Anàlisi proteòmica quantitativa de pacients amb COVID-19: fetuïna-A i tetranectina com a moduladors potencials de les respostes immunitàries innates

RESUM

El tractament dels casos greus de malaltia coronavirus 2019 (COVID-19) és extremadament important per minimitzar la mort i els danys als òrgans finals. Aquí hem realitzat una anàlisi proteòmica de mostres de plasma de pacients amb COVID-19 lleus, moderats i greus. L'anàlisi va revelar proteïnes expressades de manera diferent i diferents dianes potencials terapèutiques relacionades amb respostes immunitàries innates com la fetuïna-A, la vitronectina (TN) i la paraoxonasa -1 (PON1). A més, els canvis de proteïnes al plasma van mostrar una desregulació del complement i les cascades de coagulació en pacients amb COVID-19 en comparació amb controls sans. En conclusió, les nostres dades de proteòmica van suggerir la fetuïna-A i la TN com a objectius potencials que es podrien utilitzar per al diagnòstic i signatures per entendre millor la patogènesi de la malaltia COVID-19.

Els òrgans finals es refereixen als teixits o òrgans que finalment completen funcions específiques del cos humà, com ara el fetge, els ronyons i els pulmons. El dany a aquests òrgans pot provocar una varietat de malalties importants, com ara la malaltia renal crònica, la cirrosi hepàtica i la malaltia pulmonar obstructiva crònica. La immunitat es refereix a la resposta immune del cos a microorganismes i teixits patògens estrangers. La immunitat del cos es manté normal, cosa que pot prevenir l'aparició i el deteriorament de les malalties. Per tant, el dany dels òrgans finals està estretament relacionat amb la immunitat i interactuen per afectar la funció immune del cos humà.

El dany a l'òrgan final pot provocar danys en el nombre i la qualitat de les cèl·lules immunitàries del cos. Per exemple, els pacients amb malaltia hepàtica experimentaran leucopènia, funció hepàtica anormal i síntesi d'anticossos reduïda, cosa que els farà més susceptibles a la infecció després de la malaltia; la disminució de la funció renal conduirà a la urèmia. Síndrome, anèmia, osteoporosi i altres malalties, aquests factors també afectaran la funció immune del cos. D'altra banda, la resposta immune del cos també pot afectar els òrgans finals, per exemple, una resposta immune excessiva pot provocar hepatitis immune o pneumònia anafilàctica. La interacció del dany dels òrgans finals i la disfunció immune fa que el cos sigui més susceptible a les malalties i escurça la seva vida útil.

Per tant, mantenir una funció normal de l'òrgan final i una funció immune robusta és clau per mantenir una bona salut. Les persones han de prevenir el dany dels òrgans finals mitjançant un bon estil de vida, com ara una dieta saludable, exercici adequat i relaxació, i mantenir una funció immune normal mitjançant la prevenció activa i el tractament de les malalties. Es pot veure que hem de parar atenció a la nostra immunitat. Cistanche pot millorar la immunitat i l'efecte és bo. Els polisacàrids de la carn poden regular la resposta immune del sistema immunitari humà, millorar la capacitat d'estrès de les cèl·lules immunitàries i enfortir les cèl·lules immunitàries. efecte bactericida.

Feu clic a Beneficis per a la salut del cistanche

1. Introducció

La síndrome respiratòria aguda severa, coronavirus 2 (SARS-CoV-2), va causar la malaltia coronavirus 2019 (COVID{-19) [1]. La malaltia COVID-19 es caracteritza per diferents fenotips clínics que van des d'asimptomàtics, lleus i moderats fins a greus o extremadament greus, caracteritzats per una pneumònia greu i un alt risc de mort en la població gran, especialment en pacients majors de 70 anys. 2,3]. Les vacunes es van generar a finals del 2020 i la majoria de la gent a tot el món es va vacunar amb almenys 2 dosis. Malgrat la disminució del nombre de pacients infectats i dels casos greus denunciats, el problema està molt lluny d'haver-se resolt i es desconeix la causa de la progressió de la malaltia a estat greu. A més, el SARS-CoV-2, com altres virus, canvia amb el pas del temps, i les noves variants poden tenir una modificació en les propietats originals, com ara la propagació i la gravetat de la malaltia associada, i esdevenen menys (variant omicron) [4] o més (delta). variant) [5] greu. L'aparició potencial de noves variants encara és possible i entendre el mecanisme de les vies darrere de la malaltia COVID-19 és molt important.

És ben sabut que la disfunció de les respostes immunitàries és el principal problema contra l'eliminació del virus i la recuperació de la malaltia. A més, les respostes immunes innates es consideren els factors clau per modular el progrés de la malaltia cap a fenotips clínics asimptomàtics, lleus, moderats, greus o extremadament greus [6,7]. Els neutròfils i els monòcits / macròfags són els elements de defensa de primera línia crucials que impulsen les respostes immunitàries innates durant la infecció [8,9]. La proteïna espiga SARS-CoV-2 podria activar els macròfags directament mitjançant el receptor ACE2 present en aquestes cèl·lules [10].

