany dels queratinòcits reduint els nivells de ROS endògens.

Figura 3. Efecte de l'extracte de KCR, KCS, KCL i KCF sobre la producció intracel·lular de ROS en UVA, UVB o queratinòcits no irradiats

3.4. Comparació de l'apoptosi de queratinòcits tractats amb diversos extractes parcials de KC en presència o absència d'irradiació UVA i UVB

Per detectar l'apoptosi, que és un indicador fiable del dany dels queratinòcits, es van tacar els queratinòcits amb Annexina V en combinació amb iodur de propidi. El kit d'apoptosi de cèl·lules mortes/annexina V d'isotiocianat de fluoresceïna (FITC) es va utilitzar per provar la taxa d'apoptosi als queratinòcits. La irradiació UVA i UVB va facilitar l'activitat de tinció d'Annexina V, mentre que KCR, KCS, KCL i KCF van disminuir la taxa d'activitat de tinció d'Annexina V en presència d'irradiació UVA i UVB. Només KCR, KCS, KCL i KCF (0,5 mg/mL) no van induir activitat de tinció d'Annexina V. Les dades quantificades de la citometria de flux van mostrar que la irradiació UVA i UVB augmentava els nivells d'apoptosi dels queratinòcits en 46,3± 1,5 per cent i 48,7 ± 1.0 per cent, respectivament, en comparació amb el del control (5.0 per cent ± 0,7 per cent). És important destacar que es va confirmar que el nivell d'apoptosi va ser suprimit per extractes de KC en l'ordre de KCL > KCR > KCS > KCF en presència d'irradiació UVA o UVB (figura 4A, B). En general, la irradiació UVA i UVB va causar danys als queratinòcits i diversos extractes parcials de KC van atenuar el dany als queratinòcits induït per la irradiació UV.

Figura 4. Efecte dels extractes de KCR, KCS, KCL i KCF sobre l'apoptosi en UVA, UVB o queratinòcits no irradiats.

3.5. Comparació del contingut de melanina intracel·lular i l'activitat de tirosinasa dels melanòcits tractats amb diversos extractes parcials de KC en presència o absència de tractament -MSH

Abans d'investigar el potencial biològic de KCR, KCS, KCL i KCF en la melanogènesi induïda per MSH, es va avaluar la viabilitat cel·lular després del tractament amb KCR, KCS, KCL i KCF (0,5 mg/mL) mitjançant l'assaig CCK-8 en melanòcits B16F10 amb o sense -MSH. KCR, KCS, KCL i KCF (0, 5 mg/ml) no van alterar la viabilitat cel·lular en presència o absència de -MSH (figura 5A). -MSH és un agent melanogènic important que pot augmentar el contingut intracel·lular de melanina en unir-se al receptor de melanocortina 1 i activar l'adenilat ciclasa. Per investigar l'efecte de KCR, KCS, KCL i KCF sobre la melanogènesi en melanòcits, el contingut de melanina intracel·lular es va determinar mitjançant observació visual i mesures bioquímiques. Com es mostra a la figura 5B, el contingut de melanina intracel·lular va augmentar significativament per -MSH. Tanmateix, el cotractament amb KCR, KCS, KCL i KCF va mostrar una reducció notable del contingut de melanina intracel·lular en comparació amb el tractament -MSH. La seqüència de mesures bioquímiques que indicaven la inhibició del contingut de melanina intracel·lular va ser la següent: KCL > KCR > KCS > KCF (figura 5B). L'assaig d'activitat de la tirosinasa intracel·lular es va realitzar segons l'assaig de contingut de melanina intracel·lular. L'activitat de la tirosinasa intracel·lular dels melanòcits estimulats per -MSH va augmentar, mentre que la dels melanòcits estimulats per -MSH tractats amb KCR, KCS, KCL i KCF va disminuir. La seqüència de mesures bioquímiques que indicaven la inhibició de l'activitat tirosinasa intracel·lular va ser la següent: KCL > KCR > KCS > KCF (figura 5C). Aquests resultats indiquen que diversos extractes parcials de KC van reduir significativament el contingut de melanina intracel·lular i van inhibir l'activitat de la tirosinasa sense alterar la viabilitat cel·lular.

