Efectes protectors de la nova decocció de Wenshen Shengjing sobre el deteriorament de la síntesi de testosterona i l'apoptosi espermatogènica induïda per ciclosporina
Mar 03, 2022
Contacte: Audrey Hu Whatsapp/hp: 0086 13880143964 Correu electrònic:audrey.hu@wecistanche.com
XIAOYAN PAN , XIYAN WANG , XUENAN WANG , WANSHENG ZHANG4 , ZHANXUAN SUN1 , XUAN XUAN LIANG , XUE ZHANG , WENJUN LI i ZHIXIN LI
Resum
El present estudi tenia com a objectiu investigar els efectes protectors potencials de la nova decocció de Wenshen Shengjing (nou WSSJD; incloent Cornu Cervi Nippon Parvum, Panax ginseng, solàrium Cynomorium,Cistanche deserticola, Radix Astragali, Epimedium brevicornum i Angelica Sinensis) sobre el deteriorament de la síntesi de testosterona i l'apoptosi espermatogènica induïda per ciclosporina en ratolins. Un total de 90 ratolins Kunming mascles adults es van dividir en els 6 grups següents: control (sense intervenció), dimetilsulfòxid (DMSO; només va rebre DMSO), ciclosporina A (CSA), citrat de clomifè (CC; CsA més CC, 15 mg/kg). /dia), WSSJD (CsA més WSSJD, fàrmac brut 12 g/kg/dia) i nou WSSJD (CsA més WSSJD nou, fàrmac brut 12 g/kg/dia). Tots els ratolins van ser tractats durant 30 dies mitjançant sonda oral. Els testicles es van fixar i tenyir posteriorment amb hematoxilina i eosina per avaluar el desenvolupament d'epiteli seminífer. Es van utilitzar tècniques immunohistoquímiques per detectar l'expressió del receptor de l'hormona luteïnitzant (LHR) i la divisió de la cadena lateral P450 (P450scc) a les cèl·lules de Leydig testiculars. A més, es va detectar l'apoptosi de cèl·lules espermatogèniques als testicles mitjançant un assaig d'etiquetatge dUTP mediat per desoxinucleotidil transferasa i es va utilitzar citometria de flux per analitzar la taxa de supervivència i l'apoptosi primerenca dels espermatozoides a l'epidídim. En comparació amb els grups CsA i CC, la nova administració de WSSJD va augmentar significativament els nivells de testosterona sèrica i les expressions de LHR i P450scc a les cèl·lules de Leydig testiculars (P).<0.05), while="" the="" apoptosis="" of="" spermatogenic="" cells="" in="" the="" seminiferous="" tubules="" and="" early="" apoptosis="" of="" mature="" sperm="" were="" significantly="" decreased=""><0.05). these="" results="" suggest="" that="" new="" wssjd="" may="" ameliorate="" csa-induced="" spermatogenic="" damage="" in="" male="" mice="" by="" enhancing="" testosterone="" synthesis="" and="" the="" secretion="" of="" testicular="" leydig="" cells,="" and="" by="" reducing="" the="" apoptosis="" of="" spermatogenic="">
Introducció
La ciclosporina A (CSA) és un agent immunosupressor d'ús comú que s'adreça específicament a les cèl·lules T i inhibeix la secreció d'interleucina-2 i augmenta dràsticament la taxa d'èxit dels trasplantaments de fetge, ronyó i còrnia, així com la taxa de supervivència de destinataris (1-3). Tanmateix, la immunosupressió induïda per l'ús a llarg termini de CsA augmenta significativament el risc de malalties cardiovasculars, infeccions i tumors malignes (4). Eid et al (5) van informar que la concentració i la motilitat dels espermatozoides estaven correlacionades negativament amb la concentració de CsA sèrica en receptors de trasplantament de ronyó masculins, cosa que suggereix que la CsA pot induir una disfunció del sistema reproductor en receptors masculins. A més, s'ha documentat que la CsA pot ser responsable de la alteració de l'espermatogènesi i el dany al sistema reproductor masculí (6).
Estudis anteriors han demostrat que la CsA va disminuir els nivells de testosterona sèrica en influir en la biosíntesi i la secreció de testosterona als testicles. He et al (7) van observar que les rates tractades amb 40 mg/kg/dia de CsA presentaven nivells significativament més alts d'hormona luteïnitzant (LH) i nivells significativament més baixos de testosterona al sèrum, la qual cosa va provocar un desenvolupament testicular deteriorat. Ali et al (8) van informar que el tractament amb CsA va disminuir l'expressió del receptor de LH (LHR) a la membrana de les cèl·lules de Leydig, que posteriorment va disminuir la síntesi de testosterona mediada per LH i la secreció de les cèl·lules de Leydig. Un altre estudi de Seethalakshmi et al (9) va informar que la CsA va disminuir els nivells de testosterona en inhibir l'activitat de la 17 alfa-hidroxilasa sense cooperar i l'activitat de la 17 -hidroxiesteroide deshidrogenasa de manera competitiva durant la biosíntesi de la testosterona, i el lloc principal per a la inhibició de la CsA va ser interrompuda l'adenosina cíclica. estimulació de monofosfats. A més, aquest informe va indicar que la disminució de la secreció de testosterona induïda per CsA a les cèl·lules de Leydig va influir directament en el desenvolupament del sistema reproductor masculí i en el manteniment de la capacitat reproductiva. Seethalakshmi et al (10) van injectar testosterona exògena a rates tractades amb CsA per augmentar els nivells de testosterona endògena. Es va observar que les dosis elevades de testosterona exògena van restaurar significativament el pes dels òrgans reproductors, els nivells sèrics d'hormona estimulant del fol·licle (FSH) i van augmentar el recompte de cèl·lules germinals, indicant així que el deteriorament de l'espermatogènesi induït per CsA es pot prevenir parcialment per l'exògena. administració de testosterona (10). Tanmateix, es va trobar que la testosterona exògena era insuficient per reparar el teixit testicular danyat, ja que la secreció de testosterona i l'espermatogènesi encara estaven influenciades per CsA, i es van observar taxes elevades d'apoptosi en espermatozoides i cèl·lules espermatogèniques (10).