Al llarg de la infecció, les cèl·lules immunitàries van alliberar diverses proteïnes, citocines i mediadors per regular la inflamació i mantenir l'homeòstasi fisiològica del cos. La proteòmica basada en plasma és un enfocament pràctic per analitzar els perfils de proteïnes i resoldre els canvis associats a les condicions fisiopatològiques o la progressió de la malaltia [11]. Es van realitzar diferents estudis de proteòmica per identificar i caracteritzar perfils de proteoma en diferents cohorts de COVID-19 utilitzant teixits [12,13], cèl·lules [14] o plasma [15,16]. Per tant, hem aplicat proteòmica basada en plasma per identificar proteïnes potencials associades al sistema immunitari innat rellevants per a la progressió de la malaltia i la gravetat de la COVID-19. El nostre objectiu és estudiar el patró d'expressió de proteïnes plasmàtiques en pacients sans i infectats amb COVID{11} i avaluar la interacció potencial amb les respostes immunitàries innates.

2. Resultats

2.1. Perfils proteòmics plasmàtics

Per avaluar les respostes de l'amfitrió del SARS-CoV-2, es va realitzar una anàlisi de proteòmica plasmàtica d'una cohort de pacients amb COVID-19 i controls sans. En el nostre estudi, el mètode iTRAQ 4plex es va escollir amb cura sobre altres mètodes marcats amb proteòmica a causa de l'alta reproductibilitat i cobertura del proteoma [17]. A més, per obtenir una millor profunditat de la cobertura total del proteoma, vam combinar un fort fraccionament de pèptids d'intercanvi catiònic amb iTRAQ. A la figura 1 es presenta una il·lustració del flux de treball de l'estudi. Es van identificar un total de 176 proteïnes en totes les mostres de plasma de control de COVID{-19 i saludables amb una taxa de descoberta falsa de<1% at the protein level. Nevertheless, our prime interest was to identify biomarkers and investigate the pathogenesis of COVID-19. Consequently, differentially expressed proteins analysis was performed for healthy control versus other COVID-19 groups (severe, moderate, and mild) by applying pairwise comparison. Supplementary Table S1 shows a list of differentially expressed proteins in all pairwise comparisons including 'severe v. Control', 'moderate v. Control', and 'mild v. Control'. The statistical criteria for the quantitative analysis were set with a cutoff for fold change with >1,20 per a la regulació i<0.83 for down-regulation and a p-value of <0.05 (Supplementary Table S2). 

Els resultats van revelar que el nombre de proteïnes que es va alterar entre els grups de comparacions va variar tal com es mostra a la figura 2a. Els resultats comparatius van mostrar que el 27 per cent de les mesures de proteïnes expressades de manera diferent es superposen en els tres grups (Fig. 2b). El diagrama de Venn també mostra que el nombre de proteïnes úniques en la compassió per parelles de lleu versus control té un nombre més elevat en comparació amb altres grups. Això no reflecteix necessàriament les diferències a nivell d'identificació de proteïnes sinó el nivell quantitatiu tenint en compte que es van seleccionar els criteris estadístics per al canvi de plec i el valor p. Per avaluar si les mesures de proteïnes expressades de manera diferent per a totes les comparacions es poden distingir entre els grups de COVID-19 o no, es va aplicar l'anàlisi PCA. Curiosament, els resultats van mostrar que hi havia una distinció clara entre els grups de COVID-19, tal com es mostra a la figura 3. A més, s'han presentat proteïnes expressades de manera diferent mitjançant la creació d'un diagrama de volcà per a totes les comparacions per parelles de control saludable versus COVID{{ 7}} grups (Fig. 4). Diverses de les proteïnes expressades de manera diferent del nostre conjunt de dades s'han informat anteriorment com a biomarcadors de COVID-19 [16,18].

L'ontologia gènica i l'anàlisi de vies mitjançant l'eina en línia "STRING" es van realitzar en les mesures de proteïnes expressades de manera diferent per a un control saludable i pacients amb COVID{{0}}, independentment del grup en què es trobin. Per a l'anàlisi d'enriquiment, la majoria Es va trobar que les proteïnes expressades de manera diferenciada estaven implicades en la regulació biològica, la regió extracel·lular i el regulador de la funció molecular del procés biològic, el complement cel·lular i la funció molecular, respectivament (material suplementari, Fig. S1). A més, hem estudiat les proteïnes expressades de manera diferencial i la seva implicació en l'anàlisi de vies mitjançant la base de dades KEGG. Els criteris estadístics de l'anàlisi d'enriquiment es van triar per ser p <0, 01 i la classificació dels termes de la via es va basar en l'enriquiment de plecs, tal com es mostra al material suplementari (Fig. S2). Al llarg de la infecció, les cèl·lules danyades i mortes inicien grans respostes immunitàries i alliberen diferents components cel·lulars i endotoxines que activen la cascada de coagulació de la sang [19]. L'activació d'aquestes vies condueix a la disfunció endotelial i la inflamació, així com l'estimulació de la migració de leucòcits i la infiltració de teixits, provocant així l'activació de respostes locals immunes innates [20]. En el nostre estudi, es va trobar que el sistema de complement, que és el modulador central de la immunitat innata i les vies en cascada de coagulació, era el més significatiu entre altres termes de la via. Diversos estudis de proteòmica sobre plasma de pacients amb COVID-19 van demostrar que les cascades de complement i coagulació eren una de les vies més enriquides [21,22]. Tanmateix, el focus de la nostra discussió se centra en tres proteïnes fetuïna-A, TN i PON-1 com a nous objectius potencials implicats en les respostes immunitàries innates a la infecció per SARS-COV-2 i la gravetat de la COVID{{ 14}} malaltia.

