Poli i oligosacàrids Ulva Sp. Les fraccions de l'extracció assistida per enzims modulen el metabolisme de la matriu extracel·lular

Siusplau contactaoscar.xiao@wecistanche.comper a més informació

Resum:Ulva sp. se sap que és una font de compostos bioactius com les furgonetes, però la seva activitat biològica sobre la matriu extracel·lular de fibroblasts dèrmics (ECM) humà està mal informada. En aquest treball, s'ha investigat per primera vegada la regulació de l'ECM tant a nivell proteòmic com transcriptòmic en fibroblasts dèrmics de pell humana normal, després de 48 h d'incubació amb fraccions de poli i oligosacàrids d'Ulva sp. obtingut després de l'extracció i despolimerització assistida per enzims. La millora de la proliferació cel·lular (fins a més del 68 per cent) sense mostrar cap efecte citotòxic sobre els fibroblasts es va demostrar a 50 i 1000 ug/mL per ambdues fraccions. A nivell proteòmic, les fraccions de polisacàrids a 1000 ug/mL van millorar al màxim la síntesi de glicosaminoglicans (GAG, fins a més un 57 per cent), el col·lagen total, especialment els tipus I (fins a més un 217 per cent) i Ⅲ, així com la síntesi. i l'activitat de la MMP-1 (Matrix Metalloproteinase-1, fins a més del 309 per cent). En canvi, les fraccions d'oligosacàrids no tenien cap efecte en la síntesi de GAG, però presentaven similituds per als col·lagens i la regulació de la MMP-1.puritans vitamina cA nivell transcriptòmic, la disminució de l'expressió COL1A1 i COL1A2 i l'augment de l'expressió COL3A1 i MMP-1 van confirmar la modulació del metabolisme de l'ECM per ambdues fraccions. La nostra investigació posa èmfasi en que els poli i oligosacàrids Ulva sp. Les fraccions mostren activitats biològiques interessants i donen suport al seu ús potencial en l'àrea de la renovació de la pell per a aplicacions dermocosmètiques anti-envelliment.

feu clic aquí per saber-ne més

Paraules clau:col·lagen; matriu extracel·lular; fibroblast dèrmic humà; metaloproteinasa de la matriu; algues; Ulva sp.

1. Introducció

Marees verdes a gran escala provocades per Uloa sp. han estat recurrents a la Bretanya (França) a causa de l'eutrofització marina. Els encallaments d'algues verdes tenen profunds impactes ecològics adversos que inclouen l'alteració de l'estructura de l'ecosistema, la reducció de la biodiversitat autòctona i les pèrdues econòmiques [1,2]. Excepte per a la utilització com a modificació del sòl, alimentació animal o simple degradació per descomposició o combustió per esdeveniments de varament, se sap molt poc sobre la valorització d'Uloa sp. en salut humana [1]. Tanmateix, Ulloa sp. és una font important de compostos com els ulvans. Evans, polisacàrids de paret cel·lular sulfatada solubles en aigua, composts principalment per ramnosa, àcids urònics i xilosa, poden representar fins a un 36 per cent del pes sec d'Ulloa [3]. Les dues principals unitats disacàrids repetides de l'ulvan són els àcids aldobiurònics (àcids ulvanobiurònics), tipus A: àcid -D-glucurònic (1,4) lligat al sulfat de -L-ramnosa 3-, i tipus B: -L- àcid idurònic (1,4) lligat al sulfat de -L-ramnosa 3-. Les aldoses de disacàrids menors, denominades ulvanobiosis (tipus U) també es poden trobar a ulvan[3.4]. L'extracció d'ulvan en termes de rendiment quantitatiu i qualitat pot variar significativament segons els mètodes d'extracció i fraccionament aplicats a la biomassa. Els ulvans s'extreuen habitualment en solució aquosa a altes temperatures (80-90 graus) conegut com a procés de maceració. Tanmateix, Evans es pot recuperar mitjançant una nova tecnologia verda anomenada Enzyme-Assisted Extraction (EAE)[5]. L'EAE permet l'extracció de compostos d'interès sense utilitzar condicions desnaturalitzants com dissolvents o altes temperatures d'extracció, i presenta diversos avantatges com ara alta eficiència catalítica, alta especificitat, condicions de reacció suaus i preservació de les activitats biològiques dels compostos. L'EAE també millora el rendiment i redueix el cost i el consum d'energia en comparació amb un procés de maceració clàssic [6-9]. Després de l'extracció aquosa de la maceració o d'un procés nou com l'EAE, l'enriquiment d'ulvans sovint es realitza mitjançant un procediment de precipitació etanòlica [3]. Els Ulvans han demostrat in vitro i in vivo diverses activitats biològiques com ara la immunomodulació, antioxidant, anticancerígen, anticoagulant, antihiperlipidèmic o antiviral [3,5,10-14].sistancheLa característica estructural d'Evans (grau de sulfatació, patró de sulfatació, composició de monosacàrids, enllaços glicosídics, grau de ramificació i pes molecular) afecta la seva activitat biològica [3]

