Efecte protector del glicòsid total de la salsa Cistanche en una lesió hepàtica experimental

Contacte: Audrey Hu Whatsapp/hp: 0086 13880143964audrey.hu@wecistanche.com

Wang Yanfang, Zhao Jijun, Hai Pengli, Xue Peifeng, Li Hui, Li Minhui

Abstracte

En aquest experiment, es va establir un model de lesió hepàtica alcohòlica en ratolins, i es van utilitzar indicadors bioquímics de la funció hepàtica i els canvis histopatològics hepàtics com a indicadors d'inspecció. Investiga elefecte protector del glicòsid total de la salsa de cistanche sobre la lesió hepàtica alcohòlica experimental. Dóna el totalglucèuic de salsa cistanchedosis altes (130 mg/kg) i dosi mitjana per gavage (100 mg /kg), dosis baixes (65 mg/kg) i bidentat (150 mg/kg) com a fàrmac de control positiu. Els resultats van mostrar que el sèrum ALT i AST s'incrementen significativament; L'activitat de SOD al fetge es redueix i el contingut de MDA s'incrementa; Apareix la lipidosi de les cèl·lules hepàtiques. El glucíid total del grup de dosis altes de salsa cistanche és eficaç en la millora dels índexs de funció hepàtica i la reducció de la degeneració lipídica de les cèl·lules hepàtiques. Sobre aquesta base, la determinació preliminar deequiinacòsidiacteosideel contingut en el glicòsid total de la salsa cistanche va ser del 29,1%. Els experiments anteriors mostren que el glicòsid total de la salsa cistanche té un efecte protector sobre les lesions hepàtiques alcohòliques en ratolins, i també es confirma que l'equiinacòsid i l'acteòsiden són els principals ingredients actius del glicòsid total de la salsa de cistanche.

Paraules clau: glucóssid total de salsa cistanche; cromatografia líquida d'alt rendiment; acteoside; equiinacos; lesió hepàtica alcohòlica

Salsa de citancheCistanche és una planta Cistanche de la família orobanchaceae (Orobanchaceae), també coneguda com a salina, una planta parasitària herbàcia perenne, distribuïda principalment en deserts, deserts i altres àrees seques. Les principals àrees productores es troben a Xinjiang i Mongòlia Interior. 1]. A causa del fet que Herba Cistanche de la mateixa família i el mateix gènere s'han excavat en grans quantitats, i les plantes paràsites són difícils de reproduir, els recursos medicinals estan disminuint dia a dia, i és difícil satisfer la demanda del mercat. Al nostre país, la salsa de cistanche popular s'utilitza com a substitut de cistanche deserticola, però els seus informes d'investigació són pocs. Per tal d'aclarir encara més el seu valor medicinal, s'ha estudiat farmacològicament el glicòsid total de la salsa cistanche (glicòsids totals de la salsa Cistanche), una classe de substàncies que contenen glucàsids fenitonoides.El glucosas total de la salsa cistanche té un efecte protector sobre els nervis[2] i pot protegir l'ADN dels danys oxidatius causats per l'hidroxil (OH·) [3] Els micosis fenilantanis de salsa Cistanche poden augmentar significativament l'activitat de superòxid dismutasa (SOD) en el cor del ratolí, el fetge i els teixits cerebrals. La investigació anterior suggereix que laglucèuid total de salsa cistancheTé un efecte antioxidant.

La incidència de la malaltia hepàtica alcohòlica (ALD) augmenta any rere any al meu país. L'alcohol s'ha convertit en la segona causa principal de dany hepàtic després de l'hepatitis viral. Per al tractament de les lesions hepàtiques alcohòliques, hi ha una manca de medicaments segurs i eficaços. Com utilitzar els recursos vegetals per desenvolupar medicaments i productes sanitaris antialcohosos i de protecció hepàtica ha atret una àmplia atenció en les indústries farmacèutica i alimentària. Després d'una extensa literatura, s'ha trobat que la lesió hepàtica alcohòlica està relacionada amb l'estrès oxidatiu, i lael glicòsid total de la salsa de cistanche té un efecte sobre les lesions hepàtiques alcohòliquesy. La investigació sobre l'efecte protector encara està en blanc. La investigació en aquest experiment proporciona una base científica per al desenvolupament i la utilització del glicòsid total de la salsa de cistanche.

