Avaluació quantitativa d'infiltrats inflamatoris en biòpsies de trasplantament renal mitjançant l'amplificació del senyal de tiramida múltiple i l'aprenentatge profund
Mar 25, 2022
Contacte: Audrey Hu Whatsapp/hp: 0086 13880143964 Correu electrònic:audrey.hu@wecistanche.com
Meyke Hermsen1Valery Volk2Jan Hinrich Bräsen2et al
Resum
La funció retardada de l'empelt (DGF) és un fort factor de risc per al desenvolupament de la fibrosi intersticial i l'atròfia tubular (IFTA) en els trasplantaments de ronyó. L'avaluació quantitativa d'infiltrats inflamatoris en biòpsies renals de pacients amb DGF pot revelar marcadors predictius per al desenvolupament d'IFTA. En aquest estudi, hem combinat l'amplificació del senyal de tiramida múltiple (mTSA) i les xarxes neuronals convolucionals (CNN) per avaluar el microentorn inflamatori en biòpsies renals de pacients amb DGF (n=22) preses a les 6 setmanes després del trasplantament. Els pacients van ser estratificats per al desenvolupament d'IFTA (<10% versus="" ≥10%)="" from="" 6="" weeks="" to="" 6="" months="" post-transplantation,="" based="" on="" a="" histopathological="" assessment="" by="" three="" kidney="" pathologists.="" one="" mtsa="" panel="" was="" developed="" for="" visualization="" of="" capillaries,="" t-="" and="" b-lymphocytes,="" and="" macrophages,="" and="" a="" second="" mtsa="" panel="" for="" t-helper="" cell="" and="" macrophage="" subsets.="" the="" slides="" were="" multi="" spectrally="" imaged="" and="" custom-made="" python="" scripts="" enabled="" conversion="" to="" artificial="" brightfield="" whole-slide="" images="" (wsi).="" we="" used="" an="" existing="" cnn="" for="" the="" detection="" of="" lymphocytes="" with="" cytoplasmatic="" staining="" patterns="" in="" immunohistochemistry="" and="" developed="" two="" new="" cnns="" for="" the="" detection="" of="" macrophages="" and="" nuclear-stained="" lymphocytes.="" f1="" scores="" were="" 0.77="" (nuclear-stained="" lymphocytes),="" 0.81="" (cytoplasmatic-stained="" lymphocytes),="" and="" 0.82="" (macrophages)="" on="" a="" test="" set="" of="" artificial="" brightfield="" wsi.="" the="" cnns="" were="" used="" to="" detect="" inflammatory="" cells,="" after="" which="" we="" assessed="" the="" peritubular="" capillary="" extent,="" cell="" density,="" cell="" ratios,="" and="" cell="" distance="" in="" the="" two="" patient="" groups.="" in="" this="" cohort,="" the="" distance="" of="" macrophages="" to="" other="" immune="" cells="" and="" peritubular="" capillary="" extent="" did="" not="" vary="" significantly="" at="" 6="" weeks="" post-transplantation="" between="" patient="" groups.="" cd163+="" cell="" density="" was="" higher="" in="" patients="" with="" ≥10%="" ifta="" development="" 6="" months="" post-transplantation="" (p="" <="" 0.05).="" cd3+cd8−/cd3+cd8+="" ratios="" were="" higher="" in="" patients="" with=""><10% ifta="" development="" (p="" <="" 0.05).="" we="" observed="" a="" high="" correlation="" between="" cd163+="" and="" cd4+gata3+="" cell="" density="" (r="0.74," p="" <="" 0.001).="" our="" study="" demonstrates="" that="" cnns="" can="" be="" used="" to="" leverage="" reliable,="" quantitative="" results="" from="" mtsa-="" stained,="" multi="" spectrally="" imaged="" slides="" of="" kidney="" transplant="">
Cistanche deserticola prevé la malaltia renal, feu clic aquí per obtenir la mostra
Introducció
La funció retardada de l'empelt (DGF) després del trasplantament de ronyó és multifactorial i està relacionada principalment amb les característiques del donant i el temps d'isquèmia. La DGF es descriu generalment com la necessitat de diàlisi dins dels 7 dies posteriors al trasplantament i és un fort factor de risc per a la lesió crònica de l'empelt renal [1–3]. Un component clàssic de la lesió renal crònica és la presència de fibrosi intersticial i atròfia tubular (IFTA). Tanmateix, no tots els pacients amb DGF avancen cap al desenvolupament de IFTA, i la complexa relació entre DGF i IFTA encara no s'entén poc. Això es deu primer al temps de retard entre els esdeveniments potencialment causants i el declivi funcional, i segon als efectes variables i complexos d'inductors potencials com el rebuig i els efectes secundaris de la medicació [1, 4]. La presència general d'inflamació i macròfags específics s'ha descrit en nombrosos estudis com a predictor de la pèrdua de l'empelt [5–8]. No obstant això, els processos patològics subjacents no s'entenen del tot i els nivells elevats d'inflammació no condueixen invariablement a la pèrdua a llarg termini de l'empelt. Com a resultat dels estímuls ambientals, els macròfags adquireixen funcions especialitzades i es polaritzan en diferents fenotips. Nombrosos estudis suggereixen que subtipus de macròfags específics (alternativament macròfags activats) estan implicats en la remodelació del teixit induint la reparació o la fibrosi del teixit. Se sap que la polarització cap a un fenotip de remodelació del teixit (de vegades pro-fibròtic) depèn d'una àmplia gamma d'estímuls ambientals, entre d'altres proporcionats pels subtipus de limfòcits T-helper [9–11]. L'avaluació de les poblacions de cèl·lules T-helper a l'empelt en el moment de la DGF va revelar un subtipus T-helper 1 prevalent, però fins ara no s'han investigat les correlacions amb el resultat de l'empelt o la progressió a IFTA [12]. Una avaluació exhaustiva del microambient inflamatori centrada específicament en els macròfags i els subconjunts de cèl·lules T-helper en cohorts de pacients acuradament seleccionades pot proporcionar una visió de per què alguns pacients amb DGF, però no tots, progressen cap al desenvolupament d'IFTA.
No obstant això, una investigació exhaustiva dels infiltrats inflamatoris es veu obstaculitzada per diverses limitacions (tècniques). Les tècniques tradicionals d'immunohistoquímica (IHC) i d'immunofluorescència donen suport a la visualització d'un nombre limitat de marcadors cel·lulars en una secció de teixit. No es desitja seccionar en sèrie fragments de teixit petits i valuosos, com ara biòpsies renals, i la interpretació de les relacions entre cèl·lules en diferents seccions és difícil. A més, l'avaluació quantitativa dels infiltrats inflamatoris per estimació visual comporta un nivell significatiu de variabilitat interobservador [13]. Les tècniques tradicionals de processament d'imatges, com ara el llindar de píxels, la conca hidrogràfica i la segmentació basada en la morfologia, es basen en el coneixement previ de totes les representacions morfològiques de les cèl·lules i la intensitat de la taca de teixit al llarg d'un conjunt de dades [14–16]. Per tant, aquests mètodes sovint no tenen robustesa per a les variacions d'imatges biològiques i tècniques i es tradueixen malament a conjunts de dades nous o externs. L'auge de la patologia digital ha accelerat el desenvolupament de mètodes alternatius per a l'avaluació d'imatges de diapositiva sencera (WSI) [17, 18]. Els models d'aprenentatge profund, concretament, les xarxes neuronals convolucionals (CNN) han demostrat ser capaços de segmentar i detectar estructures biològiques rellevants en diapositives histopatològiques [19-23]. Aquestes tècniques tenen el potencial de passar de l'estimació visual subjectiva i el processament d'imatges tradicionals a la detecció cel·lular precisa, objectiva i reproduïble.