L'envelliment de la pell és un procés complex amb dos processos complementaris: intrínsec (genètic, metabolisme cel·lular, etc.) i extrínsec (exposició als UV, contaminació, tabaquisme, etc.)[15-17]

Cistanche pot anti-envelliment

Recentment va aparèixer l'ús de bioactius d'algues marines com a fonts de productes d'alt valor afegit per a la indústria dermocosmètica. Entre aquests compostos bioactius, els ulvans tenen un alt potencial. De fet, les demandes dels consumidors de productes naturals han augmentat en els últims anys, fet que fa que els productes marins i, en particular, les algues marines, siguin una font interessant d'ingredients naturals orientats a la bellesa i la salut de la pell [18-22]. La pell, l'objectiu dels productes cosmètics, està formada per tres grans capes superposades: epidermis, dermis i hipodermis.què és el cistancheLa dermis suporta l'epidermis i alberga cèl·lules importants de la pell conegudes com fibroblasts. Els fibroblasts, les cèl·lules principals de la dermis papil·lar que es troben just sota l'epidermis, sintetitzen i organitzen essencialment la matriu extracel·lular (ECM). L'ECM es compon de diverses macromolècules que inclouen col·lagens (70 per cent del pes sec) principalment tipus I i III, elastina (2-4 per cent), glicoproteïnes (fibronectina, laminina, etc.), glicosaminoglicans (GAG) o sulfatats (heparà). sulfat, sulfat de dermatà, sulfat de queratà, sulfat de condroitina) i no sulfatats (àcid hialurònic), proteoglicans i components degradatius com les MMP (Matrix Metalloproteinases)[23,24]. El col·lagen de tipus I representa fins al 80 per cent del col·lagen total [25] i és un dels components principals de l'ECM de la dermis de la pell; està implicat en l'elasticitat, la flexibilitat i la tensió de la pell. El col·lagen tipus I és una proteïna heterotrímer, de triple hèlix, compost per dues cadenes cl i una cadena c2 codificades respectivament pels gens COL1Al i COL1A2 [26]. Els col·lagens fibril·lars tipus I i II representen més del 90 per cent del col·lagen total i estan estretament associats a la pell [27,28]. El col·lagen tipus II és més freqüent a la pell jove que a la pell envellida i està especialment implicat en la cicatrització de ferides [29,30]. Per tal d'establir una xarxa molecular per al muntatge de l'ECM, els GAG s'associen amb proteïnes i formen proteoglicans (per exemple, decorina o versicà) que interaccionen amb el col·lagen de tipus I [31]Dins de l'ECM, les MMP, que són enzims de la via catabòlica de l'ECM, estan lligats, en forma latent o activa, al seu inhibidor tissular de metaloproteinases coneguts com a TIMP, que regulen la seva activitat [32]. La MMP-1(collagenasa-1) és el principal enzim responsable de la degradació del col·lagen de tipus I, i TIMP-1 és el seu inhibidor respectiu [334]. Els fibroblasts són reguladors clau de l'homeòstasi de l'ECM. Un equilibri i acoblament de síntesi entre els components de l'ECM de la pell implicats en l'anabolisme, com els col·lagens tipus I i II, els GAG o els TIMP, i en el catabolisme com els MMP, permeten la renovació i la remodelació contínua d'aquesta ECM[25].En l'envelliment de la pell. , la conseqüència principal és un desequilibri de la regulació de l'ECM amb la reducció de la proliferació de fibroblasts, la modulació dels nivells de components de l'ECM amb una disminució important de la síntesi de col·lagen tipus I, la secreció de GAG ​​i la síntesi de TIMP-1 i l'augment de Nivell MMP-1 [24,35].

