Efectes protectors i mecanismes de les procianidines sobre la malaltia de Parkinson in vivo i in vitro Part 2

Siusplau contactaoscar.xiao@wecistanche.comper a més informació

2.7.Efectes dels ordinadors sobre l'estrès oxidatiu del peix zebra Larae tractat amb MPTP

El tractament de larves de peix zebra amb PC va disminuir la formació de ROS intracel·lular induïda per MPTP (figura 7a, b). A més, els resultats de l'assaig de peroxidació lipídica van mostrar que l'exposició a PC (16 ug/mL) va bloquejar els nivells de MDA induïts per MPTP a les larves de peix zebra (figura 7c). A més, la reducció de l'activitat GSH-Px induïda per MPTP es va revertir amb el tractament amb PC (16 ug/mL) (Figura 7d) i els PC (4, 8 i 16 ug/mL) van augmentar les disminucions induïdes per MPTP en CAT i SOD activitat (figura 7e, f).

Figure 7. Effects of PCs on oxidative stress of zebrafish larvae treated with MPTP. (a)ROS levels were measured by fluorescent microscopy and imaging analysis;(b)ROS levels were measured via imageJ software;(c) MDA levels;(d) GSH-Pxactivity;(e)CATactivity;(f) SOD activity. F and p values of the one-way analysis of variance are presented above each chart.The results of Tukey's post hoc test are presented for selected comparisons: ns, p>0.05;*,p<><0.01;***, p=""><0.001; the="" error="" bars="" are="">

Feu clic aquí per obtenir més informació

2.8. Efectes dels ordinadors a Nr2/ARE Patlhroay a Laroa del peix zebra induït per MPTP

El tractament de les larves de peix zebra amb PC va subratllar la premissa que l'activació de les vies Nr2/ARE estava implicada en les propietats protectores mediades per PC. L'expressió dels marcadors Nrf2, HO-1, NQO1, GCLC i GCLM es va regular amb el tractament amb PC en comparació amb l'exposició a MPTP sola (figura 8a-e).

Figure 8. Effects of PCs on Nrf2/ARE pathway in MPTP-induced zebrafish larvae. (a) Nrf2 levels;(b)HO-1 levels;(c)NQO1 levels;(d) GCLClevels;(e) GCLM levels. F and p values of the one-way analysis of variance are presented above each chart. The results of Tukey's post hoc test are presented for selected comparisons: ns,p>0.05;*,p<><><0.001:the error="" bars="" are="">

3. Discussió

Els PC presenten una forta capacitat d'eliminació de radicals i activitat antioxidant, i l'estrès oxidatiu, causat per la generació excessiva de ROS o/i el deteriorament del sistema de defensa antioxidant, té un paper crític en la MP[37-39]. Tanmateix, encara no està clar si els PC poden tenir un paper neuroprotector mitjançant efectes antioxidants. Aquesta investigació tenia com a objectiu investigar el mecanisme molecular de les PC contra els models de PD induïts per MPP més /MPTP.

Cistanche pot millorar la immunitat

En aquest estudi, en comparació amb el grup MPP plus / MPTP sol, els ordinadors van augmentar notablement el nivell d'activitat dels enzims antioxidants (inclosos GSH-Px, CAT i SOD) i van disminuir els nivells de ROS i MDA. Les troballes actuals són coherents amb un estudi anterior que suggereix que un suplement baix de PC mitjançant la dieta millora les activitats de GSH-Px, CAT i SOD en garrins deslletats [40]. Un altre estudi també suggereix que els ordinadors augmenten significativament les activitats CAT i SOD i disminueixen el contingut de MDA, millorant així la qualitat de l'esperma de cabra[41]. Aquestes troballes suggereixen que els PC tenen un efecte protector sobre el dany oxidatiu de les cèl·lules nervioses. A més, els ordinadors van millorar la viabilitat cel·lular en comparació amb el grup MPP plus sol en cèl·lules PC12 induïdes per MPP més, van augmentar notablement la distància total desplaçada i van disminuir la densitat cel·lular de TH més en relació al grup MPTP en larves de peix zebra induïdes per MPTP. Aquestes dades indiquen que els PC tenen un efecte protector sobre les cèl·lules nervioses.