L'objectiu d'aquest estudi és desenvolupar un mètode per a l'avaluació objectiva i quantitativa de múltiples marcadors de cèl·lules inflamatòries, eludint la necessitat d'una secció extensa de diapositives en sèrie. Per fer-ho, combinem IHC multiplex, imatges multiespectrals i models d'aprenentatge profund. Per demostrar l'aplicabilitat d'aquestes tècniques, s'estudien les correlacions del microentorn inflamatori, quantificades per models d'aprenentatge profund, amb el desenvolupament d'IFTA en biòpsies d'empelt de vigilància de pacients amb DGF.
extracte de cistanche per tractar malalties renals
Materials i mètodes
Per avaluar el microambient inflamatori en biòpsies renals de pacients amb DGF, vam realitzar IHC múltiple en biòpsies de vigilància preses a les 6 setmanes després del trasplantament. Els pacients van ser estratificats per al desenvolupament d'IFTA (<10% versus="" ≥10%)="" from="" 6="" weeks="" to="" 6="" months="" post-transplantation,="" based="" on="" a="" histopathological="" assessment="" by="" three="" kidney="" pathologists.="" multiplex="" ihc="" was="" performed="" using="" tyramide="" signal="" amplification="" (mtsa)="" panels.="" one="" mtsa="" panel="" was="" designed="" for="" the="" visualization="" of="" capillaries,="" macrophages,="" and="" t="" and="" b="" lymphocytes="" (panel="" i),="" and="" one="" mtsa="" panel="" for="" the="" visualization="" of="" polarized="" t-helper="" lymphocytes="" and="" macrophages="" (panel="" ii).="" second,="" the="" mtsa="" slides="" were="" multi="" spectrally="" imaged,="" and="" custom-made="" python="" scripts="" were="" used="" to="" convert="" the="" multispectral="" images="" to="" artificial="" brightfield="" ihc="" wsi.="" converting="" the="" slides="" to="" artificial="" ihc="" wsi="" allowed="" for="" the="" application="" of="" an="" existing="" cnn="" for="" the="" detection="" of="" lymphocytes="" in="" ihc="" [22].="" this="" existing="" cnn="" was="" designed="" for="" cytoplasmatic="" lymphocyte="" markers.="" hence,="" a="" second="" and="" third="" cnn="" was="" developed="" in="" this="" study="" for="" the="" quantification="" of="" macrophages="" and="" nuclear="" lymphocyte="" markers="" in="" ihc="" wsi.="" these="" three="" cnns="" were="" subsequently="" used="" to="" quantitatively="" assess="" the="" inflammatory="" infiltrates="" in="" the="" two="" patient="" groups="" and="" to="" study="" the="" correlations="" of="" the="" inflammatory="" microenvironment="" at="" 6="" weeks="" post-transplantation="" with="" the="" development="" of="" ifta="" 6="" months="" after="">
Mostres de teixits
Hem utilitzat biòpsies de vigilància de receptors de trasplantament renal a la Hannover Medical School (Hannover, Alemanya), adquirides en el context d'un programa prospectiu de biòpsies de vigilància. Els criteris d'inclusió van ser: aparició de DGF (definida com<500 ml="" urine="" production="" within="" the="" first="" 24="" h="" after="" transplantation="" and/or="" the="" need="" for="" dialysis="" within="" 7="" days="" post-transplantation),="" absence="" of="" rejection="" in="" any="" of="" the="" surveillance="" biopsies="" or="" biopsies="" for="" cause="" within="" the="" first="" year="" post-transplantation,="" and="" absence="" of="" ifta="" in="" the="" surveillance="" biopsy="" taken="" at="" 6="" weeks="" after="" transplantation="" (based="" on="" the="" pathology="" report="" and="" graded="" according="" to="" the="" banff="" lesion="" grading="" system="" [24]).="" all="" patients="" were="" treated="" with="" dialysis="" because="" of="" no,="" or="" insufficient="" graft="" function,="" variably="" manifested="" by="" (combinations="" of)="" anuria,="" oliguria,="" metabolic="" de-arrangement="" with="" acidosis,="" or="" hyperkalemia.="" none="" of="" the="" patients="" had="" hyperkalemia="" or="" hypervolemia="" alone.="" formalin-fixed,="" paraffin-embedded="" tissue="" (ffpe)="" from="" biopsies="" taken="" 6="" weeks="" and="" 6="" months="" post-transplantation="" was="" collected.="" six="" patients="" did="" not="" undergo="" a="" surveillance="" biopsy="" procedure="" 6="" months="" after="" transplantation.="" instead,="" the="" surveillance="" biopsy="" was="" taken="" at="" 3="" months="" post-transplantation="" was="" included="" (n="3)" or="" the="" nearest="" cases="" with="" sufficient="" cortical="" tissue="" (here="" defined="" as="" ≥4="" glomeruli)="" in="" both="" the="" 6="" weeks="" and="" the="" 6="" months="" biopsy="" were="" included="" in="" the="" study="" (n="24)." one="" case="" was="" excluded="" because="" of="" interstitial="" nephritis="" of="" unknown="" cause="" and="" one="" more="" case="" due="" to="" fixation="" artifacts.="" a="" final="" number="" of="" 22="" patients="" were="" included="" in="" this="" study="" (table="">
Avaluació IFTA
L'extensió de la fibrosi intersticial (ci) i l'atròfia tubular (CT) (IFTA) a les 6 setmanes i 6 mesos, expressada mitjançant el sistema de classificació de lesions de Banff [24] es va obtenir a partir de l'informe de patologia. Per avaluar la relació entre els primers infiltrats inflamatoris i el desenvolupament de l'IFTA amb més detall, es van digitalitzar totes les diapositives tenyides de PAS per tornar-les a examinar mitjançant un escàner digital de diapositives Pannoramic 250 Flash II (3DHistech, Hongria) amb un 20 × objectiu amb una resolució de 0,24 μm/píxel. El PAS WSI d'ambdós punts de temps (6 setmanes i 6 mesos) es va puntuar per a l'extensió d'IFTA (percentatge de superfície, amb intervals del 10 per cent) per tres patòlegs renals. Les puntuacions IFTA mitjanes dels patòlegs es van utilitzar com a puntuació final per calcular el canvi en IFTA entre 6 setmanes i 6 mesos després del trasplantament. Els pacients es van estratificar segons l'augment absolut de la puntuació IFTA del 10 per cent o més (n=13) i no o<10% increase="" of="" ifta="" (n="9)" (table="" 1).="" recipient="" characteristics,="" donor="" characteristics,="" and="" banff="" ci,="" ct,="" ti,="" i,="" and="" i-ifta="" lesion="" scores="" (obtained="" from="" the="" pathology="" report)="" are="" listed="" in="" table="" 1="" for="" both="" patient="" groups.="" significant="" differences="" between="" patient="" groups="" were="" assessed="" using="" the="" independent="" samples="" mann–whitney="" u="" test="" or="" fisher's="" exact="" test="" and="" are="" displayed="" in="" table="">
A més, es van comparar les puntuacions de les lesions de Banff entre punts de temps mitjançant la prova de rangs signats de Wilcoxon. Això va revelar diferències significatives entre les biòpsies de 6 setmanes i 6 mesos per a les categories de Banff ti (p=0,017), ci (p=0},004) i ct (p=0,011) .