La decocció de Wenshen Shengjing (WSSJD) consta de 15 medicaments a base d'herbes, que inclouen principalment Cornu Cervi Nippon Parvum, Panax ginseng, Cynomorium solarium,Cistanche deserticola, Radix Astragali, Epimedium brevicorneum i Angelica Sinensis (11). S'ha demostrat que WSSJD alleuja l'apoptosi espermatogènica induïda per ciclofosfamida (11). Per millorar encara més l'efecte terapèutic del WSSJD, el present estudi va desenvolupar un nou WSSJD basat en el mecanisme de dany al teixit testicular induït per CsA ajustant la dosi dels components del WSSJD. Els estudis farmacològics moderns han demostrat que el vellut de corna en WSSJD pot funcionar com una hormona sexual (12); Radix Astragali pot millorar la proliferació i el subministrament de nutrients de les cèl·lules de Sertoli testiculars (13), i el Panax ginseng pot disminuir els nivells d'hiperòxid testicular i inhibir l'apoptosi espermatogènica (14). Els medicaments esmentats anteriorment també poden augmentar la funció renal i augmentar el desenvolupament de cèl·lules espermatogèniques (12-14). S'ha demostrat que el citrat de clomifè (CC) exerceix un efecte terapèutic sobre la infertilitat masculina en estudis clínics anteriors (15,16). A més, el CC s'ha associat amb paràmetres de testosterona i semen millorats, i els mecanismes protectors del CC poden ser similars als de WSSJD (15,16). A més, en un estudi de Wang et al (17), el CC es va utilitzar com a control del tractament per investigar l'efecte de la medicina xinesa Shengjing sobre les alteracions de l'espermatogènesi en ratolins. En base a això, es va utilitzar CC com a control positiu en el present estudi.
En el present estudi, es va investigar el mecanisme subjacent a l'efecte protector del nou WSSJD en els teixits testiculars per determinar l'eficàcia terapèutica del medicament modificat. Elucidar el mecanisme protector pot proporcionar una base per a l'ús de nous WSSJD per millorar el dany espermatogènic induït per CsA.
Efectes de Cistanche deserticola: prevenirdany espermatogènic
Materials i mètodes
Animals. El Changchun Institute of Biological Products Co., Ltd. (Changchun, Xina) va proporcionar un total de 90 ratolins Kunming mascles (8-setmanes; 35-40 g). El present estudi es va realitzar amb l'aprovació del Comitè d'Ètica de la Universitat Mèdica de Jilin (Changchun, Xina). Els ratolins es van allotjar a 21 ± 3 °C i una humitat relativa del 55-65 per cent en un cicle de llum fosca de 12 hores. Els ratolins van tenir accés gratuït a una dieta estàndard de ratolins de laboratori i aigua estèril.
Preparació de WSSJD. Els 15 components de la medicina xinesa de WSSJD, incloent Cornu Cervi Nippon Parvum, Panax ginseng, Cynomorium solarium,Cistanche deserticola, Radix Astragali, Epimedium brevicornum i Angelica Sinensis (11), es van comprar a Tongrentang (Beijing, Xina). Aquests materials es van decoctar segons el mètode tradicional de decocció medicinal xinesa (18). En resum, es van pesar els ingredients segons la recepta i es van afegir un total de 250 ml d'aigua destil·lada per submergir les herbes. Les herbes es van remullar durant 30 minuts i posteriorment es van escalfar. Primer es van bullir les herbes durant 10 minuts i després es va reduir el foc a foc lent durant 20 minuts. Després de 30 minuts d'escalfament, la decocció líquida es va separar de les herbes, que es van decoctar amb 200 ml d'aigua destil·lada a 80 °C durant 30 minuts més. Aquest procés es va repetir i el volum final de líquid de decocció es va filtrar a través de 4-5 capes de gasa. El líquid també es va esprémer de les herbes a la decocció filtrada. La decocció es va escalfar posteriorment a 80 °C en un bany d'aigua durant 6-7 h fins que la concentració va assolir 2 g de fàrmac brut/ml, i la decocció es va emmagatzemar a 4 °C abans de l'ús. El nou WSSJD es va preparar a partir de la formulació de WSSJD amb petits ajustaments a les dosis de Panax ginseng, Cynomorium solarium, Radix Astragali i Epimedium brevicornum. El mètode de decocció era el mateix que el de WSSJD. nou WSSJD format pel següent: Panax ginseng, 6 g; Solàrium Cynomorium, 9 g; Radix Astragali, 12 g; Epimedium brevicornum, 6 g; Cornu Cervi Nippon Parvum, 1 g;Cistanche deserticola, 9 g; Angelica Sinensis, 6 g; Llavor de milkvetch de tija plana, 9 g; Rhizoma Dioscoreae, 15 g; Rizoma Atractylodes de cap gran, 6 g; Ligusticum wallichii, 3 g; Radix Paeoniae Alba, 6 g; Cinnamomum cassia, 1 g; Costustoot, 1,5 g, i Fructus Foeniculi, 3 g.