A més, vam observar que els PC van augmentar significativament l'acumulació nuclear de Nrf2 en comparació amb la de MPP més sols a les cèl·lules PC12. De fet, els ordinadors van augmentar notablement els nivells d'expressió de NQO1, HO-1, GCLM i GCLC[42]. A més, es va utilitzar el silenciament de Nfr2gene mitjançant Nrf2 siRNA per investigar el paper de l'activació de Nrf2/ARE en la neuroprotecció mediada per PC contra el dany oxidatiu induït per MPP més: les cèl·lules transfectades amb Nrf2-siRNA van indicar una disminució marcada de l'expressió de Nrf2. Aquest estudi actual també va trobar que l'eliminació de Nrf2 va abolir tant la protecció mediada per PC contra les deficiències tractades amb MPP més en la viabilitat cel·lular com els efectes antioxidants dels PC. Aquests resultats són coherents amb un estudi anterior que suggereix que la millora de l'activació de la via Nrf2/ARE contribueix a la neuroprotecció [43].

La via Nrf2/ARE és una via antioxidant important [44-46]. Normalment, Nrf2 resideix al citoplasma, on està unit a la proteïna inhibidora, Keapl [47,48]. Quan les cèl·lules pateixen estrès oxidatiu, Nrf2 es dissocia de Keap1, inicia el sistema endògen de defensa antioxidant i, posteriorment, es trasllada al nucli [46,49,50]. A continuació, interacciona amb ARE per activar una sèrie de gens protectors i antioxidants de les cèl·lules, inclosos GCLC, GCLM, NQO1 i HO-1 [51-54]. En resposta a l'estrès oxidatiu, Nrf2 es dissocia de Keap1 al citosol i després es transloca al nucli, unint-se a la seqüència ARE per activar la transcripció dels gens crioprotectors [53-58]. Els resultats actuals indiquen que els PC poden activar la via Nrf2/ARE, transferir Nrf2 del citoplasma al nucli, acumular-se al nucli, regular l'expressió de GCLC, GCLM, NOO1 i HO-1 i millorar la capacitat de cèl·lules per resistir l'estrès oxidatiu. De fet, la via Nrf2/ARE pot representar un objectiu farmacològic dels PC per a la prevenció de la MP.

4. Materials i Mètodes

4.1. Compostos i reactius químics

Els agents MPP plus i MPTP es van comprar a Sigma (St. Louis, MO, EUA) i el kit de recompte de cèl·lules-8 es va obtenir a Beyotime (Xangai, Xina). Els kits de diagnòstic PC, 2', 7/-Diclorofluorescina, MDA, GSH-Px, SOD i CAT es van obtenir de Solarbio (Beijing, Xina). El kit de reactius RNAiso Plus, PrimeScriptTMRT amb gDNA Eraser i SYBRPremix Ex TaqTMⅡI es van comprar a Takara (Shiga, Japó); el Nrf2-siRNA, control-siRNA i Lipofectamine 2000 es van obtenir de GenePharma (Xangai, Xina). Finalment, els anticossos primaris, Nrf2, HO-1, GCLC, GCLM, NAD(P)H: NQO1, Lamin B, GAPDH, Antitirosina Hidroxilasa (TH) i els anticossos secundaris corresponents es van obtenir de Proteintech (Wuhan, Xina). ).

4.2.Cultura cel·lular

Les cèl·lules PC12 es van obtenir de la National Collection of Authenticated Cell Cultures. Les cèl·lules es van mantenir en DMEM complementat amb sèrum boví fetal al 10% i penicil·lina-estreptomicina (100 U/ml; 100 ug/ml) en una incubadora d'atmosfera humidificada a 37 graus amb un 5% de CO2 [59].

4.3. Assaig de viabilitat cel·lular

Les cèl·lules PC12 (1 × 104 cèl·lules/pou) es van incubar amb 1,2 o 4ug/mLof PCsor deprenvl （30 μM） durant 24 h i després es van incubar amb 1,5 mM MPP plus durant 24 h. A continuació, es van afegir 10 μL de solució del kit de recompte de cèl·lules-8 a cada pou i es van incubar durant 1 h. L'absorbància es va mesurar a 450 nm [60].

4.4. Manteniment del peix

L'aprovació ètica per a l'ús d'animals va ser atorgada pel comitè de conservació i ús d'animals del centre d'animals experimentals de la Universitat de Zhejiang (ZJU20200125). El peix zebra adult (soca AB) es va obtenir del centre d'animals de laboratori de la Universitat de Zhejiang (Hang Zhou, Xina) i es va mantenir a 28 ± 1 grau sota cicles de 14 hores de llum/10 hores de foscor. Els peixos van ser alimentats amb nauplis Artemia dues vegades al dia [61]. Per produir embrions, els peixos zebra adults es van col·locar en tancs de cria durant la nit amb una proporció 1:1 mascle: femella. El desove es va activar després que els llums es van encendre l'endemà al matí i es van completar en 2 h. Els embrions es van criar en aigua embrionària (13,7 mM NaCl, 540 μM KCl, 25 uM Na2HPOA44 uM KHPOA, 300 uM CaCl2, 100 μM MgSO, 420 μM NaHCO3, pH 7,4） a 【286e, 【286e).