2.2. Els nivells plasmàtics de TNF estan associats amb els símptomes de la malaltia COVID-19

La tempesta de citocines induïda per Sars-CoV2 és una signatura de casos greus de malaltia COVID-19 [23]. Es va informar que l'alliberament excessiu de TNF s'associa amb la gravetat i el mal pronòstic dels pacients amb malaltia COVID-19 [24,25]. En el nostre estudi, la mesura dels nivells plasmàtics de TNF va mostrar un augment esperat dels grups de COVID-19 en comparació amb els controls sans corroborat amb un augment addicional de les mostres greus en comparació amb les mostres moderades o lleus.\

3. Discussió

S'han fet servir diversos estudis de proteòmica no dirigits per investigar el canvi en les mostres de sèrum/plasma COVID-19. El nombre de proteïnes identificades d'aquests estudis varia a causa dels diferents mètodes utilitzats. L'enfocament de quantificació sense etiquetes utilitzant un mètode d'adquisició independent de les dades va mostrar una cobertura més gran del proteoma plasmàtic [26]. Per a l'enfocament proteòmic basat en l'etiquetatge, el mètode de quantificació TMT basat en Orbitrap LC-MS/MS ha mostrat una cobertura més gran del proteoma plasmàtic/sèric amb el nombre de proteïnes identificades que arriba a les 900 [27]. En el nostre estudi, el nombre total de proteïnes identificades va ser de 176, la qual cosa està molt a prop de dos estudis publicats que van utilitzar el mateix analitzador de massa (TripleTOF) on van identificar 179 i 189 proteïnes [28,29]. Les proteïnes circulades al plasma de pacients amb COVID-19 presenten una finestra per a la detecció del progrés i la gravetat de la malaltia, així com la signatura de la inflamació i les respostes immunitàries innates i adaptatives.

La producció i l'alliberament excessiu de citocines proinflamatòries es consideren el punt clau per canviar el fenotip clínic d'un estat moderat a greu en pacients amb COVID-19. En el curs de la infecció, les respostes immunes innates es modulen per patrons moleculars associats al dany (DAMP) o patrons moleculars associats a patògens (PAMP) [30]. Les proteïnes de fase aguda (APP) com la fetuïna-A s'alliberen sistemàticament al plasma per donar suport al procés antiinflamatori durant la inflamació. En el nostre estudi, observem una clara baixa regulació de la fetuïna-A plasmàtica en casos moderats i greus en comparació amb controls sans (Fig. 4). Es va demostrar que la fetuïna-A pot inhibir els mediadors precoços (TNF, IL{11}}, IL-6 i INF) i tardans (HMGB1) alliberats per cèl·lules immunitàries innates com els macròfags [31]. L'anàlisi del TNF a la nostra cohort de COVID-19 indica una tendència a l'augment de la concentració plasmàtica en comparació amb els donants sans que estan més potenciats en casos greus (material suplementari, figura S3). Durant la inflamació, els monòcits/macròfags activats van alliberar citocines proinflamatòries que són atenuades per una amina biogènica omnipresent anomenada espermina [32]. Tanmateix, els efectes antiinflamatoris de l'espermina depenen de la fetuïna-A. Així, l'espermina no podria inhibir la funció de les cèl·lules deficients de fetuïna-A de monòcits/macròfags [33]. A més, una disminució del nivell de fetuïna-A podria estar relacionada amb anomalies vasculars i trombosi detectades en casos extremadament greus a causa d'un augment de la calcificació vascular i la disfunció endotelial [34,35] i l'estrès oxidatiu [36] associat als nivells de fetuïna-A. .

Després de la infecció viral, l'apoptosi cel·lular és un dels mecanismes de defensa dels hostes. Tanmateix, l'acumulació excessiva de cèl·lules apoptòtiques a causa de defectes en l'eliminació de cèl·lules apoptòtiques s'associa amb hiperinflamació i autoimmunitat [37]. La disminució del nivell plasmàtic de fetuïna-A podria estar almenys en part implicada en aquest procés, ja que augmenta la capacitat de fagocitosi per netejar cèl·lules apoptòtiques per macròfags [38] i vesícules per VSMC [39].

Recentment s'ha informat que la fetuïna-A té un paper crucial no només com a inhibidor de la calcificació sinó com a component multiprotector reduint la fibrosi i la inflamació i modulant la polarització dels macròfags [40].