Les concentracions d'extractes de fàrmacs bruts es van determinar de la següent manera: Pes del material brut/volum final. Aquest mètode de càlcul s'utilitza àmpliament en l'estudi de la medicina tradicional xinesa (19-21). Administració de fàrmacs. Els ratolins es van dividir aleatòriament en 6 grups (15 ratolins per grup) i es van administrar amb medicaments per via intragàstrica. Els grups eren els següents: Control (solució salina normal); dimetilsulfòxid (DMSO); CsA; CC; WSSJD; i el nou WSSJD. Els ratolins dels grups CsA, CC, WSSJD i nous WSSJD es van injectar intraperitonealment (ip) amb 15 mg/kg/dia de CsA (Shanxi Powerdone Pharmaceutics Co., Ltd., Datong, Xina) durant 30 dies, tal com es va descriure anteriorment (8). ). Els ratolins dels grups control i DMSO es van sotmetre a una injecció ip diària amb un volum igual de solució salina normal o dissolvent DMSO, respectivament, durant el període experimental de 30-dia. La concentració de DMSO diluït en solució salina normal era del 3,25 per cent (v/v). El grup CC es va administrar amb 21,6 mg/kg/dia de CC (GKH Pharmaceutical, Ltd., Guangzhou, Xina) tal com es va descriure anteriorment (13), que també es va diluir en un 3,25 per cent (v/v) de DMSO (pH{{14}). }.2). Els ratolins dels grups WSSJD i nous WSSJD es van administrar amb 12 g de fàrmac brut / kg / dia de WSSJD i nou WSSJD, respectivament.Tinció d'hematoxilina i eosina (H&E). Els testicles de ratolins es van collir i es van fixar immediatament en paraformaldehid al 4 per cent (pH =7.2) a temperatura ambient durant 24 h, seguit de deshidratació amb etanol, tractament amb xilè per eliminar l'etanol, incrustació de cera i secció. Les seccions histològiques (5 µm) es van obtenir mitjançant un micròtom rotatiu. Es van col·locar a portaobjectes de vidre per a la tinció d'H&E. Es van observar seccions testiculars mitjançant microscòpia histopatològica de ressaltat per avaluar el desenvolupament de túbuls seminífers i obtenir dades histomètriques. El desenvolupament dels túbuls seminífers es va avaluar mitjançant el sistema de puntuació Johnsen (22).
ELISA. El dia 30 del tractament, els ratolins van ser anestesiats amb un 10% d'hidrat de cloral (Shanghai Guoyao Chemical Reagent Co., Ltd) a 0,004 ml/g de pes corporal ip abans de l'eutanàsia amb CO2. Es va recollir sang del tronc i el sèrum es va separar i emmagatzemar a -20 °C. Breument, la sang es va recollir en tubs d'1,5 ml i es va emmagatzemar a 4 °C durant la nit. A continuació, es va centrifugar el tub a 1.300 xg a 4 °C durant 6 min i es va recollir el sèrum. Es van utilitzar kits ELISA (Shanghai Elisa Biotech Co., Ltd., Xangai, Xina) per determinar el contingut sèric de testosterona (núm. cat. EIA-2380) i LH (núm. cat. EIA-2385 ) segons el protocol del fabricant. La densitat òptica (DO) es va determinar mitjançant un lector de microplaques Model 680 (Bio-Rad Laboratories, Inc., Hercules, CA, EUA) i es van determinar els nivells de testosterona i LH en funció de la corba estàndard.
Immunohistoquímica. Els teixits testiculars es van fixar en un 4% de formaldehid a temperatura ambient durant 24 hores i es van incrustar en parafina. Les seccions de parafina es van tallar en seccions de 5 µm i posteriorment es van desparafinar. La recuperació d'antígen es va aconseguir incubant seccions a 0.01 M tampó de citrat (pH{=6.0) a 95-98˚C durant 5 min. Les seccions es van bloquejar posteriorment amb albúmina sèrica bovina al 5% (Sigma-Aldrich; Merck KGaA, Darmstadt, Alemanya; A3675) a temperatura ambient durant 1 h. Després del bloqueig, es van incubar les seccions amb anticossos policlonals de conill contra LHR (núm. cat. L6792; Sigma-Aldrich; Merck KGaA; 1:200) o clivage de la cadena lateral P450 (P450scc; núm. cat. ab75497; Abcam, Cambridge, Regne Unit). ; 1:200) a 4˚C durant la nit a la foscor. El mètode del complex estreptavidina-biotina (SABC) es va utilitzar per detectar l'expressió de LHR i P450scc mitjançant un kit SABC (SA2010; Boster Biological Technology, Pleasanton, CA, EUA), segons el protocol del fabricant. Per als teixits aïllats de ratolins de control negatiu, l'anticossos primari es va substituir per PBS. Les cèl·lules de Leydig amb tinció groga o marró a la membrana o al plasma es van considerar cèl·lules positives per a LHR. Es van obtenir cinc diapositives de cada mostra i es van seleccionar a l'atzar cinc camps a les àrees de teixit de Leydig i es van avaluar amb un microscopi de fluorescència (ampliació, x400). La DO mitjana de les cèl·lules positives a les zones del teixit de Leydig es va obtenir mitjançant el programari Image-Pro Plus 6.0 (Media Cybernetics, Inc., Rockville, MD, EUA). Les expressions de LHR i P450scc eren proporcionals als valors de DO, amb valors de DO més alts que representaven expressions de proteïnes més altes.