Tinció multiplex de TSA
Vam realitzar IHC múltiplex mitjançant mTSA per visualitzar múltiples marcadors cel·lulars a les biòpsies de 6 setmanes. Després de la incubació amb un anticòs primari i secundari, el teixit es va tractar amb tiramida marcada amb fluorescència. La peroxidasa de rave picant de l'anticòs secundari catalitza la formació de radicals de tiramida actius. Els radicals de tiramida s'uneixen covalentment als residus de tirosina de l'antigen. Aquesta unió permanent va permetre l'eliminació induïda per la calor del complex d'anticossos primari-secundari mentre es conservava el dipòsit de tiramida fluorescent [25]. Això va permetre la posterior incubació successiva amb més anticossos de la mateixa espècie contra els antígens diana.
La mTSA es va realitzar en dues diapositives consecutives de les biòpsies de vigilància de 6 setmanes. Hem desenvolupat dos panells mTSA per avaluar l'infiltrat inflamatori i l'extensió capil·lar peritubular als nostres grups de pacients. El panell I existia d'anticossos anti-CD3, CD4, CD8, CD20, CD68 i CD34. El panell II es va utilitzar per investigar la polarització de cèl·lules T-helper i macròfags mitjançant anticossos anti-CD4, Tbet, GATA3, CD68 i CD163. Les especificacions d'anticossos, dilucions i ordres de tinció s'enumeren a la taula suplementària 1. Totes les diapositives es van desparafinar en xilene, es van deshidratar en etanol al 95 per cent, es van rentar amb aigua de l'aixeta i es van bullir per a la recuperació de l'epítop en trisborat-EDTA diluït 10x (TBE 10x). , 0658, VWR Life Sciences, EUA). Després de refredar-se, les diapositives es van rentar amb una solució de peroxidasa d'hidrogen al 3 per cent per al bloqueig de la peroxidasa endògena i es van rentar amb un tampó salí tamponat amb tris amb un 0, 05 per cent de Tween 20 (822184, Merck KGaA, Alemanya) (TBS-T). El bloqueig de proteïnes es va realitzar mitjançant TBS-T amb un 1% d'albúmina sèrica bovina (BSA) (mTSA pas 1). Els anticossos primaris es van incubar durant 1 h a temperatura ambient o durant la nit a quatre graus centígrads (mTSA pas 2). Després de rentar-se a TBS-T, les diapositives es van incubar amb un anticòs secundari conjugat amb HRP (Poly-HRP-GAMs/Rb IgG, VWRKDPVO999HRP, Immunologic, Països Baixos) durant 30 min a temperatura ambient (mTSA pas 3). A continuació, es va realitzar la TSA mitjançant els fluoròfors Opal TSA d'un kit IHC manual de color Opal 7- (NEL811001KT, Akoya Biosciences, EUA) (mTSA pas 4) (els fluoròfors i els seus anticossos corresponents es mostren a la taula suplementària 1). El complex anticossos-TSA es va eliminar amb un cicle d'ebullició al tampó TBE (mTSA pas 5). Els passos 1-5 de mTSA es van repetir fins que les diapositives es van tacar amb tots els anticossos del panell corresponent. Les diapositives es van cobrir amb fluoromount-G amb DAPI (00-4959-52, Thermo Fisher, EUA).
herba cistanche
Validació TSA multiplex
Els cicles d'ebullició repetits poden afectar l'afinitat de l'epítop objectiu. Alguns anticossos mostren un patró de tinció més feble després de bullir el teixit diverses vegades, altres anticossos necessiten més cicles d'ebullició per assolir la intensitat de tinció òptima i altres no es veuen afectats en absolut. Vam avaluar aquest efecte per a tots els anticossos utilitzant IHC cromogènic en el teixit de les amígdales de control de FFPE. Per a cada anticossos provat (n=9), es van tallar sis seccions (4 μm de gruix). Totes les diapositives es van desparafinar en xilè, es van deshidratar en etanol al 95 per cent, es van rentar amb aigua de l'aixeta i es van bullir per a la recuperació de l'epítop en TBE diluït 10 vegades (cicle d'ebullició primer). Després de refredar-se, es va emmagatzemar una diapositiva per anticòs provat en solució salina tamponada amb fosfat (PBS). Les diapositives restants es van tornar a bullir. Aquest cicle es va repetir cinc vegades. Totes les diapositives es van rentar posteriorment amb una solució de peroxidasa d'hidrogen al 3% i es van esbandir amb PBS. Els anticossos primaris (taula suplementària 1) es van incubar durant 1 h a temperatura ambient. Després de la incubació, les diapositives es van rentar en PBS. Les diapositives tacades amb anticossos anti-CD68, Tibet i GATA3 van requerir una incubació addicional amb bloqueig post-anticossos (PAB) durant 15 min (bloqueig de VWRKDPVB, Immunologic, Països Baixos). Després de la incubació, les diapositives es van rentar en PBS i es van incubar amb un anticòs secundari conjugat amb HRP (seguint PAB VWRKDPVB110HRP, Immunologic, Països Baixos, per a altres, vegeu la taula suplementària d'anticossos secundaris 1). La visualització es va realitzar amb 3,3′-diaminobenzidina (DAB) (Bright-DAB, VWRKBS04, Immunologic, Països Baixos). Els resultats es visualitzen a la figura 1 suplementària. A partir d'aquests resultats, vam determinar l'ordre òptim d'anticossos per als experiments de mTSA, tal com es mostra a la taula complementària 1.
Si els epítops d'interès estan co-localitzats, els dipòsits de tiramida poden interferir entre ells. Per provar aquesta inhibició estèrica, vam utilitzar diapositives de teixit de control de les amígdales i les vam tacar amb els nostres panells mTSA. L'expressió d'anticossos a la mTSA es va comparar amb la de les diapositives d'una sola taca, que van passar pel mateix nombre de cicles d'ebullició. No vam observar diferències en els patrons de tinció entre les diapositives tenyides simples i múltiples (exemples inclosos del panell I, figures suplementàries 2 i 3). Tots els anticossos primaris del mTSA es van utilitzar en la mateixa dilució que es va utilitzar per a l'IHC cromogènic. La intensitat del senyal fluorescent es va optimitzar ajustant les dilucions de la solució TSA.