1 Material i equipament

1. 1 Medicina i reactius

Salsa Cistancheva ser proporcionat pel Laboratori Clau d'Identificació i Estandardització de Materials Medicinals de Mongòlia, Baotou Medical College; Bifendate píndoles d'excrement (Zhejiang Wanbang Pharmaceutical Co, Ltd, número de lot A02121139); Kit Alanine Aminotransferase (ALT), kit d'aminotransferasa d'àcid aspartam (AST), kit de prova de malondialdehid (MDA), kit superòxid dismutasa (SOD), kit de determinació de proteïnes blaves brillants Coomassie (Institut De Bioenginyeria Nanjing Jiancheng, número de lot 20110422); Licor 56 ° (Beijing Red Star Co, Ltd); Altres reactius són domèsticament purs.

1. 2 Animals

72 ratolins mascles d'espècies de Kunming, amb un pes de 17-22 g (Centre d'Animals del Laboratori universitari de Mongòlia Interior, Certificat de qualificació animal núm.:6 (Mongòlia 2002-0001)).

1. 3 Instruments

Espectrofotòmetre ultraviolat visible [Unico (Xangai) Instrument Co, Ltd,, model UV-2000]; Lector de microplate (Beckman Coulter, EUA, model AD340); Centrífuga d'alta velocitat (Hangzhou Aipu Instrument Equipment Co, Ltd, model TG18-WS); Cromatògraf líquid d'alt rendiment (Thermo Fisher Científic, Model Ultimate 3000); Balanç analític (METTLER TOLEDO Instruments Co, Ltd Model AR153O); Oscil·lador ultrasònic (Xangai Branson, model SB3200); Congelació dessecant (Beijing Boyikang Experimental Instrument Co, Ltd,, model FD-1-50).

2 Mètodes i resultats

2. 1 Estudi sobre el glicòsid total de l'activitat de la salsa de cistanche

2. 1. 1 Glucèuid total de l'extracció de salsa de cistanche

2. 1. 1. 1 Extracció d'extracte cru

Peseu 100 g de pols gruixuda de salsa de cistanche, afegiu 600 ml de 70% d'etanol i remulleu durant 3 h, extracte ultrasònic durant 30 min, filtreu i repetiu els passos anteriors dues vegades sobre el residu del filtre, combineu el filtrat i concentreu-vos per recuperar l'etanol fins que no tingui gust d'alcohol, recolliu l'extracte i l'assequeu per obtenir extracte cru de salsa cistanche 19.46 g.

2. 1. 1. 2 Procés de purificació

Col·locar 10 g de l'extracte cru de salsa de cistanche en un vas, afegir 20 ml d'aigua per dissoldre en ultrasò, afegir 80 ml d'etanol absolut, agitar bé i col·locar-lo durant 12 hores i després fer filtració, el filtrat es va concentrar per recuperar l'etanol fins que no hi hagi gust d'alcohol, i liofilitzat per obtenir 8.408 g del glicòsid total de l'extracte de salsa de cistanche.

2. 1. 2 Agrupació i administració d'animals

72 ratolins van ser alimentats adaptativament durant 2 dies abans de l'experiment i es van dividir aleatòriament en 6 grups, cadascun amb 12 ratolins, és a dir, un grup de control en blanc, un grup model de lesions hepàtiques alcohòliques i un grup de control positiu (bidentat de 150 mg / kg), glicòsid total del grup de dosis baixes de salsa cistanche (130 mg / kg), el glicòsid total del grup de dosi mitjana de salsa de cistanche (100 mg / kg) i el glucèid total del grup de dosis baixes de salsa de cistanx (65 mg / kg). Als animals de cada grup se'ls donava administració intragàstrica (ig) dues vegades al dia, i el volum ig era de 0,2 ml/20 g de pes corporal. El grup de control en blanc i el grup de models van rebre els mateixos volums de salina. Dues hores després de cada administració, a excepció del grup de control en blanc, els altres grups van rebre licor de 56° a 0,4 ml/ 20 g de pes corporal durant 10 dies consecutius per causar un model de lesió hepàtica alcohòlica aguda. El dia 9 de l'edifici model, no es va permetre el dejuni. El dia 10 es va donar vi blanc de 56° durant 3 hores. Els globus oculars es prenia sang i el sèrum estava separat. Després de la recollida de sang, els ratolins van ser sacrificats. Pesa, pren el lòbul adequat del fetge i col·loca'l en una solució fixant al 10% de formaldehid, i col·loca la resta del fetge en un refrigerador a -20 °C.