Assaig d'etiquetatge de nick-end dUTP (TUNEL) mediat per desoxinucleotidil transferasa terminal (TdT). Es van disseccionar els testicles dels ratolins, es van incrustar en cera i es van seccionar. Les seccions (5-µm de gruix) es van tacar després amb el kit d'assaig TUNEL (MK1024; Boster Biological Technology), segons el protocol del fabricant. En resum, es van tenyir teixits testiculars dels grups de control (solució salina normal), DMSO, CsA, CC, WSSJD i nous WSSJD mitjançant una dilució 1:100 d'anticossos de digoxina marcats amb biotina durant 30 min a 37 °C. Es va utilitzar el teixit epitelial intersticial de rata tacat (proporcionat al kit) com a control positiu i les mostres incubades amb PBS en lloc d'anticossos de digoxina marcats amb biotina es van utilitzar com a control negatiu. La freqüència de les cèl·lules positives de TUNEL que presenten tinció nuclear verda es va avaluar mitjançant un microscopi confocal d'exploració làser. Es van avaluar un total de 10 camps aleatoris amb gran augment (x400) i es van comptar cèl·lules positives. Es va calcular el nombre mitjà de cel·les positives per camp.
Anàlisi de citometria de flux i tinció amb iodur de propidi (PI) o isotiocianat de fluoresceïna d'annexina V (FITC). L'epidídim cauda es va collir el següent sacrifici i l'epidermis es va tallar amb una fulla per alliberar l'esperma de l'epidídim en 2 ml de PBS a 37˚C per obtenir suspensions d'epidídim. Les suspensions es van incubar posteriorment a 37 °C durant 10 minuts per permetre que els espermatozoides neden fora. Les agregacions d'esperma es van descartar i es van aïllar les mostres d'esperma restants i es van tornar a suspendre en PBS per donar una concentració de 106 cèl·lules/ml. L'apoptosi espermàtica es va analitzar mitjançant un kit de detecció d'apoptosi Annexin V-FITC (Nanjing KeyGen Biotech Co., Ltd., Nanjing, Xina), segons el protocol del fabricant. En resum, 1 ml de suspensió d'esperma es va tacar amb 10 µl de PI o amb 500 µl de tampó d'unió i 5 µl d'Annexina V-FITC a la foscor durant 10 min a temperatura ambient. Les cèl·lules es van analitzar immediatament mitjançant citometria de flux Epics XL (Beckman Coulter, Inc.) i utilitzant un sistema TetraONE™ (6915050; Beckman Coulter, Inc.). Les cèl·lules en les primeres etapes de l'apoptosi es van identificar mitjançant una tinció positiva amb Annexina V i les cèl·lules necròtiques es van identificar mitjançant una tinció positiva amb PI.
Anàlisi estadística. L'anàlisi de dades es va realitzar mitjançant el programari SPSS 13.0 (SPSS, Inc., Chicago, IL, EUA) i es va expressar com la mitjana més o ± desviació estàndard tal com s'indica. Es va avaluar la importància de les diferències entre grups mitjançant una anàlisi de variància unidireccional seguida de la prova post hoc de Tukey. P<0.05 was="" considered="" to="" indicate="" a="" statistically="" significant="">
Cistanche deserticola
Resultats
Efectes del nou WSSJD sobre el desenvolupament de túbuls seminífers testiculars. Per investigar el potencial efecte protector del nou WSSJD sobre el desenvolupament de túbuls seminífers testiculars del ratolí, es va comparar la morfologia dels testicles de ratolí tenyits amb H&E sota microscòpia de llum. Els túbuls seminífers dels ratolins dels grups CsA i CC van mostrar una contracció de la franja del túbul, una disminució del diàmetre dels túbuls i una reducció de les capes d'epiteli seminífer testicular en comparació amb el control. A més, les cèl·lules espermatogèniques presentaven una disposició desordenada, el nombre de cèl·lules espermatogèniques es reduïa i es veien pocs espermatozoides madurs a la llum (Fig. 1). En els ratolins dels grups DMSO, WSSJD i nous WSSJD, eren visibles més capes d'epiteli testicular seminífer i la franja del túbul seminífer es va integrar sense contracció ni col·lapse (Fig. 1). Les puntuacions de Johnsen no difereixen significativament entre el grup DMSO i els grups control, ni entre els grups CC i DMSO. No obstant això, la puntuació de Johnsen es va reduir significativament en el grup CsA i el grup WSSJD en comparació amb el grup control, i les puntuacions dels grups WSSJD i nous WSSJD van augmentar significativament en comparació amb el grup CC o CsA (P<0.05; table="" i).="" these="" results="" indicated="" that="" new="" wssjd="" and="" wssjd="" promoted="" the="" development="" of="" seminiferous="" epithelium="" following="" csa="">
Efectes del nou WSSJD sobre la testosterona sèrica i la LH. Posteriorment es van mesurar els nivells de testosterona i LH al sèrum. Els nivells sèrics de testosterona i LH no es van veure afectats després de l'administració de DMSO. Per contra, la testosterona sèrica es va reduir significativament i la LH es va regular significativament en ratolins tractats amb CsA, en relació amb els controls (P<0.05; fig.="" 2),="" and="" new="" wssjd="" administration="" significantly="" restored="" testosterone="" to="" near="" control="" levels=""><0.05; fig.="" 2).="" for="" serum="" lh,="" the="" protective="" effects="" of="" wssjd="" were="" similar="" to="" that="" of="" cc;="" however,="" new="" wssjd="" decreased="" serum="" testosterone="" to="" a="" significantly="" lower="" level="" than="" that="" observed="" with="" cc="" and="" wssjd=""><0.05; fig.="" 2),="" suggesting="" a="" superior="" protective="" effect="" of="" new="" wssjd="" over="" cc="" or="">