Imatge TSA multiplex
La imatge multiespectral es va realitzar mitjançant un sistema d'imatge Vectra Polaris (CLS143455, Akoya Biosciences, EUA) amb un objectiu de 20x, amb una resolució de 0,49 μm per píxel, i utilitzant DAPI, FITC, CY3, Texas Red i Cubs espectrals Cy5. El sistema Vectra permet la selecció manual de regions per a l'adquisició multiespectral, que posteriorment el sistema divideix en fitxes (Fig. 1.1). Els espectres d'autofluorescència i tots els fluoròfors Opal TSA es van registrar prèviament en una "biblioteca" espectral mitjançant el programari d'anàlisi d'imatges avançat Inform 2.4.6. (Akoya Biosciences, EUA). La biblioteca espectral va permetre descompondre la fitxa múltiple en múltiples fitxes individuals que representaven la contribució de cada fluoròfor ("desmescla"). Això va donar com a resultat rajoles monocromes i multicanal, cada canal corresponent a un sol fluoròfor i, per tant, anticòs (Fig. 1.2).
Conversió a IHC de camp brillant artificial
A partir de les coordenades emmagatzemades, les fitxes es van cosir per crear un WSI multicanal mitjançant un script python personalitzat (Fig. 1.3). Els canals que representen el senyal DAPI (IDAPI) i els canals que representen un dels anticossos (IIHC) es van convertir en hematoxilina artificial i tinció DAB, respectivament (Figs. 1.4 i 1.5). A partir de l'hematoxilina cromàtica coneguda i les coordenades DAB Cx, Cy després de la transformació de la tonalitat-saturació-densitat (HSD), es van adquirir vectors de taques en estudis anteriors [26, 27]. Aquests vectors de taques es van utilitzar per calcular els valors vermell-verd-blau per a l'IHC de camp brillant artificial (Fig. 1.5), com:
amb CR, st l'absorció de llum del colorant a la part vermella de l'espectre. Els valors de B i G es van calcular de manera similar.
Anàlisi d'imatges
Regions d'interès (ROI)
Les regions d'interès (ROI) es van anotar per a cada cas de la cohort mitjançant el programari de plataforma d'anàlisi de diapositives automatitzada (ASAP; versió 1.9, disponible com a programari de codi obert a GitHub). Aquests ROI constaven de tubulointerstici cortical, excloent així la càpsula, els glomèruls i les artèries. Com que la inflamació a les regions subcapsulars renals es considera no específica en la patologia del trasplantament, les biòpsies d'aquest estudi es van analitzar principalment excloent la regió subcapsular (definida com a 400 µm per sota de la càpsula). En segon lloc, vam repetir les anàlisis incloent la regió subcapsular. A la figura 4 suplementària s'inclouen exemples visuals dels ROI.
Detecció de limfòcits CNN I
Les imatges IHC de camp brillant artificial que representen la tinció de CD3, CD4, CD8 i CD20 es van analitzar mitjançant una CNN existent amb una arquitectura U-Net [22, 28]. Aquesta xarxa es va dissenyar específicament per a la detecció de marcadors limfòcits citoplasmàtics en IHC. El rendiment de CNN es pot expressar en precisió, record i una puntuació F1-, on:
La CNN va aconseguir una precisió de {{0}},76, un record de 0,79 i una puntuació F{1-de 0,78 al conjunt de proves que es va utilitzar en el document original, format per l'IHC WSI tradicional. La detecció de cèl·lules positives individuals requereix llindar la sortida de CNN, seguida d'un postprocessament. Com que la tinció de CD3 al panell mTSA era més forta en comparació amb CD4, CD8 i CD20, es va utilitzar un llindar de detecció d'objectes més baix per als tres últims (0,4) i el llindar de detecció d'objectes original per a CD3 (0,7). Per avaluar el rendiment de CNN en els WSI IHC de camp brillant artificial en aquest estudi, es van utilitzar quatre IHC WSI de camp brillant artificial (CD8 i CD20 de dos pacients) com a conjunt de proves en aquest estudi. Les anotacions de punts (n=1115) es van generar mitjançant el programari ASAP. Després d'aplicar la xarxa, es va calcular la precisió, la memòria i la puntuació F1- per avaluar el rendiment de CNN. Les deteccions es consideraven vertaderes positives si es trobaven a 4 µm (diàmetre mitjà de limfòcits) a partir d'una anotació de veritat terrestre. Quan es van trobar dues deteccions dins d'un rang de 4 µm, només es va considerar positiva la detecció més propera a l'anotació. Posteriorment, es va utilitzar la detecció de limfòcits CNN I per a l'anàlisi de tots els IHC WSI artificials de camp brillant que representen marcadors de limfòcits citoplasmàtics (CD3, CD4, CD8 i CD20).
Detecció de limfòcits CNN II
L'anàlisi de l'IHC WSI artificial de camp brillant amb patrons de tinció nuclear (tal com es presenta per T-bet i GATA3) que representen els canals DAPI i CD4 es van seleccionar per combinar-los en un WSI (4). Els vectors de taques adquirits en estudis anteriors es van utilitzar per acolorir artificialment el blau senyal DAPI (hematoxilina) i el marró senyal CD4 (DAB), donant lloc a un IHC WSI de camp brillant artificial (5).
formació requerida, validació i prova d'una nova CNN. Amb aquesta finalitat, es van tallar nou diapositives del teixit de control del ronyó, les amígdales i l'apèndix FFPE. Aquestes diapositives es van tacar amb IHC amb anti-Tibet (clon 4B1{{10}}, 14-5825-82, Thermo Fisher Scientific, EUA) i anti-GATA3 (clon L{50-823, CM -405Anticossos B, Biocare Medical, Països Baixos). Les diapositives es van digitalitzar mitjançant un escàner digital de diapositives Pannoramic 250 Flash II a una resolució de 0,12 μm/píxel. Dos observadors van produir anotacions de 5726 punts a diferents regions mitjançant el programari ASAP. Les anotacions de cinc diapositives es van utilitzar per entrenar una arquitectura U-Net CNN mitjançant pegats de 256 × 256 píxels amb una mida de píxel de 0,49 μm/píxel. Es van utilitzar dos WSI per validar la CNN i per determinar el llindar de detecció d'objectes (0,4). El rendiment de CNN a l'IHC WSI tradicional es va avaluar en un conjunt de proves retinguts de dos IHC WSI. El rendiment de la CNN en IHC WSI artificial de camp brillant es va avaluar en un conjunt de proves secundari format per quatre IHC WSI de camp brillant artificial (Tibet i GATA3 de dos pacients) amb anotacions de 1082 punts. La precisió, la memòria i la puntuació F1-es van calcular per avaluar el rendiment en ambdós conjunts de proves. Les deteccions es consideraven vertaderes positives si es trobaven a 4 µm d'una anotació de la veritat terrestre. Quan es van trobar dues deteccions dins d'un rang de 4 µm, només es va considerar positiva la detecció més propera a l'anotació. Posteriorment, es va utilitzar la detecció de limfòcits CNN II per a l'anàlisi de tots els WSI IHC de camp brillant artificial que representen marcadors nuclears (limfòcits) (Tibet i GATA3).