De moment, només uns quants estudis han investigat l'efecte d'Ulva sp. fraccions sobre el metabolisme de les cèl·lules de la pell dels fibroblasts tant a nivell proteòmic com transcriptòmic[36-39]i, fins ara, no s'ha realitzat cap estudi complet a nivell proteòmic i transcriptòmic sobre les fraccions de poli i oligosacàrids d'Ulua derivades del procés EAE.Cistanche anti-envellimentEn aquesta perspectiva, aquest estudi investiga, in vitro, els efectes de les fraccions de poli- i oligosacàrids d'Ulva sp. derivat de la nova tecnologia verda EAE sobre el metabolisme dels fibroblasts dèrmics humans. Es van estudiar els seus efectes sobre la proliferació i la viabilitat dels fibroblasts i sobre l'anabolisme i el catabolisme de l'ECM a nivell proteòmic i transcriptòmic per tal de destacar el seu potencial en la cura de la pell (per exemple, anti-envelliment).

2. Resultats

2.1.Fraccions poli-i oligosacàrids d'Ulva sp.

d'EAE Exhibició composició bioquímica diferent i distribució del pes molecular

Els mecanismes de producció de fraccions de poli i oligosacàrids es detallen a la secció Materials i mètodes: "4.2 Producció i caracterització de fraccions de poli i oligosacàrids". Anàlisis prèvies de caracterització bioquímica detallada (hidrats de carboni, àcids urònics, grups sulfat i proteïnes) i moleculars. distribució de pes de les fraccions de poli i oligosacàrids d'Ulloa sp. derivats de l'EAE es van realitzar [36]. Les dades es combinen a la taula 1.

Breument, les fraccions de polisacàrids dels ulvans bruts (UE) i els ulvans dialitzats (DS-UE) estan compostes per ulvans d'alt pes molecular (furgonetes brutes) amb un 23,5-37,4% d'hidrats de carboni,18.5-37. 0 per cent d'àcids urònics, 29,9-49,1 per cent de grups sulfat i 10.5-12,8 per cent de proteïnes. La composició dels hidrats de carboni era principalment ramnosa (50 per cent) i àcid glucurònic (11 per cent). La fracció DS-UE és significativament més rica en ulvans que la fracció UE. Les fraccions d'oligosacàrids, furgonetes despolimeritzades de HzO2 (DEP-HD PP-UE) i furgonetes despolimeritzades de resina Amberlite (DEP-AD PP-UE), estan compostes per furgonetes de baix pes molecular amb un 24.4-30,4% d'hidrats de carboni ( ramnosa 44,9-55,4% i àcid glucurònic 7,5-11,0% ), 21,6-30,8% àcids urònics i 12,8-16,8% proteïnes.

Tanmateix, el procés de despolimerització va provocar una pèrdua parcial de sulfats (no detectat en DEP-ADPP-i només un 6,6 per cent en DEP-HD PP-UE). La distribució del pes molecular (Mw) de les fraccions d'oligosacàrids va mostrar un Mw mitjà baix de 8kDa per a DEP-HD PP-UE i inferior per a DEP-AD PP-U amb 1,5 kDa.

2.2.Fraccions poli-i oligosacàrids d'Ulva sp. Estimula l'activitat metabòlica però no afecta la viabilitat dels fibroblasts

L'activitat metabòlica dels fibroblasts dèrmics humans normals (NHDF), 48 h exposats a fraccions de poli i oligosacàrids Ulloa (50 i 100 ug/mL durant 48 h), es va avaluar mitjançant WST -1 (Figura 1). En aquests experiments (n=9), les fraccions Ullva de l'EAE van augmentar la proliferació de fibroblasts fins a un 68 per cent en comparació amb el control.cistanche benefíciosAugments significatius de l'activitat metabòlica (pàg<0.001)were observed="" for="" both="" ue="" and="" ds-ue="" at="" 50="" and="" 1000="" ug/ml.="" oligosaccharide="" fractions="" exhibited="" a="" higher="" and="" more="" significant="" rise="" of="" metabolic="" activity="" at="" 100="" ug/ml="" (p=""><0.001) than="" at="" 50="" ug/ml(no="" significance="" for="" dep-hd="" pp-ue="" and="" lower="" significance,=""><0.05, for="" dep-ad="">

Per determinar si aquests efectes estaven associats a cap toxicitat cel·lular, es va avaluar la viabilitat de les cèl·lules tractades amb extracte d'Ulou mitjançant la mesura de l'alliberament de LDH (lactat deshidrogenasa) mitjançant un assaig de graus CytoTox96 després de 48 h d'incubació (n{3}) (figura). 2). L'assaig de citotoxicitat va mostrar que totes les fraccions no presentaven cap citotoxicitat significativa en comparació amb el control.