2. 1. 3 Tractament estadístic

Utilitzar programari estadístic SPSS 11.5 per processar dades, anàlisi de variància, P<0.05 is="" statistically="">

2. 1. 4 L'efecte del glucóssid total de la salsa de cistanche sobre el pes corporal, el pes hepàtic i l'índex hepàtic de lesió hepàtica alcohòlica aguda en ratolins

Com es mostra a la taula 1, el pes hepàtic i l'índex hepàtic dels ratolins del grup model van ser significativament més alts que els del grup de control en blanc (P<0.05), indicating="" liver="" damage.="" compared="" with="" the="" model="" group,="" the="" liver="" weight="" and="" liver="" index="" of="" mice="" in="" the="" total="" glycoside="" of="" the="" cistanche="" salsa="" high-dose="" group="" and="" the="" positive="" control="" group="" were="" significantly="" reduced="" (p=""><0.01). there="" was="" no="" significant="" difference="" between="" the="" total="" glycoside="" of="" cistanche="" salsa="" medium="" and="" low-dose="" groups="" (="" p="">0.05).

2. 1. 5 L'efecte del glicòsid total de la salsa de cistanche sobre el sèrum AST i ALT

La sang recollida es va centrifugar a 3,5×103 r /min durant 10 minuts per preparar el sèrum. Utilitzant el mètode de Lai, es va utilitzar l'espectrofotòmetre UV-Vis lectures de 505 nm per determinar l'activitat d'ALT i AST en sèrum. Com es mostra a la taula 2, el sèrum ALT i AST del grup de models van ser significativament més alts que els del grup de control en blanc (P<0.05), indicating="" that="" the="" model="" group="" was="" successfully="" modeled.="" the="" serum="" alt="" and="" ast="" of="" mice="" in="" the="" positive="" control="" group="" were="" significantly="" lower="" than="" those="" in="" the="" model="" group=""><0.01). compared="" with="" the="" model="" group,="" the="" serum="" alt="" and="" ast="" of="" mice="" in="" the="" total="" glycoside="" of="" the="" cistanche="" salsa="" high-dose="" group="" were="" significantly="" lower=""><0.01). there="" was="" no="" significant="" difference="" between="" the="" total="" glycoside="" of="" the="" cistanche="" salsa="" middle="" and="" low="" dose="" group="" and="" the="" model="" group="" (p="">0.05).

2. 1. 6 L'efecte del glicòsid total de la salsa de cistanche en el contingut de MDA i l'activitat de SOD al fetge

Prendre 0,3 g de teixit hepàtic per preparar 10% i 1% homogeneïtzats. Centrífuga l'1% d'homogeneïtzació hepàtica amb 3,5 × 103 r/min durant 10 min i prendre el sobrenatant. La solució, la proteïna en l'homogenat hepàtic va ser determinada pel mètode Coomassie Brilliant Blue. Prendre 1% de supernedant homogenat hepàtic, operar d'acord amb la caixa de prova SOD, i llegir a 450 nm en el lector de microplata. Prendre un 10% de supernedant homogenat hepàtic, operar d'acord amb el kit de determinació de MDA, i mesurar l'absorbància (A532) amb un espectrofotòmetre a 532 nm.

Com es mostra a la taula 3, el contingut de MDA al fetge del grup model era significativament superior al del grup de control en blanc (P<0.05), and="" the="" sod="" activity="" was="" significantly="" reduced=""><0.05). compared="" with="" the="" model="" group,="" the="" mda="" content="" in="" the="" liver="" of="" the="" positive="" control="" group="" was="" significantly="" lower=""><0.01), and="" the="" activity="" of="" sod="" was="" significantly="" increased=""><0.01). compared="" with="" the="" model="" group,="" the="" mda="" content="" of="" the="" total="" glycoside="" of="" the="" cistanche="" salsa="" high-dose="" group="" was="" significantly="" lower=""><0.01), and="" the="" activity="" of="" sod="" was="" significantly="" increased=""><0.01). the="" total="" glycoside="" of="" cistanche="" salsa="" medium="" and="" low="" dose="" groups="" had="" no="" difference="" in="" mda="" and="" sod="" compared="" with="" the="" model="" group="" (p="">0.05).

2. 1. 7 L'efecte del glicòsid total de la salsa cistanche sobre els canvis patològics del teixit hepàtic en ratolins

Examen patològic: teixit hepàtic fixat amb 10% de formaldehid, secció convencional incrustada en parafina (gruix de llesca 5 μm), tinció he i observació de canvis histopatològics hepàtics sota el microscopi de llum.