4.5. Mesura ROS

Per mesurar la producció de ROS, les cèl·lules PC12 (2 × 104 cèl·lules/pou) es van exposar a 1,2 o 4 ug/mL de PCs o deprenyl （30 μM） durant 24 h i després es van incubar amb 1,5 mM MPPt durant 24 h 【64】. Les cèl·lules es van exposar a una solució de diacetat de 2',7'-diclorofluorescina 10 μM en condicions fosques durant 30 min; A continuació, es va eliminar la solució de colorant i es van rentar les cèl·lules amb solució salina tamponada amb fosfat (PBS) 3 vegades. Les imatges de les cèl·lules es van observar mitjançant un microscopi confocal d'escaneig làser Olympus (Olympus, capital de Tòquio, Japó). La intensitat de fluorescència de les cèl·lules es va quantificar mitjançant el programari Image J v1.8.0 (Olympus, capital de Tòquio, Japó). Els resultats s'expressen com a percentatge de l'àrea de les regions ROS del grup control.

Per mesurar la producció de ROS, les larves de peix zebra als 3 dies després de la fecundació (dpf) es van exposar a deprenil (40 μM) o 4,8 o 16 ug/mL de PC amb o sense 400 μM MPTP durant 4 dies. Les larves de peix zebra a 7 dpf es van transferir a una placa de pou 24-(10 larves per grup), es van tractar amb una solució de diacetat de 2',7'-diclorofluorescina 20 μM i es van incubar durant 60 minuts a la foscor a 28,5 graus [65]. ]. A continuació, es van rentar les larves tres vegades amb medi embrionari per eliminar l'excés de diacetat de 2',7'-diclorofluorescina. Les imatges de les larves tacades es van observar mitjançant un microscopi confocal d'exploració làser Olympus. La intensitat de fluorescència de la larva individual es va quantificar mitjançant el programari Image J. Els resultats s'expressen com a percentatge de l'àrea de les regions ROS del grup control. 4.6.Avaluació de MDA, GSH-Px, SOD i CAT

Les cèl·lules PC12 (2 × 104 cèl·lules/pou) es van exposar a 1, 2 o 4 ug/ml de PCs o deprenyl (30 μM) durant 24 hores, i després es van incubar amb 1,5 mM MPP més durant 24 hores. A continuació, es va afegir 1 ml d'extracte a cèl·lules de 4 × 10 graus i es van trencar les cèl·lules mitjançant centrifugació ultrasònica a 8000 rpm a 4 graus durant 10 min. A continuació, el sobrenedant es va posar en gel per a la prova i es van afegir reactius per a la determinació de MDA, GSH-Px, SOD i CAT, respectivament. Cada índex es va repetir per triplicat.

Les larves de peix zebra a 3dpf es van incubar amb deprenyl (40 μM) o 4,8 o 16 ug/mL de PC amb o sense 400 μM MPTP durant 4 dies. A continuació, es van homogeneïtzar 0, 05 g de teixit de larves de peix zebra i 0, 5 ml d'extracte en un bany de gel i després es van centrifugar a 4 graus durant 10 min. El sobrenedant es va posar en gel per a la prova. Posteriorment es van afegir reactius per a la determinació de MDA, GSH-Px, SOD i CAT, respectivament. Cada índex es va repetir per triplicat.

4.7. Preparació de proteïnes cel·lulars, citoplasmàtiques i nuclears

Per a l'extracció de proteïnes de cèl·lules senceres, les cèl·lules es van recollir i incubar amb un tampó de lisi RIPA que contenia un 1% de PMSF i un còctel d'inhibidor de proteasa durant 30 min durant 30 min. Es van centrifugar els lisats cel·lulars i es va recollir i emmagatzemar el sobrenedant. Per a la preparació del fraccionament subcel·lular, les mostres de cèl·lules es van processar mitjançant el kit d'extracció de proteïnes nuclears i citoplasmàtiques. El contingut de proteïnes es va analitzar mitjançant l'assaig BCA (Beyotime, Xangai, Xina).