Efectes del nou WSSJD sobre les expressions de LHR i P450scc. Les expressions de P450scc i LHR es van avaluar en cèl·lules de Leydig testiculars mitjançant immunohistoquímica (Figs. 3 i 4). En el grup control, LHR es va expressar a les membranes externes de les cèl·lules de Leydig entre els túbuls seminífers (Fig. 3A), i P450cc es va expressar al citoplasma de les cèl·lules de Leydig testiculars (Fig. 4A). El tractament amb DMSO no va tenir cap efecte significatiu sobre les expressions de LHR i P450scc. Per contra, el tractament amb CsA va disminuir significativament les expressions de LHR i P450scc en comparació amb els ratolins control (P<0.05; figs.="" 3b="" and="" 4b).="" in="" turn,="" the="" expressions="" of="" lhr="" and="" p450scc="" were="" significantly="" increased="" by="" treatment="" with="" cc,="" wssjd,="" or="" new="" wssjd="" compared="" with="" the="" csa="" group=""><0.05; figs.="" 3b="" and="" 4b).="" in="" addition,="" levels="" of="" lhr="" and="" p450scc="" in="" testicular="" leydig="" cells="" were="" significantly="" higher="" in="" wssjd="" and="" new="" wssjd="" mice="" compared="" with="" cc="" mice=""><0.05; figs.="" 3b="" and="" 4b),="" and="" new="" wssjd="" induced="" a="" significantly="" greater="" upregulation="" than="" wssjd=""><0.05; figs.="" 3b="" and="">
Efecte del nou WSSJD sobre l'apoptosi de cèl·lules espermatogèniques. L'apoptosi de les cèl·lules espermatogèniques als testicles del ratolí es va analitzar mitjançant un assaig TUNEL. Els nuclis de cèl·lules apoptòtiques es van observar principalment a les espermatogònies i als espermatòcits primaris (Fig. 5A). Les espermatogònies són més grans que els espermatòcits i es troben més a prop de la membrana basal (23). El tractament amb DMSO no va tenir cap efecte significatiu sobre el nombre de cèl·lules espermatogèniques apoptòtiques als testicles. Per contra, el tractament amb CsA va augmentar significativament el nombre de cèl·lules espermatogèniques apoptòtiques en comparació amb els grups control i DMSO (P<0.05; fig.="" 5b).="" in="" turn,="" administration="" of="" cc,="" wssjd,="" or="" new="" wssjd="" significantly="" reduced="" csa-induced="" apoptosis=""><0.05; fig.="" 5b).="" furthermore,="" the="" number="" of="" apoptotic="" testicular="" spermatogenic="" cells="" in="" the="" wssjd="" and="" new="" wssjd="" groups="" was="" significantly="" reduced="" compared="" with="" the="" cc="" group=""><0.05), and="" new="" wssjd="" was="" significantly="" more="" effective="" than="" wssjd=""><0.05; fig.="">
Efectes del nou WSSJD sobre la supervivència i l'apoptosi primerenca dels espermatozoides. Per verificar els efectes protectors del nou WSSJD contra l'apoptosi espermàtica induïda per CsA, es va determinar la supervivència i l'apoptosi primerenca dels espermatozoides a l'epidídim. Els espermatozoides epidídims es van tenyir amb PI o annexina V i es van analitzar mitjançant citometria de flux (Figs. 6 i 7). Després dels resultats esmentats anteriorment, el tractament amb CsA va reduir significativament el percentatge d'espermatozoides vius i va augmentar significativament el percentatge d'espermatozoides apoptòtics primerencs (P<0.05; figs.="" 6b="" and="" 7b),="" while="" dmso="" treatment="" had="" no="" effect.="" wssjd="" and="" new="" wssjd="" significantly="" increased="" the="" percentage="" of="" live="" sperm=""><0.05; fig.="" 6b)="" and="" reduced="" the="" percentage="" of="" early="" apoptosis="" sperm=""><0.05; fig.="" 7b)="" compared="" with="" csa="" treatment.="" the="" percentages="" of="" live="" and="" early="" apoptotic="" sperm="" in="" wssjd="" and="" cc="" mice="" did="" not="" differ="" significantly,="" while="" new="" wssjd="" induced="" a="" significantly="" greater="" increase="" in="" live="" sperm="" percentage="" compared="" with="" the="" cc="" group=""><0.05; fig.="" 6b)="" and="" significantly="" decreased="" the="" percentage="" of="" early="" apoptotic="" sperm="" compared="" with="" the="" cc="" and="" wssjd="" groups=""><0.05; fig.="">
Discussió
Anteriorment s'ha documentat que l'ús a llarg termini de CsA com a agent immunosupressor afecta la capacitat reproductiva (6). Xu (24) va informar que la morfologia i la vitalitat dels espermatozoides en pacients tractats amb CsA eren significativament inferiors a les d'un grup no tractat, tal com es va observar a les mostres de semen de 26 receptors de trasplantament renal tractats amb diverses dosis de CsA i 12 voluntaris sans. També es va observar que les taxes de deformitat del cap dels espermatozoides eren significativament més altes en els receptors tractats amb CsA (24). Aquests resultats van suggerir que la CsA tenia un efecte depenent de la dosi sobre els paràmetres del semen. Per tant, es garanteixen estudis per identificar nous agents farmacològics capaços d'alleujar el dany testicular induït per CsA i millorar la capacitat reproductiva masculina després del trasplantament d'òrgans.