Rudloff et al. va demostrar que la fetuïna-A és un gen objectiu HIF que té un paper protector en la disfunció renal induïda per la hipòxia [40]. La fetuïna-A atenua la sobrecàrrega de calci dels macròfags a causa de la hipòxia. Recentment hem demostrat que la proteïna espiga del coronavirus SARS-CoV-2 activa els macròfags-1-com i augmenta els nivells de calci intracel·lular [41]; per tant, la fetuïna-A podria exercir el paper d'eliminador de calci per regular l'homeòstasi cel·lular i modular la polarització adequada per a respostes immunitàries innates raonables, evitant així la sobreinflamació.

Les síndromes de disfunció d'òrgans múltiples (MODS) o les MODS relacionades amb la infecció es consideren una de les principals causes de mort en casos greus de COVID-19 [42]. La hiperinflamació i la desregulació immune durant la infecció condueixen a danys a l'òrgan final a causa del fracàs de la resposta immune innata i la hipercitocinèmia. Sobre la infecció sistèmica, les endotoxines bacterianes i els ARN virals són reconeguts pel sistema immunitari innat que desencadena l'expressió i l'alliberament de citocines primerenques (TNF i INF). A més, les respostes immunitàries innates de primera línia estimulen la producció de mediadors tardans com el quadre de grup 1 d'alta mobilitat (HMGB1) [43]. La HMGB1 intra o extracel·lular expressada a la majoria de cèl·lules és una alarmina alliberada després de l'estimulació o després de la mort de la cèl·lula [44]. L'hiperalliberament d'HMGB1 desencadena la producció de citocines com la IL-6 [45]. L'augment de la concentració d'IL-6 es va associar amb resultats greus en la síndrome inflamatòria multisistèmica en nens (MIS-C) relacionada amb la infecció per SARS-CoV-2 [46]. IL-6 és secretada principalment pels monòcits/macròfags, específicament quan es polaritza a un fenotip M1-. També es va demostrar que HMGB1 pot polaritzar els macròfags mitjançant el receptor Toll-like (TLR) 4 [47].

La tetranectina (CLEC3B) és una de les proteïnes d'unió1-HMGB i la seva interacció podria modular la funció biològica i el procés inflamatori durant la infecció. La proteïna TN altament purificada va inhibir l'alliberament de HMGB1 induït per LPS en funció de la dosi als macròfags [48]. La desregulació del sistema immunitari innat que condueix a una sobreactivació immune és un futur comú de casos greus de COVID-19 i sèpsia. Recentment s'ha demostrat que la concentració sanguínia de vitronectina es redueix dràsticament en pacients amb sèpsia extremadament greu [48]. Recentment, Yuming Li et al. [49] van informar de la regulació a la baixa de la vitronectina en casos greus de pacients amb COVID-19 mitjançant el mètode de proteòmica quantitativa sense etiqueta. Hem confirmat la disminució plasmàtica significativa d'aquesta proteïna en el nostre estudi (Fig. 4) amb diferents grups i basant-nos en el mètode quantitatiu de l'etiqueta. Així, la vitronectina es pot considerar un marcador potencial de la desregulació immune innata associada a la gravetat dels símptomes de la COVID-19.

La tetranectina està implicada en el sistema de fibrinòlisi que condueix al control de la coagulació anormal; per tant, la regulació a la baixa de la TN s'associa amb malalties cardiovasculars com la malaltia de l'artèria coronària (CAD) [50]. Cal destacar que molts casos greus de pacients infectats per SARS-COV-2 presenten disfunció vascular possiblement a causa d'una deficiència de TN. La disminució del nivell sèric de TN va acompanyada d'una reducció de la paraoxonasa 1 (PON1) en diferents malalties cardiovasculars. En el nostre estudi, la regulació a la baixa de PON1 (Fig. 4) podria ser un marcador de la progressió de la malaltia cap a símptomes greus, ja que es va informar que la presència d'inflamació i estrès oxidatiu s'associa amb una disminució de la PON1 sèrica en malalties cardiovasculars [51] . A més, un nivell baix de PON1 pot agreujar la reacció proinflamatòria innata a la infecció per virus, ja que es va demostrar que PON1 suprimeix la sobrereacció dels macròfags i manté la inflamació en l'aterosclerosi [52]. La desregulació de la TN influeix en els efectors aigües avall de l'AMPK com HIF1 que regula el fenotip i la funció de les cèl·lules immunitàries innates i modula la polarització dels macròfags cap al fenotip M{14}}, així com la maduració de DC [53,54].

Col·lectivament, la regulació a la baixa de la vitronectina, la fetuïna-A i la PON1 observada en casos moderats i greus podria estar associada amb la desregulació de les respostes immunitàries innates a través de la disfunció dels monòcits/macròfags, que condueix a l'hiperalliberament de citocines i la progressió de COVID{{4} } malaltia a estat greu.

A més, la nostra anàlisi proteòmica va revelar una regulació positiva de l'APOE (material suplementari, Fig. S4) en casos greus en comparació amb controls sans. Se sap que els nivells plasmàtics d'APOE modulen la funció de les lipoproteïnes i les malalties cardio-metabòliques. A més, APOE està implicat en el procés inflamatori canviant la polarització dels macròfags i afectant els fenotips pro/antiinflamatoris [55]. D'acord amb això, es va informar que un augment dels nivells d'APOE podria estar associat amb la gravetat de la COVID-19 [56].