El fetge del grup de control en blanc és de color vermell fosc i de textura suau. L'estructura del teixit hepàtic és normal i l'estructura dels lòbuls hepàtics està intacta. És poligonal amb límits clars, i el nucli és rodó i clarament situat al centre de la cèl·lula. El volum hepàtic dels ratolins en el grup model i el glicòsid total dels grups de dosi mitjana i baixa de cistanche van augmentar i el color es va tornar groc. Els canvis patològics sota el microscopi van ser principalment la degeneració grassa dels hepatòcits, amb vacúols lipídics difusos i hepatòcits a les cèl·lules. Gran, el citoplasma està ple de petites gotetes lipídiques i vacúols, i el nucli encara està al centre. En el grup de control positiu i el glicòsid total del grup d'altes dosis de salsa cistanche, la lipidosi de les cèl·lules hepàtiques en ratolins es va reduir fins a cert punt, i el nombre de gotetes lipídiques es va reduir fins a cert punt.

2. 2 Anàlisi de components principals del glicòsid total de la salsa de cistanche

2. 2. 1 Condicions cromatogràfiques

Les condicions cromatogràfiques eren la columna cromatogràfica ZORBAX ODS (250×4,6 mm, 5μm); fase mòbil: metanol 0,2% solució d'àcid fòrmic (27,5∶72,5), elució del gradient; temperatura de la columna 30 °C; cabal 1 ml/min; longitud d'ona de detecció 334 nm. En les condicions cromatogràfiques anteriors, la separació deequiinacòsidiacteosideés bo.

2. 2. 2 Preparació de la solució de referència

Pesa amb precisió 1,3 mg i 1,2 mg deequiinacòsidiacteosidesubstància de referència per preparar solució de referència d'equiinacòids 0,13 mg / ml i solució de referència acteoside 0.12 mg / ml.

2. 2. 3 Preparació de la solució de prova

Pesa amb precisió 0,1082 g del glicòsid total de l'extracte de salsa de cistanche i dilueix a 50 ml amb la solució de fase mòbil.

2. 2. 4 Relació lineal

Dibuixa amb precisió la solució de referència 0. 06, 0. 12. 0. 18. 0. 24. 0. 30, 0. 48. 0. 54. 0. 72. 1. A 20 mg/ml, injecteu 5 μL a la cromatografia líquida en seqüència, i calculeu l'equació de regressió amb el volum d'injecció (μg) de les dues substàncies de referència com l'abscissa i l'àrea pic corresponent com a ordinat. equiinacòsid: Y = 11,868 X-0,0785, R = 0,9997; acteoside: Y = 18.026X-0.1913, R = 0.9997. Com a resultat, la substància de referència equiinacòsid té una bona relació lineal en el rang de 0,0635 a 0,4445 μg; la substància de referència acteòsides es troba en el rang de 0,059 a 1,18 μg La relació lineal interna és bona.

2. 2. 5 Prova de precisió

Dibuixa amb precisió 10 μL de la mateixa solució de prova, i repeteix la injecció 5 vegades sota les condicions cromatogràfiques anteriors. Enregistra el cromatograma i determina l'àrea de pic. El resultat és l'RSD d'equiinacòside 0,89%,RSD deés de l'1,87%, la qual cosa indica que la precisió de l'instrument és bona.

2. 2. 6 Prova d'estabilitat

La mateixa solució de prova, respectivament, a 0, 2, 4, 8, 16, 32, 40, 48 h, dibuixar amb precisió 10 L, injectar-lo al cromatògraf líquid, registrar el cromatograma i mesurar la seva àrea màxima. El resultat és el RSD d'echinacoside 1. 58%, el RSD deacteosideÉs 0. 49%, indicant que la solució de prova és dins de 48 hores

L'estabilitat és bona.

2. 2. 7 Prova de repetibilitat

Pesa amb precisió al voltant de 0,2 mg del mateix lot de mostres, 5 parts en total, i preparar 5 parts de la solució. D'acord amb el mètode de determinació del contingut, amb precisió pipe 10 μL en el cromatògraf líquid, registrar el cromatograma, i determinar l'àrea de pic. El resultat és echinacoside L'RSD de l'1,91% i el RSD de Verbascum glicòsids eren 2.08%, el que indica que el mètode de determinació té una bona repetibilitat.

2. 2. 8 Prova de taxa de recuperació

Pesen amb precisió 0,2 g deglucèuid total de salsa cistanche, afegiu una certa quantitat deechinacoside i acteosidesubstàncies de referència, respectivament, prepareu la solució de prova d'acord amb el mètode sota 2.2.3 anterior i realitzeu la determinació segons el mètode de determinació del contingut en les condicions cromatogràfiques especificades. El resultat La taxa mitjana de recuperació d'equiinacòsid és de 98. 49%, RSD 1. 06%, la taxa mitjana de recuperació de l'acteoside és del 97,35%, i l'RSD és de l'1,45%.