El microambient específic del testicle afavoreix l'espermatogènesi i, per tant, el deteriorament de l'estructura i la funció testiculars pot provocar una aturada espermatogènica(25). Monteiro et al (26) van tractar rates Wistar amb CsA a una dosi de 15 mg/kg per dia durant 56 dies, i van observar una proporció volumètrica augmentada de teixit connectiu i una disminució de la proporció volumètrica de cèl·lules de Leydig en rates tractades amb CsA. També es va observar que la CsA va provocar la degeneració de l'epiteli seminífer, donant lloc a una vacuolització de cèl·lules de Sertoli, espermàtides rodones i allargades anormals i l'acumulació de citoplasma residual a la vora de l'epiteli adjacent al lumen (26). En el present estudi, els ratolins Kunming van ser tractats amb 15 mg/kg de CsA diaris durant 30 dies, cosa que va provocar una contracció i una disminució dels diàmetres dels túbuls seminífers, la reducció de les capes de l'epiteli seminífer, la disposició desordenada de les cèl·lules seminíferes, una disminució de les cèl·lules madures. espermatozoides al lumen i una puntuació de Johnsen significativament disminuïda.
A més, el tractament amb CsA va danyar greument l'estructura testicular. El present estudi també va avaluar els efectes protectors del nou WSSJD, com a nova medicina xinesa, sobre els testicles de ratolins tractats amb CsA. Es va observar que les capes epitelials testiculars seminíferes i la disposició de les cèl·lules seminíferes es van restaurar després del tractament amb nou WSSJD. A més, els ratolins del nou grup WSSJD van mostrar túbuls seminífers integrats sense contracció ni col·lapse i tenien una puntuació de Johnsen significativament més alta en comparació amb els ratolins tractats amb CsA. Aquests resultats van suggerir que WSSJD va reparar significativament el dany testicular induït per CsA, cosa que indica que aquest compost de medicina herbal pot ser un tractament eficaç en la prevenció del dany testicular induït per CsA. Si aquesta reparació cel·lular depèn o no del nínxol dins de l'epiteli també és una qüestió important, que s'hauria d'investigar en estudis futurs.
L'eix hipotàlem-hipofisi-testicular té un paper important en la regulació de l'activitat genital (27). El desenvolupament i la funcionalitat dels òrgans genitals masculins estan regulats per hormones de l'hipotàlem i les glàndules pituïtàries (28). Krueger et al (29) van tractar rates Sprague Dawley amb 25 mg/kg/dia de CsA o 40 mg/kg/dia de CsA durant 6 dies i van observar que els nivells sèrics de LH i FSH augmentaven 2-4 vegades, mentre que l'expressió de P450scc. va disminuir al 30 per cent del grup control. A més, els nivells de testosterona sèrica van disminuir significativament en ratolins tractats amb CsA, donant lloc a una espermatogènesi deteriorada (29). En el present estudi, es va demostrar que el tractament amb CsA va disminuir significativament l'expressió de LHR a les cèl·lules de Leydig. Tot i que la LH sèrica va augmentar, la disminució de l'expressió de LHR pot haver perjudicat la recuperació mediada per LH de la biosíntesi de testosterona i disminuir l'expressió de P450scc, com a enzim limitant de la biosíntesi de testosterona (30), afectant així la biosíntesi de testosterona per part de les cèl·lules de Leydig. Els nous ingredients de la nova WSSJD, com la cornamenta de pilosa, presenten efectes similars a les hormones sexuals (12), que poden millorar els nivells de testosterona sèrica i disminuir els nivells sèrics de LH, augmentant així l'expressió de LHR i p450scc a les cèl·lules de Leydig. En particular, els resultats actuals van indicar que el nou WSSJD va estimular la biosíntesi i la secreció de testosterona a les cèl·lules de Leydig per promoure l'espermatogènesi.