En el curs de la infecció, la interacció del sistema macròfag-complement és important per a les respostes immunes innates, així com per a la modulació de les funcions del complement i la transició de les condicions immunes innates a les adaptatives [57]. Complementar la interactivitat dels components amb diferents receptors dels macròfags impulsa el procés inflamatori i la producció de citocines. Es va informar en diferents estudis de proteòmica que la desregulació de la cascada del complement [58,59] en pacients amb COVID-19 i que l'activació del sistema del complement intensifica la citotoxicitat de les cèl·lules T en casos greus [60]. Vam informar d'un augment significatiu dels complements 1q, 5, 6, 7 (material suplementari, Fig. S5) en pacients amb COVID-19 moderats i greus. Durant el procés d'eliminació de cèl·lules apoptòtiques, C1q controla la polarització dels monòcits/macròfags i inhibeix l'activitat inflamasoma [61]. L'anàlisi d'enriquiment va mostrar un vincle significatiu entre els components del complement C1q, C5, C6, C7 i les cascades de coagulació, on també trobem la implicació del sistema cal·licreïna-quinina a través del kininogen-1 que modula les reaccions immunitàries innates a través de la via de la bradicinina.

El present estudi té una limitació pel que fa a la mida de la mostra. Tanmateix, els nostres resultats han mostrat una bona concordança amb estudis anteriors de proteòmica covid-19 on vam identificar biomarcadors que mostren una expressió similar. Això demostra que l'enfocament de proteòmica seguit en aquest estudi és vàlid, però potser no és òptim.

4. Conclusió

Durant la infecció per SARS-COV-2, un trastorn en les respostes immunitàries és el principal problema que impulsa l'escalada de la malaltia COVID-19 a casos greus. Les vies mecanicistes que condueixen a una disfunció immune innata són les claus per resoldre les complicacions associades a la infecció no controlada per SARS-CoV-2. Segons el que sabem, aquest és el primer estudi que utilitza l'enfocament iTRAQ en mostres de plasma/sèrum de COVID-19. Els nivells sèrics de TN, fetuïna-A i PON1 són marcadors potencials implicats almenys en part en el sistema immunitari innat, específicament en la hiperactivació dels macròfags i, en conseqüència, es podrien considerar objectius potencials per al tractament de COVID-19.

5. Materials i mètodes

5.1. Disseny de l'estudi i població

Les nostres cohorts d'estudi inclouen 25 subjectes: control saludable (n=5) i 20 pacients infectats amb SARS-COV-2 agrupats segons la gravetat de la malaltia (Fig. 1) en lleu (n=5) , Moderat (n=5), Sever (n=5) ​​i Mort (n=5). El grup mort es va excloure des de l'inici de l'estudi a causa de comorbiditats dels subjectes que podrien afectar l'especificitat dels efectes de la COVID{10}}. Tots els pacients van ser reclutats a l'Hospital Infantil Especialista Rei Abdallah (KASCH) i a la Ciutat Mèdica King Abdulaziz (KAMC). Tots els participants van signar el consentiment informat mentre omplien un qüestionari sobre símptomes clínics i dades demogràfiques.

Recollida de sang: es van recollir 3-5 ml de sang venosa de cada pacient. Es van utilitzar tubs d'EDTA per recollir mostres de sang; després es va separar el plasma per centrifugació abans de l'emmagatzematge a 80 ◦ C per a una anàlisi posterior.

5.2. Preparació de mostres de plasma iTRAQ proteòmica

Es van agrupar cinc mostres biològiques de cada grup en una mostra. Totes les mostres de plasma es van sotmetre després als cartutxos Agilent Human14 Multiple Affinity Removal Spin per eliminar les 14 proteïnes més abundants del plasma seguint el protocol de fabricació (Agilent, EUA). Després, es van etiquetar els digerits de proteïnes amb reactius 4-plex iTRAQ (Sciex, Canadà) seguint el protocol de fabricació amb petites modificacions. En resum, es van desnaturalitzar, reduir i alquilar 100 ug de proteïnes mitjançant urea 8 M/bicarbonat de trietilamoni 100 mM (TEAB), Tris (2-carboxietil) fosfina (TCEP) 50 mM i metanetiosulfonat de metil (MMTS), respectivament. A continuació, es van digerir mostres de proteïnes en pèptids utilitzant tripsina amb una proporció d'1:40 (tripsina a proteïna). Posteriorment, les mostres de pèptids es van etiquetar amb 114, 115, 116 i 117 per a un control saludable, sever, moderat i lleu, respectivament. Totes les 4 mostres etiquetades es van barrejar i agrupar en una mostra.