2. 2. 9 Determinació de mostres

Dibuixa amb precisió 10 μL cadascuna de les solucions de referència i la solució de prova, injecta la mostra, determina les condicions cromatogràfiques anteriors i calcula el contingut de la mostra pel mètode estàndard extern. Els resultats es mostren a la Taula 4 El contingut mitjà de l'equiinacos és del 24,5%, i el contingut mitjà deacteosideés del 4,6%.

3 Discussió

El dany hepàtic alcohòlic es refereix al dany hepàtic i una sèrie de canvis patològics causats pel consum excessiu d'alcohol a llarg termini. La ingesta excessiva d'alcohol a llarg termini pot causar danys a les cèl·lules hepàtiques, i després desenvolupar fibrosi hepàtica i fins i tot cirrosi hepàtica. En comparació amb el grup model, el glicòsid total del grup d'altes dosis de salsa cistanche en aquest experiment va reduir significativament l'activitat d'ALT i AST en el sèrum del ratolí, va reduir significativament el contingut de MDA al fetge i va augmentar significativament l'activitat de SOD, que va reduir la lipidosi de les cèl·lules hepàtiques fins a cert punt. , Reduir el nombre de gotetes lipídiques. No hi va haver diferències significatives entre el grup de dosis mitjanes i baixes i el grup model. Els resultats d'aquest experiment són coherents amb els resultats de la recerca de laefecte rotectiu dels glucedes totals de Cistanche sobre lesió hepàtica alcohòlica en ratolins[7].

El glicòsid total de la salsa cistanche protegeix el dany de les cèl·lules hepàtiquesreduint la permeabilitat de la membrana cel·lular i augmentant el contingut d'ALT i AST alliberats a la sang; pot augmentar l'activitat de SOD i eliminar un gran nombre de radicals lliures produïts per l'alcohol en el metabolisme del cos. ; Pot reduir la formació de MDA i evitar que danyi l'estructura de la membrana de les cèl·lules del teixit[8-10]. El glucosas total de la salsa cistanche té un efecte protector sobre la lesió hepàtica alcohòlica, i hi ha una relació d'efecte quantitatiu. Comprovant la literatura, no hi ha anàlisi quantitativa dels principis actius del glicòsid total de la salsa de cistanche. En aquest document, el contingut deacteosideiequiinacòsid, els principals components del glicòsid total de la salsa de cistanche, va ser analitzat quantitativament per primera vegada per HPLC, que va representar el 29,1% del total de glucedes. Proporcionar una base científica per al desenvolupament i la utilització del glicòsid total de la salsa de cistanche. Estudis farmacològics moderns han trobat que l'equiinacòsid té un efecte protector sobre les cèl·lules PC12 danyades pel peròxid d'hidrogen i el dany per estrès oxidatiu en rates de demència vascular. AmbdósL'equiinacòsid i l'acteòdid tenen efectes inhibidors sobre la citotoxicitat dels hepatòcitsinduït per D GalN i TNF-α [13]. A més, s'especula que elel glicòsid total de la salsa cistanche protegeix els ratolins d'una lesió hepàtica alcohòlicaEs pot millorar ambechinacoside i acteosideper millorar l'activitat enzimàtica antioxidant cel·lular, millorar la capacitat antioxidant de les cèl·lules hepàtiques, mantenint així la integritat de la membrana plasmàtica de les cèl·lules hepàtiques, de manera que les cèl·lules hepàtiques puguin funcionar normalment funcions defensives i compensatòries. Aïllarem encara més els compostos en futurs estudis i utilitzarem tècniques de biologia molecular per estudiar la regulació dels compostos monòmèrics sobre l'apoptosi de cèl·lules hepàtiques i la seva relació amb la regulació de gens diana relacionats.

Referències

1 Zhang HW. Estudis sobre constituents químics i

Empremta digital de la salsa Cistanche (C. A. Mey.) G. Beck. Ho hot: Inner Mongolia Medical College, MSc. 2008.

2 Tian XF, Pu XP. Els neccòsids fenil·losoïdals de la salsa Cistanches inhibeixen l'apoptosi induïda per l'ió ió piridini fenil de metil en les neurones. J Ethnopharmacol, 2005, 97: 59-63.

3 Wang XW, Jiang XY, Wu LY. Efectes carronyaires dels glucòsids de Cistanche sobre els radicals lliures i la seva protecció contra el dany de l'ADN in vitro de la Xina Pharm J, 2001, 36: 29-32.

4 Wu HH. Preparació i activitat antioxidant dels glucosasids fenitohanoides de la salsa Cistanche. Nanjing: Universitat Agrícola de Nanjing, MSc. 2008.