3.6. Comparació dels nivells de transcripció i traducció de tirosinasa, TRP-1 i TRP-2 en melanòcits tractats amb diversos extractes parcials de KC en presència o absència de- Tractament MSH

Per explorar l'efecte de KCR, KCS, KCL i KCF en la regulació a la baixa dels nivells d'expressió de proteïnes i ARNm dels marcadors de melanogènesi (tirosinasa, TRP-1 i TRP-2), els melanòcits es van tractar amb KCR. , KCS, KCL i KCF en presència o absència de -MSH. Com es mostra a la figura 6A-C, els nivells d'ARNm de tirosinasa, TRP-1 i TRP-2 es van augmentar significativament amb el tractament -MSH. En canvi, en comparació amb el tractament -MSH, KCR, KCS, KCL i KCF van regular a la baixa l'expressió d'ARNm de tirosinasa, TRP-1 i TRP-2. A més, només KCR, KCS, KCL i KCF no van tenir cap efecte significatiu sobre els nivells d'ARNm de tirosinasa, TRP-1 i TRP-2. L'anàlisi de Western blot es va realitzar en cooperació amb PCR en temps real. Els resultats van mostrar que el tractament amb -MSH va augmentar els nivells d'expressió de proteïnes de tirosinasa, TRP-1 i TRP-2 i aquests nivells es van reduir mitjançant el cotractament amb KCR, KCS, KCL i KCF (figura 6D). ). La seqüència de la PCR quantitativa en temps real i la inhibició que indica la taca occidental de l'expressió d'ARNm i proteïnes de la tirosinasa, TRP-1 i TRP-2 va ser la següent: KCL > KCR=KCS > KCF (figura 6). Aquests resultats suggereixen que diversos extractes parcials de KC tenen el potencial de promoure l'anti-melanogènesi, que es va demostrar per la regulació a la baixa dels marcadors de melanogènesi.

3.7. Comparació de l'expressió MITF i la fosforilació CREB de melanòcits tractats amb diversos extractes parcials de KC en presència o absència de tractament -MSH

La tirosinasa, la TRP-1 i la TRP-2 són essencials en la melanogènesi. La seva expressió està regulada per l'expressió MITF i la fosforilació CREB [17, 21]. L'anàlisi de Western blot va indicar que KCR, KCS, KCL i KCF van inhibir de manera efectiva l'augment del nivell de proteïnes de MITF causat pel tractament -MSH. A més, només KCR, KCS, KCL i KCF gairebé no van detectar l'expressió de proteïnes MITF. La seqüència de resultats de Western blot quantificats que indicaven la inhibició dels nivells d'expressió de proteïnes MITF va ser la següent: KCL > KCR > KCS > KCF (Figura 7A). A més, KCR, KCS, KCL i KCF van revertir els efectes del tractament -MSH sobre la fosforilació CREB. Només KCR, KCS, KCL i KCF van tenir poc efecte sobre la fosforilació CREB. La seqüència de resultats de Western blot quantificats que indicaven la inhibició dels nivells de fosforilació CREB va ser la següent: KCL > KCR > KCS > KCF (figura 7B). Aquests resultats van indicar que diversos extractes parcials de KC van suprimir els inmelanòcits de melanogènesi, almenys en part, mitjançant l'expressió MITF i la fosforilació CREB.