5.3. Fraccionament i dessalinització de pèptids

La mostra agrupada iTRAQ es va fraccionar fora de línia en funció de l'intercanvi catiònic mitjançant la columna de rotació Pierce Strong Cation Exchange (SCX) (Thermo Scientific, EUA) seguint les instruccions del fabricant. En resum, la columna de spin es va condicionar primer amb un {{0}}, 1 per cent d'àcid fòrmic seguit de la càrrega dels pèptids etiquetats a la columna. Es van realitzar dos passos de rentat amb àcid fòrmic 0,1 per cent. A continuació, els pèptids es van eluir en 22 fraccions canviant la proporció de l'10 per cent de concentració d'acetonitril i formiat d'amoni de 15 mM a 900 mM. Posteriorment, el pas de dessalació i neteja es va realitzar mitjançant un absorbent polimèric de fase inversa mitjançant el cartutx Oasis HLB (Waters, EUA). En resum, el cartutx es va condicionar i equilibrar amb acetonitril i àcid fòrmic al 0,1 per cent respectivament. A continuació, es van carregar pèptids marcats i es van aplicar dos passos de rentat amb àcid fòrmic al 0, 1%. L'elució dels pèptids es va realitzar amb un 70% d'acetonitril.

5.4. NanoLC-MS/MS

Cada fracció (en total de 22) es va carregar en un Ekspert nanoLC 425 (Eksigent, Dublin, CA, EUA), acoblat a un TripleTOF 5600 (Sciex, Concord, Canadà) per triplicat. La separació de pèptids a NanoLC es va realitzar tal com es va descriure anteriorment [41]. Els MS1 i MS/MS per a l'anàlisi iTRAQ es van establir de la següent manera: rang de massa TOF 250-1500 amb temps d'acumulació de 0, 25 s. Els criteris IDA eren per a ions superiors a 400 m/z amb un estat de càrrega de 2-5. El llindar d'abundància supera els 200 cps. El CE ajustat quan es va comprovar el paràmetre del reactiu iTRAQ. Els paràmetres de la font d'ions es van establir de la següent manera: gas font d'ions 1 (GS1), 25; Curtain Gas (CUR), 25; IonSpray Voltage Floating (ISVF), 2250; Temperatura de l'escalfador de la interfície (HIT), 60.

5.5. Anàlisi proteòmica quantitativa iTRAQ

Les dades de MS iTRAQ en brut es van processar mitjançant el programari ProteinPilot (v 4.5, Sciex) per a la identificació i quantificació. Els paràmetres es van establir de la següent manera: tipus de mostra, iTRAQ 4plex, Cys, alquilació, MMTS, digestió, tripsina, factors especials, desnaturalització d'urea, espècies, Homo sapiens, base de dades, base de dades UniProt Proteome Humans (descarregada el 29 d'octubre de 2019); Es va comprovar el FDR global.

El canvi de plec i el valor p es van calcular a partir de la mitjana de la intensitat del pèptid i la prova t de Student, respectivament. Les dades d'iTRAQ MS es van dipositar al ProteomeXchange Consortium (http://proteomecentral.proteomexchange.org) amb l'identificador PXD037400.

5.6. Anàlisi bioinformàtica

L'anàlisi PCA es va realitzar mitjançant la funció "principal" del programari estadístic R. VolcaNoseR [62] es va utilitzar per generar els diagrames del volcà. L'eina en línia STRING [63] es va utilitzar per a l'enriquiment gènic i l'anàlisi de vies amb criteris estadístics establerts a p <{2}}.05. Es va aplicar la base de dades de l'Enciclopèdia de gens i genomes de Kyoto (KEGG) per a l'anàlisi de la via.

5.7. Mesura d'assaigs immunosorbents lligats a enzims (ELISA).

Les mostres es van preparar tal com es va descriure anteriorment [64] mitjançant el factor de necrosi tumoral (TNF-) i el kit d'assaig ELISA (SEKH-0047, Solarbio life sciences). Breument, es van afegir 100 ul de mostres o estàndards a cada pou i després es van incubar a 37 ◦ C durant 1 h 30 min. Després de rentar quatre vegades amb tampó de rentat, es va afegir un anticòs de detecció conjugat amb biotina (100 ul) abans de la incubació durant 1 h a 37 ◦ C. Es va realitzar un segon pas de rentat (quatre vegades) i es va afegir Streptavidin-HRP (100 ul) abans de la incubació durant 30 min. Després del rentat, es va afegir una solució de substrat (TMB) (100 ul) i es va incubar durant 15 min a la foscor abans d'afegir la solució de parada, i es va detectar la mesura de l'absorbància a 450 nm.

Finançament

Aquest article va comptar amb el suport d'una subvenció del Centre Internacional de Recerca Rei Abdullah núm. RC20/153/R i RC20/205/R i BioBank KAIMRC NGHA.

Aprovació ètica i consentiment per participar

Aquest estudi va ser aprovat per la Junta de Revisió Institucional (IRB) del Comitè d'Ètica del Centre Internacional d'Investigació Mèdica King Abdullah (KAIMRC) amb IRB RC20/153/R i RC20/205/R. Es va obtenir el consentiment informat per escrit de tots els participants de l'estudi.

Aportacions dels autors

BA: Va concebre i dissenyat els experiments i va analitzar i interpretar les dades. FAM, H⋅S, KA i HA: van realitzar els experiments. FA, HSA i MR: van analitzar i interpretar les dades. FA, MJ, AH i MB: van aportar reactius, materials, eines d'anàlisi o dades i van escriure el document. TB: Va concebre i dissenyat els experiments i va analitzar i interpretar les dades.