2.3.Fraccions poli-i oligosacàrids d'Ulva sp. Estimular el metabolisme de la matriu extracel·lular en els fibroblasts

L'efecte de les fraccions de poli-i oligosacàrids Ulloa sobre la síntesi de glicosaminoglicans (GAG) sulfatats i no sulfatats de fibroblasts es va avaluar amb tinció de blau d'Alcian després de 48 h d'incubació (n=4) (Figura 3). Només es van observar augments significatius de la síntesi per a UE i DS-UE a 100 ug/mL considerant tots dos sulfatats (p<0.01,+39% and="" +51%,respectively)="" and="" non-sulfated="" gags=""><0.05,+44% and="" +57%="">

És interessant assenyalar que DS-UE, la fracció d'ulvans més rica, va millorar més la síntesi de GAG. A 50 ug/mL, UE i DS-UE van augmentar la síntesi de GAG ​​no sulfatats, però no significativament (més un 14,2 per cent i més un 22,7 per cent respectivament). Les fraccions d'oligosacàrids DEP-AD PP-UE a 1000 ug/mL van disminuir lleugerament la síntesi de GAG ​​no sulfatats però no significativament (-3 per cent) i DEP-HD PP-UE van millorar lleugerament però no significativament la síntesi de GAG ​​a 100 ug/ mL (més un 4,1 per cent per als sulfatats i més un 10,9 per cent per als no sulfatats).

La síntesi total de col·lagen (figura 4) es va avaluar mitjançant l'assaig Red Sirius després d'una exposició de fibroblasts de 48 h a fraccions de poli- i oligosacàrids Ulloa (n=7 a 100 ug/mL i n=6 a 50 ug/mL) .

Totes les fraccions van demostrar un augment depenent de la concentració en la síntesi de col·lagen. Es va observar una disminució marginal i no significativa de la síntesi de col·lagen per a totes les fraccions a 50 ug/ml en comparació amb el control. En canvi, a 1000 ug/ml, totes les fraccions van augmentar la síntesi total de col·lagen i de manera significativa per a UE (més un 22 per cent, p).<><0.01),and dep-hd=""><>

L'efecte de la fracció EAE derivada de poli i oligosacàrids sobre la síntesi de col·lagen de tipus I (n=6) i la síntesi de MMP-1 (n=4) es va avaluar amb assaigs ELISA (figura 5).

Totes les fraccions van millorar la síntesi de col·lagen de tipus I i la síntesi de MP-1, però no sempre de manera significativa. L'augment de la síntesi de col·lagen de tipus I va dependre de la concentració. Es va trobar que les fraccions de polisacàrids, UE i DS-UE, a 1000 ug/mL, van ser significativament （p<05）increase type="" i="" collagen="" synthesis="" (+122%,="" and="" +217%="" respectively)="" and="" mmp-1="" synthesis="" (+309%="" and="" +169%="">

Els efectes de les fraccions de poli-i oligosacàrids Ulloa a 100 ug/ml, després d'una exposició de fibroblasts de 48 h, sobre la síntesi de col·lagens tipus I(n=5) i tipus Ⅲ(n{=4), en el La producció de MMP-1(n{=6) i TIMP{-1(n{=5) ​​es va avaluar mitjançant anàlisi de Western blot (WB) amb el mètode de normalització mitjançant el mètode de proteïna total del carril ( Figura 6).

A la figura 6a, e i WB van destacar, respectivament, un augment de la síntesi de col·lagen de tipus I madur (≈130kDa) i de col·lagen de tipus III madur (≈190 kDa) per a totes les fraccions. La quantificació de proteïnes a la figura 6c del col·lagen tipus I i la figura 6g del col·lagen tipus III va revelar un augment NS (no estadísticament significatiu) de la seva síntesi en presència tant de poli-i oligosacàrids Ulloa sp. fraccions. Mentrestant, WB a la figura 6b,d ens va permetre quantificar un significatiu （p<05）increase of="" mmp-1="" production="" （≈50kda）for="" polysaccharide="" fractions="" and="" not="" significant="" for="" oligosaccharide="" ulloa="" eae-derived="" fractions="" dep-ad="" pp.="" ue="" and="" dep-hd="" pp-ue.="" wb="" quantification="" of="" timp-1="" production="" （≈20kda）,="" available="" in="" figure="" 6f,h,="" showed="" only="" a="" significant="" increase="" in="" presence="" of="" the="" dep-hd="" pp-ue="" fraction=""><0.05), while="" other="" fractions="" had="" no="" significant="">