4.8. Transfecció de siRNA Nrf2

Nrf2-siRNA es va utilitzar per eliminar Nrf2. Les cèl·lules PC12 es van transfectar amb Nrf2-siRNA (80 nM) o control-siRNA mitjançant Lipofectamine 2000, segons el manual. 4.9.Western Blotting

Les mostres de proteïnes es van resoldre mitjançant SDS-PAGE i es van transferir a membranes de difluorur de polivinilidè (PVDF). Les taques es van exposar a anticossos primaris adequats: Nrf2, Keap1, HO-1, NQO1, GCLC, GCLM, Lamin B, GAPDH i anticossos secundaris conjugats amb peroxidasa. Les bandes de proteïnes es van visualitzar mitjançant ECL (Beyotime, Xangai, Xina) més reactius de detecció de Western Blotting [36, 43].

4.10.Prova de comportament locomotor

Les larves de peix zebra a 3dpf es van incubar amb deprenyl (40 μM) o 4,8 o 16 ug/mL de PC amb o sense 400 uM MPTP durant 4 dies. Els 7 peixos zebra dpf es van col·locar a 24-plaques de pou (1 peix per pou i 12 larves per grup) i es va registrar la distància total que cada peix va nedar durant 10 minuts. El comportament del peix zebra es va controlar i analitzar mitjançant un sistema de seguiment de vídeo automatitzat (Any-Maze 4.73, Stoelting, Wood Dale, IL, EUA)[66].

4.11. Extracció total d'ARN, transcripció inversa i reacció quantitativa en cadena de la polimerasa en temps real

L'ARN es va extreure mitjançant RNAiso Plus seguint les instruccions del fabricant. L'ARN es va transcriure inversament mitjançant un kit de reactius PrimeScriptTMRT amb gDNA Eraser, seguint les instruccions del fabricant. Es va realitzar una anàlisi quantitativa de PCR en temps real en un sistema de PCR en temps real Applied Biosystems ViATM 7 mitjançant SYBRPremix Ex TaqTM II (Takara, Shiga, Japó). -actina es va utilitzar com a gen de referència i es va calcular l'expressió gènica relativa mitjançant el mètode 2-△Ct. Les seqüències d'imprimació utilitzades en la investigació es mostren a la taula 1.

4.12. Peix zebra Antitirosina Hidroxilasa (TH) Immunotinció de muntatge sencer

Les larves de peix zebra a 1 dpf es van incubar amb deprenyl （40 μM） o 4,8 o 16 ug/mL de PC amb o sense 400 uM MPTP durant 2 dies (10 lots de peixos/grup). Les larves es van fixar amb un 4% de paraformaldehid en PBS durant 30 min. Després de la fixació, es van tractar per a la immunotinció de muntatge complet de TH [67]. A temperatura ambient, el sèrum de xai al 2% (v/o) i el 0,1% (p/ø) d'albúmina sèrica bovina (BSA) es van bloquejar en Tween{16}} (PBST) de solució salina tamponada amb fosfat durant 1 h. Després es van exposar al tampó de bloqueig a antitirosinaAnticòs hidroxilasa (1:200 diluït, Proteintech) durant 2 h, i després esbandida 6 vegades amb PBST. El pas final d'immunotinció de muntatge complet es va realitzar en tampó de tinció amb 488 anticonill de cabra (1:500) durant 1 h i es va rentar de nou amb PBST. Després d'un desenvolupament suficient del color, els peixos zebra es van muntar de forma plana amb un 3,5 per centmetilcel·lulosai es va fotografiar amb un microscopi confocal d'escaneig làser Olympus.

4.13. Anàlisi estadística

Es va utilitzar l'anàlisi unidireccional de la variància (ANOVA) seguida de la prova de comparació múltiple de Tukey per comparar les mitjanes de diferents grups. Es va utilitzar Graphpad Prism v6.01 (GraphPad Software, San Diego, CA, EUA) per a l'anàlisi estadística i el dibuix dels gràfics.

5. Conclusions

En conclusió, els nostres resultats indiquen que els PC exerceixen efectes neuroprotectors mitjançant l'activació de la via Nrf2/ARE i la seva aigües avall.desintoxicacióiantioxidant enzims. En conjunt, aquestes idees suggereixen que els ordinadors poden ser útils per tractar la PD.

Aquest article està extret de Molecules 2021, 26, 5558. https://doi.org/10.3390/molecules26185558 https://www.mdpi.com/journal/molecules