Detecció de macròfags CNN
A diferència de la detecció de limfòcits, la identificació de macròfags individuals no és inequívoca. Especialment en escenes agrupades, es pot esperar un nivell significatiu de variabilitat de l'observador. Per tant, es va utilitzar un nombre molt més gran de casos i anotacions humanes per entrenar una tercera CNN dedicada per a la detecció de macròfags CD68 plus i CD163 plus. Es van recollir diapositives tenyides amb IHC (n=111) de teixit renal natiu i trasplantat. Les tincions d'IHC es van realitzar amb anti-CD68 (clon PG-M1, GA61361-2, Dako Omnis, Dinamarca o clon KP1, M0876, Dako, Dinamarca) o anti-CD163 (clon MRQ). -26, o 10D6, anticòs NCL-L-CD163, Leica Biosystems, Regne Unit). Les diapositives IHC es van digitalitzar mitjançant un escàner de diapositives panoràmics de 250 Flash II o un escàner de diapositives Aperio AT2 (Leica Biosystems, Wetzlar, Alemanya) amb una resolució de 0,24 o 0 .25 μm/píxel, respectivament. Quatre observadors van produir 37.709 anotacions de punts en múltiples ROI als WSI, utilitzant un protocol per a l'anotació de macròfags, que es va acordar després dels experiments pilot inicials. Les anotacions de 101 diapositives es van utilitzar per entrenar una arquitectura YoloV2 CNN [29]. Yolo és especialment adequat per a tasques destinades a tasques de detecció. La xarxa, formada per set capes convolucionals, es va entrenar en pegats de 256 × 256 píxels extrets a una resolució de 0, 98 μm/píxel amb quadres delimitadors de 21 μm (basat en la mida mitjana dels macròfags). Es van utilitzar deu WSI per validar la CNN i per determinar el llindar de detecció d'objectes (0,45) i els paràmetres de supressió no màxims (0,05). El rendiment de CNN a l'IHC WSI tradicional es va avaluar en un conjunt de proves retinguts de deu IHC WSI. El rendiment de la CNN en IHC WSI artificial de camp brillant es va avaluar en un conjunt de proves secundari format per quatre IHC WSI de camp brillant artificial (CD68 i CD163 de dos pacients) amb anotacions de 1033 punts. Es van calcular les puntuacions de precisió, record i F1 per avaluar el rendiment dels dos conjunts de proves. Les deteccions es consideraven vertaderes positives si es trobaven a 21 µm (diàmetre mitjà dels macròfags) a partir d'una anotació de la veritat terrestre. Quan es van trobar més deteccions dins d'un rang de 21 µm, només es va considerar positiva la detecció que estava més a prop de l'anotació. Posteriorment, es va utilitzar el CNN de detecció de macròfags per a l'anàlisi de tots els IHC WSI artificials de camp brillant que representen marcadors de macròfags (CD68 i CD163).
cistanche tubolosa testosterona
Doble positivitat
La positivitat de les cèl·lules per a dos marcadors (doble positivitat) es va avaluar determinant el nombre de píxels entre les deteccions de cèl·lules als diferents canals. Si la distància entre dues deteccions de limfòcits fos<4 µm,="" the="" cell="" was="" considered="" double-positive.="" for="" macrophages,="" this="" was="" set="" to=""><21µm. this="" was="" used="" to="" assess="" cd3+cd4+,="" cd3+cd8+,="" cd4+tbet+,="" cd4+gata3+,="" and="" cd68+cd163+="">
Els números de cèl·lules es van calcular dins dels ROI i les densitats de cèl·lules es van basar en el recompte de cèl·lules i l'àrea del ROI anotat.
Relacions espacials
La detecció cel·lular automatitzada en WSI permet investigar les relacions espacials entre cèl·lules. Es va determinar la distància mitjana més curta (a les regions excloent la regió subcapsular) per a les cèl·lules CD68 plus i les cèl·lules CD3 plus, CD3 més CD8 plus i CD20 plus al WSI del panell I per als dos grups de pacients i entre les cèl·lules CD163 plus i CD4. plus , CD4 més Tbet plus i CD4 més GATA3 plus al WSI per als dos grups de pacients.
Extensió capil·lar peritubular
Per tal d'avaluar l'extensió capil·lar peritubular, es van analitzar WSI no barrejats que representen el canal CD34 a Fiji (ImageJ versió 2.0.0, EUA, macros i connectors: "Open and Duplicate", "ASAP". Lector de ROI") [30]. Els píxels positius es van determinar mitjançant un llindar automàtic i es van expressar posteriorment com el percentatge del nombre total de píxels dins del ROI.
Anàlisi estadística
Les densitats de les següents poblacions cel·lulars es van calcular en les biòpsies de 6 setmanes: limfòcits T (CD3 plus ), limfòcits T citotòxics (CD3 més CD8 plus ), limfòcits B (CD20 plus ), macròfags (CD68 plus , panells I i II), macròfags polaritzats (CD68 més CD163 plus, CD163 plus), limfòcits T-helper 1 (CD4 més Tbet plus) i limfòcits T-helper 2 (CD4 més GATA3 plus). Els coeficients de correlació de Spearman es van calcular per avaluar si hi havia una correlació entre la densitat de limfòcits T-helper 1 i T-helper 2 (CD4 més Tbet plus, CD4 més GATA3 plus) i la densitat de macròfags polaritzats (CD68 més CD163 plus o CD163 plus). Hem observat el senyal CD68 (fluoròfor 540 nm) a les IHC artificials CD4 (fluoròfor 520 nm) d'un panell I. Per tant, també informem de les densitats cel·lulars de les cèl·lules CD3 més CD8-. Per avaluar les diferències entre grups de pacients amb diferents resultats IFTA, informem dels valors de densitat cel·lular mitjana, mínima i màxima per grup. Es van avaluar diferències significatives en la densitat cel·lular i l'extensió capil·lar peritubular (definida com el percentatge de píxels positius CD34-) entre grups mitjançant la prova U de Mann-Whitney per a mostres independents. Es va avaluar si els pacients amb diferents resultats de l'IFTA mostren proporcions CD3 més CD8-/CD3 més CD8 més cèl·lules significativament diferents, es va avaluar mitjançant una prova t per a mostres independents. Les diferències entre els grups de pacients en les relacions espacials de les cèl·lules CD68 plus i CD163 plus amb altres cèl·lules immunitàries es van avaluar per a la seva importància mitjançant la prova U de Mann-Whitney per a mostres independents.
Resultats
Detecció basada en CNN de cèl·lules positives IHC
Per tal d'aplicar les CNN existents, que es van desenvolupar originalment per a la microscòpia de camp brillant, les imatges de fluorescència mTSA es van transformar en imatges de camp brillant artificial. A la figura 2 s'inclouen exemples de regions tacades de mTSA amb les seves corresponents imatges IHC de camp brillant artificial. A la figura suplementària 4 es mostra un exemple d'un IHC WSI de camp brillant artificial. programari com ASAP i Aperio ImageScope [v12.4.3.5008]. Tal com es veu a la figura 2, l'IHC WSI artificial de camp brillant era adequat per a l'anàlisi automatitzada per part de CNN que es van desenvolupar originalment per a l'IHC WSI tradicional.