L'estrès oxidatiu induït per CSA i el dany testicular indueixen la displàsia dels espermatozoides i les cèl·lules espermatogèniques (31). S'ha informat que el tractament a llarg termini amb CsA danya el sistema antioxidant dels teixits testiculars dels animals, provocant una disminució dels nivells de glutatió, glutatió peroxidasa i peròxid d'hidrogen i un augment dels nivells de dialdehid malònic als testicles (31). Per tant, els nivells excessius d'espècies reactives d'oxigen en els teixits testiculars no es poden eliminar, donant lloc a la peroxidació dels lípids de la membrana espermàtica, danys a l'ADN i disminució de la vitalitat dels espermatozoides. En el present estudi, es va observar que el tractament amb CsA augmentava significativament la ruptura de l'ADN i la taxa d'apoptòtica de les cèl·lules espermatogèniques en els túbuls seminífers. La taxa de supervivència dels espermatozoides a l'epidídim també va disminuir, mentre que el percentatge d'espermatozoides apoptòtics primerencs va augmentar, cosa que indica que l'activitat espermatogènica dels testicles estava significativament danyada. Türk et al (32) van documentar que l'efecte protector de l'àcid elàgic sobre el dany testicular induït per CsA es va associar amb l'estrès oxidatiu en rates mascles. El nou WSSJD que s'utilitza en el present estudi conté diversos components antioxidants, inclòs la medicina herbal Ginseng, que prèviament s'ha demostrat que disminueix significativament els nivells d'hiperòxid als testicles (14).
En el present estudi, es van investigar els efectes del nou WSSJD sobre el deteriorament induït per CsA de la síntesi de testosterona i l'apoptosi espermatogènica, i es va observar que el nou WSSJD va disminuir significativament les taxes d'apoptòtica de les cèl·lules espermatogèniques i dels espermatozoides i, per tant, va reparar el dany al testicular seminífer. epiteli. La morfologia dels túbuls seminífers testiculars i l'apoptosi de cèl·lules espermatogèniques i espermatozoides es van investigar mitjançant histoquímica i citometria de flux. Tot i que la distribució del cicle cel·lular i la producció diària d'esperma no es van investigar, seran el focus d'estudis futurs del nostre grup.
WSSJD va augmentar significativament els nivells de testosterona als testicles i va disminuir l'apoptosi de les cèl·lules espermatogèniques i dels espermatozoides, que van reparar eficaçment el dany testicular induït per CsA. Aquests resultats indiquen que el nou WSSJD pot ser un agent farmacològic útil en el tractament i la prevenció del dany testicular induït per CsA.
Cistanche deserticola roorts sencers
Referències
1. Pedersen M i Seetharam A: Infeccions després del trasplantament hepàtic ortotòpic. J Clin Exp Hepatol 4: 347-360, 2014.
2. Vora GK i Ciolino JB: reacció d'al·lograft corneal associada a inflamació no ocular. Dígit J Ophthalmol 20: 29-31, 2014.
3. De Pasquale C, Veroux M, Indelicato L, Sinagra N, Giaquinta A, Fornaro M, Veroux P i Pistorio ML: Psychopathological aspects of kidney transplantation: Efficacy of a multidisciplinary team. World J Transplant 4: 267-275, 2014.
4. El-Gowelli HM i El-Mas MM: modulació central de la hipertensió induïda per ciclosporina. Naunyn Schmiedebergs Arch Pharmacol 388: 351-361, 2015.
5. EidMM, Abdel-Hamid IA, SobhMA i el-SaiedMA: Avaluació de les característiques del moviment dels espermatozoides en receptors de trasplantament renal infèrtil mitjançant anàlisi informatitzada. Int J Androl 19: 338-344, 1996.
6. Zahra A, Gholamreza N, Farokhi F i Shalizar Jalali A: atenuació del deteriorament de l'esperma induït per la ciclosporina i l'embriotoxicitat per l'extracte aquós de fruita de crataegus monogyna. Cel·la J 15: 198-205, 2013.
7. He Z, Qiu J, LiJ, Zhao D, Chen G i Chen L: efectes a llarg termini de la conversió de ciclosporina a rapamicina sobre la funció i la morfologia testiculars en un model de trasplantament de rata. Transplant Proc 45: 763-769, 2013.
8. AliRB, KlouzA, Boubaker S, LakhalM i BelkahiaC: Un model animal de toxicitat testicular per ciclosporina: avaluació i protecció. Fundam Clin Pharmacol 23: 241-246, 2009.
9. Seethalakshmi L, Flores C, Malhotra RK, Pallas JD, Tharakan D, Khauli RB i Menon M: el mecanisme de l'acció de la ciclosporina en la inhibició de la biosíntesi de testosterona per cèl·lules de Leydig de rata in vitro. Trasplantament 53: 190-195, 1992.
10. SeethalakshmiL, FloresC, CarboniAA i Menon M: manteniment quantitatiu de l'espermatogènesi en rates tractades amb ciclosporina mitjançant administració exògena de propionat de testosterona. J Androl 11: 491-497, 1990.
11. Pan XY, Wang XY, Wang XN, Sun ZX, Wang D, Wang X, Yang YY i Li ZX: efectes de la "decocció Wenshen Shengjing" sobre l'apoptosi cel·lular espermatogènica induïda per ciclofosfamida i la dimetilació de la histona H3K9. Xangai Zhong Yi Yao Za Zhi 48: 82-86, 2014 (en xinès).
12. Xu ZH, Li SF, Wang JY, Zhou R i Tian SJ: Extracció d'hormona sexual del vellut de corna amb CO2 supercrític. Zhongguo Zhong Yao Za Zhi 32: 2000-2003, 2007 (en xinès).