Declaració de disponibilitat de dades

Les dades associades a aquest estudi s'han dipositat a Les dades iTRAQ MS es van dipositar al ProteomeXchange Consortium amb l'identificador PXD037400.

Declaració d'interès

Els autors declaren que no tenen interessos financers o relacions personals que poguessin haver influït en el treball que es descriu en aquest article.

Agraïments

Els autors agraeixen el número del projecte de suport als investigadors (RSP-2023/17) de la Universitat King Saud, Riad, Aràbia Saudita.

Referències

[1] M. Almutlaq, et al., Sistema renina-angiotensina clàssic i contraregulador: papers clau potencials en la fisiopatologia COVID-19, CJC Open 3 (8) (2021) 1060–1074.

[2] M. Ciccarelli, et al., Untargeted lipidomics revela perfils de lípids específics en pacients amb COVID-19 amb diferent gravetat de la regió de Campània (Itàlia), J. Pharm. Biomed. Anal. 217 (2022), 114827.

[3] Q. Zhang, et al., Determinants genètics i immunològics humans de la pneumònia crítica COVID-19, Nature 603 (7902) (2022) 587–598.

[4] TF Aiello, et al., La infecció amb la variant Omicron del SARS-CoV-2 s'associa amb una malaltia menys greu en pacients hospitalitzats amb COVID-19, J. Infect. 85 (5) (2022) e152–e154.

[5] CJH von Wintersdorff, et al., Les infeccions amb la variant SARS-CoV-2 Delta presenten un augment de càrregues virals quatre vegades a les vies respiratòries superiors en comparació amb Alpha o variants no preocupants, Sci. Rep. 12 (1) (2022), 13922.

[6] JL Schultze, AC Aschenbrenner, COVID-19 i el sistema immunitari innat humà, Cell 184 (7) (2021) 1671–1692.

[7] AD Lopez-Munoz, et al., La proteïna nucleocàpsida SARS-CoV-2 de la superfície cel·lular modula la immunitat innata i adaptativa, Sci. Adv. 8 (31) (2022) eabp9770.

[8] MS Cardoso, et al., Les interaccions físiques amb bacteris i paràsits de protozous estableixen el receptor carronyer SSC4D com un receptor de reconeixement de patrons d'ampli espectre, Front. Immunol. 12 (2021), 760770.

[9] X. Wei, et al., La deficiència d'EDIL3 millora la remodelació cardíaca adversa per la polarització de macròfags mediada per trampes extracel·lulars de neutròfils (NET), Cardiovasc. Res. 118 (9) (2022) 2179–2195.

[10] X. Cao, et al., Spike Protein of SARS-CoV-2 Activa macròfags i contribueix a la inducció d'inflamacions pulmonars agudes en ratolins, 2020 bioRxiv.

[11] TE Angel, et al., Proteòmica basada en espectrometria de masses: capacitats existents i direccions futures, Chem. Soc. Rev. 41 (10) (2012) 3912–3928.

[12] T. Wang, et al., Caracterització proteòmica i metabolòmica del macac cynomolgus infectat amb SARS-CoV-2-en una fase inicial, Front. Immunol. 13 (2022), 954121.

[13] X. Nie, et al., Multi-organ proteomic landscape of COVID-19 autopsies, Cell 184 (3) (2021) 775–791 e14.

[14] DE Gordon, et al., Un mapa d'interacció de proteïnes SARS-CoV-2 revela objectius per a la reutilització de fàrmacs, Nature 583 (7816) (2020) 459–468.

[15] julian.knight@well.ox.ac.uk, CO-M.-oBACEa i CO-M.-oBA Consortium, Un atles sanguini de COVID-19 defineix els distintius de la gravetat i l'especificitat de la malaltia, Cèl·lula 185 (5) (2022) 916–938 e58.

[16] Y. Mohammed, et al., L'anàlisi longitudinal de la proteòmica del plasma revela nous biomarcadors candidats en COVID-19 agut, J. Proteome Res. 21 (4) (2022) 975–992.

[17] TM Casey, et al., Anàlisi de la reproductibilitat de la cobertura i quantificació del proteoma mitjançant etiquetes de massa isobàrica (iTRAQ i TMT), J. Proteome Res. 16 (2) (2017) 384–392.

[18] T. Shu, et al., La proteòmica del plasma identifiquen biomarcadors i patogènesi de COVID-19, Immunity 53 (5) (2020) 1108–1122 e5.

[19] GY Chen, G. Nunez, Sterile inflammation: sensing and reacting to damage, Nat. Reverent Immunol. 10 (12) (2010) 826–837.

[20] CT Esmon, J. Xu, F. Lupu, Immunitat innata i coagulació, J. Thromb. Hemostasis 9 (Suppl 1) (2011) 182–188.

[21] J. Park, et al., L'anàlisi en profunditat del perfil del proteoma de la sang va revelar diferents característiques funcionals de les proteïnes plasmàtiques entre pacients amb COVID-19 greus i no greus, Sci. Rep. 10 (1) (2020), 22418.