Es van utilitzar tres CNN per a l'avaluació quantitativa de cèl·lules inflamatòries a les 6 setmanes de biòpsies de trasplantament tingudes amb mTSA: per a la detecció de limfòcits amb tinció IHC citoplasmàtica (CNN I) i nuclear (CNN II) i per a la detecció de macròfags. La taula 2 mostra el rendiment de CNN (precisió, recordació i puntuacions F1-) per als conjunts de retenció tant dels WSI IHC tenyits amb DAB com dels WSI IHC de camp brillant artificial. El rendiment de CNN normalment era tan bo o millor que el CNN de referència descrit anteriorment (amb una puntuació F1-de 0,78), que es va demostrar que posseïa un rendiment comparable al dels observadors manuals experimentats [22] . Mentre que la detecció de limfòcits CNN II va mostrar un rendiment una mica reduït en imatges de camp brillant virtual en comparació amb les imatges DAB reals (en les quals es va entrenar la CNN), es va observar el contrari per a la CNN per a la detecció de macròfags.
A la figura 3 s'inclou un exemple d'una avaluació automàtica de doble positivitat amb èxit.
Correlació de diferents tipus de cèl·lules
La correlació més forta es va observar entre CD4 més GATA3 més densitat cel·lular i CD163 més densitat cel·lular (coeficient de Spearman 0,75, p <0.001) en="" el="" biòpsia="" de="" 6="" setmanes="" (figura="" suplementària="" 5a).="" aquesta="" correlació="" era="" més="" feble="" entre="" cd4="" més="" tbet="" més="" densitat="" cel·lular="" i="" cd163="" més="" densitat="" cel·lular="" (coeficient="" de="" spearman="" 0.61,="" p=""><0.01) (figura="" suplementària="" 5b)="" .="" quan="" es="" va="" limitar="" la="" població="" cel·lular="" als="" macròfags="" doblement="" positius="" (cd68="" més="" cd163="" plus),="" el="" coeficient="" de="" correlació="" de="" spearman="" va="" ser="" 0,="" 65="" (p="">< 0,="" 01)="" amb="" cd4="" més="" gata3="" més="" cèl·lules="" i="" 0,="" 66="" (p="">< 0,="" 01)="" amb="" cd4.="" més="" tbet="" més="" cèl·lules="" (figura="" suplementària="" 5c,="" d).="" la="" inclusió="" de="" la="" regió="" subcapsular="" a="" les="" anàlisis="" no="" va="" alterar="" els="">
Comparació d'infiltrats inflamatoris entrepacients que progressen a IFTA versus no IFTA
Els pacients que van progressar a IFTA als 6 mesos van mostrar densitats cel·lulars de CD163 més significativament més altes a les biòpsies preses 6 setmanes després del trasplantament (mediana de 505 cèl·lules/mm2) en comparació amb els pacients que no van progressar a IFTA (mediana de 370 cèl·lules/mm2; p=0 .043) (Taula 3). La inclusió de la regió subcapsular va donar lloc a una lleugera reducció d'aquest efecte (p=0,051). CD68 i CD4 es van utilitzar en ambdós panells. Les diapositives tacades amb el panell mTSA I van mostrar més positivitat CD68 que les diapositives tacades amb el panell mTSA II. La densitat de cèl·lules CD4 és més alta al panell mTSA II en comparació amb el panell I mTSA (taula 3).
L'extensió capil·lar peritubular va ser similar a les biòpsies de 6 setmanes de pacients amb DGF amb diferents resultats de l'IFTA (taula 3), tant en excloure (p=0,74) com en incloure (p=0,90) la regió subcapsular. de/en l'anàlisi.
L'avaluació de les proporcions de CD3 més CD8-/CD3 més CD8 més cèl·lules va mostrar una proporció significativament més alta en pacients amb<10% ifta="" development="" 6="" months="" post-transplantation="" (ratio="" of="" 17.5)="" than="" in="" patients="" with="" ≥10%="" ifta="" development="" (ratio="" of="" 9.80;="" p="0.043)" (table="">
La distància mitjana més curta des de les cèl·lules CD68 plus fins a les cèl·lules CD3 plus, CD3 més CD8 plus i CD20 plus (tauler I) i de les cèl·lules CD163 plus a CD4 plus, CD4 plus Tbet plus i CD4 més GATA3 plus cèl·lules (tauler II) ho va fer. no difereixen significativament entre els grups de pacients. Els resultats es visualitzen a la figura 4.
extracte de cistanche: millora la funció renal i la força física
Discussió
En aquest estudi, hem desenvolupat un mètode per a la quantificació precisa i objectiva d'infiltrats de cèl·lules inflamatòries en biòpsies d'empelt de pacients amb trasplantament de ronyó amb DGF que evita el tall en sèrie extensiu de material de biòpsia renal. Amb aquesta finalitat, vam combinar IHC multiplex, amplificació del senyal de tiramida, imatges multiespectrals i quantificació per CNN. Vam ser els primers a convertir dades multiespectrals en mosaic en una única imatge cromogènica artificial per marcador cel·lular, facilitant l'anàlisi WSI i l'aplicació de CNN dissenyades per a IHC de camp brillant. Hem dissenyat dos nous CNN per a la detecció de limfòcits i macròfags amb taques nuclears i hem demostrat la generalització dels CNN desenvolupats amb IHC WSI tradicional a IHC WSI de camp brillant artificial. L'aplicabilitat del nostre mètode es va demostrar utilitzant els resultats quantitatius obtinguts per les CNN per estudiar les correlacions del microambient inflamatori en biòpsies de 6 setmanes de pacients amb DGF amb el desenvolupament d'IFTA 6 mesos després del trasplantament.
Hem utilitzat un kit de tinció manual disponible comercialment per a IHC multiplex per visualitzar cèl·lules immunitàries i capil·lars peritubulars en biòpsies de vigilància obtingudes 6 setmanes després del trasplantament. El procediment de tinció múltiple va consistir en múltiples passos de rentat, incubació i ebullició de teixits i implica diverses solucions de reactius. Per tant, les validacions exhaustives dels mètodes i els controls de qualitat són de gran importància, i es recomana l'ús d'anticossos específics que produeixin una intensitat de tinció constant. Malgrat els passos de validació realitzats, es van observar patrons de tinció semblants als macròfags als canals CD4 de les diapositives dels panells mTSA I i II. Els cicles de tinció de CD4 i CD68 no es van realitzar de manera consecutiva, per la qual cosa aquest fenomen no es va poder provocar per una eliminació incompleta de l'anticòs CD68 (taula suplementària 1). Tot i que s'han descrit casos poc freqüents de positivitat dual de macròfags amb CD4 [31], una explicació més plausible rau en la proximitat dels espectres d'emissió dels fluoròfors que es van utilitzar per a la visualització de CD4 (520 nm) i CD68 (540 nm), tots dos coberts. pel cub de filtre FITC del microscopi de fluorescència. Això pot provocar un "sagnat" del fort senyal CD68 al canal CD4. Gran part d'aquest senyal es va excloure de l'anàlisi al panell I perquè només es van utilitzar cèl·lules CD4 més que eren doblement positives amb CD3 per a l'anàlisi general de cèl·lules T-helper. No obstant això, vam decidir avaluar indirectament també les cèl·lules auxiliars T generals, utilitzant CD3 més CD8− com a reemplaçament. Al panell II, CD4 només es va utilitzar en combinació amb Tibet i GATA3, limitant el risc d'ús de deteccions de falsos positius.