13. Zhao LP, Xu Z, Zhang M, Sun HC i Tang F: efectes de Fructus Lycii i Radix astragali sobre la funció de les cèl·lules de Sertoli als testicles de rata. Zhonghua Nan Ke Xue 13: 82-86, 2007 (en xinès).
14. Xu L, Liu XH i Zhang L: Efectes dels ginsenòsids totals sobre la capacitat d'antioxigen NO, NOS i total al testicle del ratolí. Acta Academiae Medicinae CPAPF 5: 507-508, 2006 (en xinès).
15. Patel DP, Brant WO, Myers JB, Presson AP, Johnstone EB, Dorais JA, Aston KI, Carrell DT i Hotaling JM: La seguretat i l'eficàcia del citrat de clomifè en homes hiperandrogènics i subfèrtils. Int J Impot Res 27: 221-224, 2015.
16. ElSheikh MG, Hosny MB, Elshenoufy A, Elghamrawi H, Fayad A i Abdelrahman S: combinació de vitamina E i citrat de clomifè en el tractament de pacients amb oligo idiopàtic com a azoospèrmia: un assaig prospectiu i aleatoritzat. Andrologia 3: 864-867, 2015.
17. Wang R, Xu L, Zhang WX, Wu YF, Shi JH i Zhang YX: Shengjing Granule: An Effective Chinese Medicine for Spermatogenic Disturbance in Ratolins. Zhonghua Nan Ke Xue 14: 1046-1049, 2008 (en xinès).
18. Fan BT: Chinese Medicine Pharmacy, Shanghai Science and Technology Press 12: 62-68, 1997 (En xinès).
19. Zhang J, Li H, Lu L, Yan L, Yang X, Shi Z i LiD: la fórmula Yiqi i Yangyin millora la lesió al sistema hematopoètic induïda per la irradiació corporal total. J Radiat Res 58: 1-7, 2017.
20. Minami M, Konishi T, Jiang Z, Arai T i Makino T: Efecte de Shin'iseihaito sobre la reacció al·lèrgica murina induïda per la sensibilització nasal. J Tradit Complement Med 6: 252-256, 2015.
21. Rong R, Li RR, Hou YB, Li J, Ding JX, Zhang CB i Yang Y: la decocció de Mahuang-xixin-fuzi redueix la infecció del virus de la grip a en ratolins amb síndrome de deficiència de ronyó-yang. J Ethnopharmacol 192: 217-224, 2016.
22. Johnsen SG: Recompte de la puntuació de la biòpsia testicular: un mètode per al registre de l'espermatogènesi en els testicles humans: valors normals i resultats en 335 homes hipogonadals. Hormones 1: 2-25, 1970.
23. Mays-Hoopes LL, Bolen J, Riggs AD i Singer-Sam J: Preparació d'espermatogònies, espermatòcits i espermàtides rodones per a l'anàlisi de l'expressió gènica mitjançant la classificació de cèl·lules activades per fluorescència. Biol Reprod 53: 1003-1011, 1995.
24. Xu LG: Influència de la ciclosporina A en els paràmetres de semen dels pacients després del trasplantament renal. J Clin Urol 20: 603-605, 2005.
25. Pintus E, Ros-Santaella JL i Garde JJ: Més enllà de la mida dels testicles: vincles entre l'espermatogènesi i els trets de l'esperma en un mamífer reproductor estacional. PLoS One 10: e0139240, 2015.
26. Monteiro JC, Predes FS, Matta SL i Dolder H: La infusió d'Heteroperys aphrodisiaca redueix els efectes col·laterals de la ciclosporina A al testicle. Anat Rec (Hoboken) 291: 809-817, 2008.
27. Oseko F, Note S, Morikawa K, Endo J, Taniguchi A i Imura H: Influència de la hiperprolactinèmia crònica induïda per sulpirida en l'eix hipotàlem-hipofisi-testicular en homes normals. Fertil Steril 44: 106-111, 1985.
28. Wisniewski P, Romano RM, Kizys MM, Oliveira KC, Kasamatsu T, Giannocco G, Chiamolera MI, Dias-da-Silva MR i Romano MA: l'exposició dels adults al bisfenol A (BPA) en rates Wistar redueix la qualitat de l'esperma amb interrupció. de l'eix hipotàlem-hipofisi-testicular. Toxicologia 329: 1-9, 2015.
29. Krueger BA, Trakshel GM, Sluss PM i Maines MD: Depressió mediada per ciclosporina dels receptors de l'hormona luteïnitzant i biosíntesi hemo en testicles de rata: un possible mecanisme per a la disminució de la testosterona sèrica. Endocrinologia 129: 2647-2654, 1991.
30. Nolan CJ i Payne AH: el genotip al locus P450scc determina diferències en la quantitat de proteïna P450scc i la producció màxima de testosterona a les cèl·lules de Leydig del ratolí. Mol Endocrinol 4: 1459-1464, 1990.
31. Türk G, Ateşşahin A, Sönmez M, Yüce A i Ceribaşi AO: el licopè protegeix contra la toxicitat testicular induïda per ciclosporina A en rates. Theriogenology 67: 778-785, 2007. 32. Türk G, Sönmez M, Ceribaşi AO, Yüce A i Ateşşahin A: Atenuació dels danys testiculars i espermatozoics induïts per la ciclosporina A associats amb l'estrès oxidatiu per l'àcid elàgic. Int Immunopharmacol 10: 177-182, 2010.