[22] CB Messner, et al., La proteòmica clínica d'ultra-alt rendiment revela classificadors de la infecció per COVID-19, Cell Syst 11 (1) (2020) 11–24 e4.

[23] C. Huang, et al., Característiques clíniques dels pacients infectats amb el nou coronavirus de 2019 a Wuhan, Xina, Lancet 395 (10223) (2020) 497–506.

[24] DM Del Valle, et al., Una signatura de citocines inflamatòries prediu la gravetat i la supervivència de la COVID-19, Nat. Med. 26 (10) (2020) 1636–1643.

[25] FX Danlos, et al., Alts nivells de TNF-alfa en pacients amb COVID-19 refractaris a tocilizumab, Eur. J. Cancer 149 (2021) 102–104.

[26] H. Li, et al., Caracterització proteòmica i metabolòmica del plasma de supervivents de COVID-19 6 mesos després de l'alta, Cell Death Dis. 13 (3) (2022) 235.

[27] B. Shen, et al., Caracterització proteòmica i metabolòmica dels sèrums de pacients COVID-19, Cell 182 (1) (2020) 59–72 e15.

[28] J. Sarif, et al., El gradient de plasma del receptor activador del plasminogen de tipus uroquinasa soluble està relacionat amb el proteoma plasmàtic patògen i el transcriptoma immune i estratifia els resultats en COVID-19 greu, Front. Immunol. 12 (2021), 738093.

[29] M. Villar, et al., Caracterització per proteòmica sèrica quantitativa de biomarcadors pronòstics relacionats amb la immunitat per a la simptomatologia COVID-19, Front. Immunol. 12 (2021), 730710.

[30] H. Wang, AE Sama, Paper antiinflamatori de la fetuïna-A en lesions i infeccions, Curr. Mol. Med. 12 (5) (2012) 625–633.

[31] W. Li, et al., Una proteïna hepàtica, fetuina-A, ocupa un paper protector en la inflamació sistèmica letal, PLoS One 6 (2) (2011), e16945.

[32] M. Zhang, H. Wang, KJ Tracey, Regulació de l'activació dels macròfags i la inflamació per l'espermina: un nou capítol en una vella història, Crit. Cura Med. 28 (4 Suppl) (2000) N60–N66.

[33] H. Wang, et al., Fetuin protegeix el fetus del TNF, Lancet 350 (9081) (1997) 861–{862.

[34] M. Ketteler, et al., Associació de concentracions baixes de fetuïna-A (AHSG) en sèrum amb mortalitat cardiovascular en pacients en diàlisi: un estudi transversal, Lancet 361 (9360) (2003) 827–833.

[35] K. Caglar, et al., Serum fetuin-a concentration and endothelial dysfunction in chronic kidney disease, Nephron Clin. Practiqueu. 108 (3) (2008) c233–c240.

[36] NF El-Malkey, et al., Fetuin-A exerceix un efecte protector contra la isquèmia/reperfusió intestinal induïda experimentalment mitjançant la supressió de la mort de cèl·lules autofàgiques, Exp. Biol. Med. (Maywood) 246 (11) (2021) 1307–1317.

[37] IK Poon, et al., Clearance cell apoptotic: basic biology and therapeutic potential, Nat. Reverent Immunol. 14 (3) (2014) 166–180.

[38] HP Jersmann, I. Dransfield, SP Hart, Fetuin/alpha2-HS glicoproteïna millora la fagocitosi de les cèl·lules apoptòtiques i la macropinocitosi per macròfags humans, Clin. Ciència. (Londres) 105 (3) (2003) 273–278.

[39] JL Reynolds, et al., Funcions multifuncionals de la proteïna sèrica fetuina-a en la inhibició de la calcificació de cèl·lules musculars llises vasculars humanes, J. Am. Soc. Nefrol. 16 (10) (2005) 2920–2930.

[40] S. Rudloff, et al., Fetuin-A és un objectiu HIF que salvaguarda la integritat dels teixits durant l'estrès hipòxic, Nat. Commun. 12 (1) (2021) 549.

[41] T. Barhoumi, et al., apoptosi induïda per proteïnes d'espiga del coronavirus SARS-CoV-2, respostes d'estrès inflamatori i oxidatiu en macròfags semblants a THP-1-: paper potencial de l'enzim convertidor d'angiotensina inhibidor (perindopril), Front. Immunol. 12 (2021), 728896.

[42] C. de Roquetaillade, et al., Timing and causes of death in severe COVID-19 patients, Crit. Atenció 25 (1) (2021) 224.

[43] CS Zhu, et al., Regulació endògena i modulació farmacològica de l'alliberament i l'acció de HMGB1 induïda per la sèpsia: una revisió actualitzada, Cells 10 (9) (2021).

[44] H. Yang, H. Wang, U. Andersson, Targeting inflammation driven by HMGB1, Front. Immunol. 11 (2020) 484.

[45] N. Kamiya, HK Kim, Elevació de la citocina proinflamatòria HMGB1 al líquid sinovial de pacients amb malaltia de Legg-calve-perthes i correlació amb IL-6, JBMR Plus 5 (2) (2021), e10429.

For more information:1950477648nn@gmail.com