4. Discussió

La popularitat del blanquejament de la pell està augmentant a tot el món a causa de l'augment de la irradiació UV, i és probable que assoleixi proporcions elevades en les properes dècades amb finalitats estètiques [8]. Els nombrosos tipus de lleixiu, com l'àcid cògic i l'arbutina, s'han utilitzat en els mercats cosmètics i farmacèutics. A més, els extractes naturals estan rebent una atenció creixent a causa de les seves activitats potencials antioxidants, antiinflamatòries, antitumorals, antibacterianes i altres [26,27]. A partir de les característiques dels antioxidants i fotoprotectors i anti-melanogènesi, s'han desenvolupat diversos candidats cosmètics i farmacèutics. És ben sabut que aquestes propietats dels candidats per blanquejar són contribuents indispensables a la investigació i desenvolupament cosmètics i farmacèutics [28]. El TDM té propietats multicomponent i multi-objectiu i millora molt l'eficàcia biològica humana i la qualitat de vida [29]. La investigació fitoquímica moderna mostra que el KC conté una varietat d'ingredients, sent els lignans i els terpenoides els ingredients principals [30]. S'han identificat més de 202 compostos, inclosos els lignans de dibenzociclooctadiè, els lignans de dibenzociclooctadiè Spirobenzofuranoid, els lignans d'arilnaftalè, els triterpenoides de Kadlongilactona i els sesquiterpenoides [31, 32]. Les arrels seques, les tiges i les fulles de KC tenen una àmplia tradició d'ús en TDM per tractar l'artritis reumatoide, les úlceres duodenals, els trastorns gastrointestinals i els problemes ginecològics. Les arrels seques de KC, amb accions de neteja de calor i eliminació de toxines, indueixen diüresi per eliminar edemes. Les fruites de KC es consumeixen principalment en forma de fruites fresques, sucs i vi de fruites, cosa que indica que són beneficioses per a la salut humana [7,33,34]. Estudis anteriors també han demostrat que és ric en ingredients bioactius com lignans, triterpenoides, flavonoides, àcids fenòlics, esteroides i aminoàcids, que tenen un alt valor nutricional i medicinal [3,35]. En aquest estudi, es van extreure diferents parts de KC. En particular, el contingut total de polifenols i flavonoides de les fulles i arrels de KC eren molt més alts que els de les tiges i els fruits. Les fulles i arrels contenen més del doble de polifenols i flavonoides que les tiges i els fruits. Com a resultat, considerem que els polifenols i flavonoides totals contribueixen significativament als efectes fotoprotectors i anti-melanogènics del KC.

La fototoxicitat cutània causada per la radiació UV es deu principalment a la citotoxicitat cel·lular, l'acumulació intracel·lular de ROS i l'apoptosi als queratinòcits. Per tant, és més raonable centrar-se en la inhibició de la citotoxicitat cel·lular, l'acumulació intracel·lular de ROS i l'apoptosi en queratinòcits irradiats amb UVA i UVB [36,37]. Tal com es descriu en aquest estudi [10,38], els resultats de la intervenció amb extractes de KC sobre fotocitotoxicitat (UVA: 20 J/cm2, UVB: 50 mJ/cm2) van mostrar que els extractes de KC van reduir significativament la citotoxicitat cel·lular, l'acumulació intracel·lular de ROS i apoptosi. D'acord amb els resultats anteriors, els efectes fotoprotectors de les fulles i arrels de KC van ser molt més alts que els de la tija i el fruit. A més, els nostres resultats van indicar que els extractes de KC mostren els efectes esmentats anteriorment mitjançant la promoció de l'activitat antioxidant. La melanogènesi s'observa sovint després de la irradiació UV i s'associa principalment amb la pigmentació o la hiperpigmentació [39]. Segons estudis anteriors, el mètode per induir la melanogènesi mitjançant -MSH ha estat àmpliament reconegut i aplicat. Per tant, aquest estudi es va basar en la construcció d'un model de melanòcits estimulat amb -MSH [24,39]. Vam trobar que els extractes de KC van suprimir el contingut de melanina intracel·lular i l'activitat de la tirosinasa estimulada per MSH. A més, els extractes de KC van regular a la baixa la transcripció i la traducció de marcadors de melanogènesi com la tirosinasa, TRP-1 i TRP-2 en melanòcits estimulats per -MSH. A més, es va investigar l'expressió de proteïnes MITF i la fosforilació CREB en melanòcits estimulats per -MSH. De la mateixa manera, en aquest estudi, vam trobar que els extractes de KC suprimien l'expressió de proteïnes MITF mediada per -MSH i la fosforilació CREB als melanòcits. D'acord amb els resultats fotoprotectors, els efectes anti-melanogènics de les fulles i arrels de KC eren molt més alts que els de les tiges i els fruits.

rodanxes de cistanche

Per a més informació, feu clic aquí.

5. Conclusions

En general, en aquest estudi es van trobar els efectes fotoprotectors i anti-melanogènics potencials de l'extracte de KC. L'extracte de KC amb un alt contingut en polifenols i flavonoides pot exercir efectes fotoprotectors i anti-melanogènics sobre queratinòcits i melanòcits. Aquest estudi proporciona una justificació i una estratègia d'investigació per a intervencions cosmètiques i farmacèutiques per blanquejar i agents fotoprotectors naturals.