Es va observar una positivitat més baixa de CD68 al panell II en comparació amb el panel I. Hipòtesim que això és el resultat de la inhibició estèrica per dipòsit de tiramida pertanyent a CD163 ("efecte paraigua") [32]. Vam observar significativament més cèl·lules CD163-positives a la cohort estudiada que al teixit de les amígdales que es va utilitzar per comprovar la inhibició estèrica, possiblement explicant per què aquest efecte no es va descobrir durant la validació.
Multiplex IHC s'ha combinat amb imatges multiespectrals per a l'examen del microambient tumoral en diversos estudis oncològics, i recentment també per a l'anàlisi del rebuig d'al·loempelt renal [33–35]. Per extreure la contribució de tots els marcadors a les diapositives mTSA, les seccions es fan imatges amb un sistema Vectra o un microscopi de fluorescència similar amb una configuració multiespectral. Després d'enregistrar una imatge general de baix augment, el sistema Vectra divideix el teixit en rajoles i escaneja automàticament les rajoles de manera multiespectral. Això dóna lloc a rajoles d'imatge amb múltiples espectres que contribueixen. Com que els espectres dels fluoròfors únics es coneixen a partir de la "biblioteca" espectral preenregistrada, és possible descompondre les fitxes multiplex en múltiples fitxes individuals que representen la contribució de cada fluoròfor ("desmescla"). En la majoria dels estudis, les imatges no barrejades s'analitzen posteriorment amb programari comercial. En molts casos, aquests programes no admeten l'anàlisi WSI, tenen dificultats per analitzar les cèl·lules agrupades i sovint no són resistents als artefactes i les variacions de tinció. La conversió de les fitxes no barrejades en WSI IHC de camp brillant artificial ens va permetre aplicar una CNN existent dissenyada específicament per a la detecció de limfòcits a IHC [22] (anomenada CNN I de detecció de limfòcits). Aquesta xarxa pot detectar limfòcits individuals i agrupats amb gran precisió alhora que és resistent a la tinció de fons (Fig. 2, CD3). A més, vam entrenar dues noves CNN per a la detecció de cèl·lules amb patrons de tinció nuclear (Tibet, GATA3) (detecció de limfòcits CNN II) i per a la detecció de macròfags. Els macròfags són notòriament difícils de detectar a causa del seu patró de tinció dispers. Per tant, la CNN de detecció de macròfags es va entrenar mitjançant les anotacions de quatre experts diferents. Abans de fer les anotacions, es van planificar diverses reunions on es van discutir i avaluar els criteris per anotar els macròfags. Això va donar lloc a una xarxa que pot detectar macròfags de manera reproduïble alhora que és robusta per a tincions no específiques (taula 2, figura 2 i figura suplementària 6). Segons el nostre coneixement, aquest és el primer algorisme per a la detecció de macròfags en seccions histopatològiques escanejades. Vam provar el rendiment de les tres xarxes en un conjunt de proves format per IHC WSI tradicional (similar als utilitzats durant l'entrenament) i en un conjunt de proves secundari que consistia en IHC WSI de camp brillant artificial, generat a partir de les imatges enregistrades multiespectralment. Totes les CNN mostren un rendiment molt bo als conjunts de proves primaris i puntuacions F1-similars als conjunts de proves secundàries. Les mètriques de rendiment de la detecció de limfòcits CNN I es van calcular en teixits normals, artefactes i grups cel·lulars. L'IHC de camp brillant artificial del segon conjunt de proves no contenia artefactes de teixit i menys cúmuls de cèl·lules. Això pot explicar el millor rendiment general d'aquesta xarxa en el segon conjunt de proves. La CNN de detecció de macròfags es va entrenar i provar amb anotacions de quatre anotadors diferents. Tot i que es van discutir especialment els criteris d'anotació, es van observar, tanmateix, variacions en l'estil d'anotació. Per tant, la sensibilitat de la CNN és probablement en algun lloc del mig dels extrems de l'estil d'anotació. Les anotacions per al segon conjunt de proves van ser generades per un anotador, aparentment coincidint amb la sensibilitat de CNN.
L'ús de les CNN descrites ens va permetre investigar l'infiltrat inflamatori amb una precisió sense precedents en una sèrie única de biòpsies de vigilància primerenca rigorosament seleccionades de pacients trasplantats amb DGF.
Malauradament, es van haver d'excloure diverses mostres de l'anàlisi, principalment a causa d'un teixit residual insuficient després del treball de diagnòstic. Fins i tot amb la mida limitada del conjunt de dades, vam trobar densitats cel·lulars de CD163 més significativament més elevades en biòpsies de pacients amb DGF que van progressar cap al desenvolupament d'IFTA, que està en línia amb el paper potencialment profibròtic d'aquestes cèl·lules [11]. Tot i que la tendència observada era coherent amb les dades publicades, no vam poder confirmar l'efecte perjudicial de la presència primerenca de CD68 més macròfags que s'havien informat anteriorment per a altres grups de pacients amb trasplantament renal [7, 36, 37]. Vam trobar una correlació positiva entre les densitats de les cèl·lules CD4 més GATA3 més i les cèl·lules CD163 més, que podria confirmar la contribució dels limfòcits T-helper 2 cap a un microentorn pro-fibròtic. Tot i que en aquest estudi no es van descobrir nous biomarcadors predictius per al desenvolupament d'IFTA en pacients amb DGF, hem desenvolupat amb èxit mètodes per a l'avaluació precisa, reproduïble i escalable de l'infiltrat inflamatori en teixits escàs, com ara biòpsies de trasplantament. Aquests mètodes són valuosos per a futurs estudis quantitatius sobre la inflamació del teixit histopatològic.
Per alleujar la fatiga suprarenal amb cistanche, feu clic aquí per obtenir més detalls
Disponibilitat de dades
Les sol·licituds de col·laboració que impliquen l'ús de les dades presentades en aquest estudi es poden adreçar a l'autor corresponent (jeroen.vanderlaak@radboudumc.nl) o a FF (Feuerhake. Friedrich@mh-hannover.de).
Agraïments
Agraïm a Mark Gorris i Kiek Verrijp els seus consells sobre la tinció i la imatge mTSA, Merijn van Erp per desenvolupar una funcionalitat ImageJ personalitzada i Sophie van den Broek, Milly van de Warenburg i Martijn Otten per generar la veritat del sòl per a la xarxa de detecció de macròfags. A més, agraïm a Irina Scheffner la seva ajuda amb la recollida de dades clíniques.
Aportacions de l'autorMH, VV, JS, WG, FF, BS, LBH i JAWML
dissenyat l'estudi. JS, WG i FF van recollir material del pacient i dades clíniques. FF va coordinar els esforços realitzats a MHH. JHB, EJS i JK van puntuar la diapositiva PAS per al percentatge IFTA. MH va realitzar les tincions de mTSA, validacions dels panells I i II, i la imatge i desmescla del panell I. VV panell II amb imatges i sense barrejar. DJG va desenvolupar els mètodes per convertir fitxes mTSA en WSI de camp brillant artificial. MH va realitzar les conversions. ZS-C va desenvolupar els CNN de detecció de limfòcits i va escriure els guions per a la quantificació de limfòcits. JL va desenvolupar els CNN de detecció de macròfags i va escriure els guions per a les quantificacions de macròfags. MH va realitzar les quantificacions cel·lulars i capil·lars. NSS va calcular les distàncies cel·lulars. MH, BS, LBH i JAWML van analitzar les dades. MH va fer les xifres i va redactar el document. La versió final del manuscrit va ser revisada i aprovada per tots els autors.