L'activitat de la col·lagenasa MMP-1 es va determinar mitjançant un assaig de zimografia en presència de fraccions d'Ulloa de poli- i oligosacàrids a 100 ug/ml (figura 7a), quantificada i comparada amb el control (figura 7b), després d'una exposició de fibroblasts de 48 h (n). =4).

Els resultats van revelar que tant el poli com l'oligosacàrid Ulva sp. Les fraccions van augmentar no significativament l'activitat MMP-1 dels fibroblasts.

2.4.Fraccions poli-i oligosacàrids d'Ulva sp. Modular de manera diferencial l'expressió gènica de l'ECM dels fibroblasts

L'efecte de les fraccions derivades de poli- i oligosacàrids Ulloa EAE es va estudiar sobre els nivells d'ARNm en estat estacionari de diversos components de la matriu extracel·lular (COL1A1, COL1A2, COL3A1, MMP-1 i TIMP{-1) (n =4)(Figura 8).

Ens vam adonar que totes les fraccions a 1000 ug/ml es van reduir significativament (p<0.01 and=""><05)col1a1 mrna="" steady-state="" levels="" (figure="" 8a).="" in="" contrast,="" we="" noted="" that="" all="" fractions="" increased="" mmp-1="" mrna="" level="" expression="" significantly="" (p="" <="" 0.05)="" for="" ue="" at="" both="" concentrations="" and="" ds-ue="" at="" 50="" ug/ml="" only="" (figure="" 8c).="" timp-1="" mrna="" steady-state="" level="" was="" not="" significantly="" changed,="" but="" dep-hd="" pp-ue="" and="" dep-ad="" pp-ue="" reduced="" it="" not="" significantly="" at="" 50="" ug/ml="" (figure="" 8e).="" the="" col1a2="" mrna="" steady-state="" level="" (figure="" 8b)="" is="" enhanced="" (ns)="" for="" both="" ue="" concentrations="" and="" ds-ue="" at="" 50="" ug/ml.="" however,="" it="" is="" lower="" at="" 1000="" ug/ml="" for="" ds-ue="" (ns),="" dep-hd="" pp-ue,="" and="" dep-ad="" pp-ue="" (only="" significant="" at="" 1000="" ug/ml="" for="" the=""><0.05). polysaccharide="" fractions,="" ue="" and="" ds-ue,="" raised="" col3a1="" mrna="" level="" expression="" significantly=""><0.05) at="" 1000="" ug/ml="" and="" at="" 50="" ug/ml="" for="" ue="" (ns="" for="" ds-ue)(figure="" 8d).="" oligosaccharide="" fractions,="" dep-hd="" pp-ue,="" and="" dep-ad="" pp-ue,="" at="" 1000="" ug/ml="" raised="" not="" significantly="" col3a1="" mrna="" level="" expression="" and="" reduced="" it="" at="" 50="" μg/ml（significant="" only="" for="" dep-ad=""><>

La taula 2 mostra els resultats combinats del nivell d'estat estacionari de l'ARNm del gen després de l'exposició de fibroblasts a fraccions a 1000 ug/mL.

La taula 2 mostra que la UE va disminuir significativament (pàg<0.01)col1al and="" increased="" signifi-cantly=""><0.05) mmp-1="" and="" col3a1,="" and="" not="" significantly="" col1a2mrna="" steady-state="" levels.="" for="" ds-ue,="" dep-hd="" pp-ue,="" and="" dep-ad="" pp-ue,="" similar="" mrna="" steady-state="" levels="" with="" a="" decrease="" in="" col1a1=""><0.01), in="" col1a2(only="" significant=""><0.05 for="" dep-ad="" pp-ue),="" increase="" in="" col3a1="" (only="" significant=""><0.05 for="" ds-ue),="" increase="" in="" mmp-1(ns),="" and="" no="" significant="" change="" in="" timp-1="" mrna="" expression="" were="">

Aquest article Mar. Drugs 2021, 19, 156. https://doi.org/10.3390/md19030156 https://www.mdpi.com/journal/marinedrugs