FinançamentAquest treball va comptar amb el suport de la iniciativa ERACoSysMed (projecte SysMIFTA) com a part del Programa Marc Horizon 2020 de la Unió Europea ofert per ZonMw (subvenció núm. 9003035004), amb el cofinançament del Ministeri d'Investigació i Educació d'Alemanya (BMBF), subvenció núm. . FKZ031L-0085A (SysMIFTA), FKZ01ZX1710A (MicMode-I2T) i FKZ01ZX1608A (SYSIMIT). JAWML va rebre honoraris de consultoria de Philips (Països Baixos) i subvencions de
ContextVision, Philips (Països Baixos) i Sectra (Suècia), fora del treball enviat. JK va rebre suport financer de la Dutch Kidney Foundation (projecte DEEPGRAFT, subvenció núm. 17OKG23).
Compliment de les normes ètiques
Conflicte d'interessosEls autors no declaren interessos en competència.
Aprovació ètica i consentiment per participarLa recollida i l'anàlisi de dades es van realitzar amb el consentiment informat del pacient i amb l'aprovació del consell d'ètica (núm. 2765) de la Facultat de Medicina de Hannover.
Nota de l'editorSpringer Nature es manté neutral pel que fa a les reclamacions jurisdiccionals en mapes publicats i afiliacions institucionals.
Accés ObertAquest article té una llicència Creative Commons Attribution 4.0 International License, que permet l'ús, la compartició, l'adaptació, la distribució i la reproducció en qualsevol mitjà o format, sempre que doneu el crèdit adequat als autors originals. ) i la font, proporcioneu un enllaç a la llicència Creative Commons i indiqueu si s'han fet canvis. Les imatges o altres materials de tercers d'aquest article s'inclouen a la llicència Creative Commons de l'article tret que s'indiqui el contrari en una línia de crèdit del material. Si el material no està inclòs a la llicència de Creative Commons de l'article i el vostre ús previst no està permès per la normativa legal o supera l'ús permès, haureu d'obtenir el permís directament del titular dels drets d'autor.
Referències
1. Siedlecki A, Irish W, Brennan DC. Funció retardada de l'empelt en el trasplantament de ronyó. Am J Trasplantament. 2011;11:2279–96.
2. Khalkhali HR, Ghafari A, Hajizadeh E, Kazemnejad A. Factors de risc de pèrdua de l'empelt a llarg termini en receptors de trasplantament renal amb disfunció crònica de l'al·lograft. Trasplantament Exp Clin. 2010;8:277–82.
3. Yarlagadda SG, Coca SG, Formica RN, Poggio ED, Parikh CR. Associació entre la funció retardada de l'empelt i l'al·loempelt i la supervivència del pacient: una revisió sistemàtica i metaanàlisi. Trasplantament de Nephrol Dial. 2009;24:1039–47.
4. Schröppel B, Legendre C. Funció retardada de l'empelt renal: del mecanisme a la traducció. Ronyó Int. 2014;86:251–8.
5. Mengel M, Reeve J, Bunnag S, Einecke G, Jhangri GS, Sis B, et al. La puntuació de la inflamació total és superior a la puntuació actual d'inflamació de Banff per predir el resultat i el grau de pertorbació molecular dels al·loempelts renals. Am J Trasplantament. 2009;9:1859–67.
6. Cosio FG, Grande JP, Wadei H, Larson TS, Griffin MD, Stegall
MD. Predicció del posterior descens de la funció de l'al·loempelt renal a partir de biòpsies de vigilància primerenca. Am J Trasplantament. 2005;5:2464–72.
7. Toki D, Zhang W, Hor KLM, Liuwantara D, Alexander SI, Yi Z, et al. El paper dels macròfags en el desenvolupament de la fibrosi d'al·loempelt renal humà durant el primer any després del trasplantament. Am J Trasplantament. 2014;14:2126–36.
8. Ikezumi Y, Suzuki T, Yamada T, Hasegawa H, Kaneko U, Hara M, et al. Macròfags activats alternativament en la patogènesi de la lesió crònica d'al·loempelt renal. Pediatr Nefrol. 2015;30:1007–17.
9. Biswas SK, Mantovani A. Plasticitat dels macròfags i interacció amb subconjunts de limfòcits: el càncer com a paradigma. Nat Immunol. 2010;11:889–96.
10. Anders HJ, Ryu M. Els microambients renals i els fenotips dels macròfags determinen la progressió o resolució de la inflamació renal i la fibrosi. Ronyó Int. 2011;80:915–25.
11. Ordikhani F, Pothula V, Sanchez-Tarjuelo R, Jordan S, Ochando J. Macrophages in organ transplantation. Frontiers Immunol. 2020;11:582939.
12. Loverre A, Divella C, Castellano G, Tataranni T, Zaza G, Rossini M, et al. Subconjunts de cèl·lules T helper 1, 2 i 17 en pacients amb trasplantament renal amb funció de l'empelt retardat. Transpl Int. 2011;24:233–42.
13. Klauschen F, Müller KR, Binder A, Bockmayr M, Hägele M, Seegerer P, et al. Puntuació de limfòcits que infiltran tumors: des de l'estimació visual fins a l'aprenentatge automàtic. Seminari Càncer Biol. 2018;52:151–7.
14. Lauren J, Häyry P, Paavonen T. Un mètode basat en l'anàlisi d'imatges per a la quantificació dels paràmetres de l'índex de dany d'al·lograft crònic. AMPS. 2006;114:440–8.
15. Malpica N, Solórzano CO, de, Vaquero JJ, Santos A, Vallcorba I, García-Sagredo JM, et al. Aplicació d'algoritmes de conca hidrogràfica a la segmentació de nuclis agrupats. Citometria. 1997;28:289–97.
16. Lai YK, Rosin PL. Llindar circular eficient. IEEE Trans Med Imaging. 2014;23:992–1001.
17. Litjens G, Kooi T, Ehteshami Bejnordi B, Setio AAA, Ciompi F, Ghafoorian M, et al. Una enquesta sobre l'aprenentatge profund en l'anàlisi d'imatges mèdiques. Med Image Anal. 2017;42:60–88.
18. Madabhushi A, Lee G. Anàlisi d'imatges i aprenentatge automàtic en patologia digital: reptes i oportunitats. Med Image Anal. 2016;33:170–5.
19. Ehteshami Bejnordi B, Veta M, Diest PJ, van, Ginneken B, van, Karssemeijer N, Litjens G, et al. Avaluació diagnòstica d'algoritmes d'aprenentatge profund per a la detecció de metàstasis dels ganglis limfàtics en dones amb càncer de mama. JAMA. 2017;318:2199–210.
20. Hermsen M, Bel T, de, Boer M, den, Steenbergen EJ, Kers J, Florquin S, et al. Avaluació histopatològica del teixit renal basada en l'aprenentatge profund. J Am Soc Nephrol. 2019;30:1968–79.