Determinació ràpida simultània de sis components efectius a Cistanche Tubulosa mitjançant espectroscòpia infraroja propera
Mar 06, 2022
Contacte: Audrey Hu Whatsapp/hp: 0086 13880143964 Correu electrònic:audrey.hu@wecistanche.com
Xinhong Wang, Xiaoguang Wang i Yuhai Guo
Resum:
La determinació quantitativa de múltiples components efectius en una planta determinada sol requerir una quantitat molt gran de productes naturals autèntics. En aquest estudi, vam proposar un mètode ràpid i no destructiu per a la determinació simultània d'equinacòsid, verbascòsid, manitol, sacarosa, glucosa i fructosa enCistanche tubulosamitjançant espectroscòpia infraroja propera (NIRS). L'espectroscòpia de reflectància difusa d'infraroig proper (DRS) i la cromatografia líquida d'alt rendiment (HPLC) es van realitzar en 116 lots de mostres de Cistanche tubulosa. Les dades del DRS es van processar mitjançant mètodes estàndard de varietat normal (SNV) i correcció de dispersió multiplicativa (MSC). Es va utilitzar la regressió de mínims quadrats parcials (PLSR) per construir models de calibratge per a components d'interès en Cistanche tubulosa. A continuació, es van avaluar tots els models calculant l'error quadrat mitjà de calibratge (RMSEC), el coeficient de correlació de calibratge (r). Es va determinar que els valors r dels sis models de calibratge eren superiors a 0,94, cosa que suggereix que cada model és fiable. Per tant, els models NIR quantitatius reportats en aquest estudi es poden qualificar per quantificar amb precisió el contingut de sis components medicinals enCistanche tubulosa.
Paraules clau: Cistanche tubulosa; cromatografia líquida d'alt rendiment; espectroscòpia infraroja propera; mínims quadrats parcials
Introducció
Cistanche(Hoffmg. Et Link) és un gènere fanerogàmic perenne de la família de plantes Orobanchaceae. La majoria de les espècies pertanyents al gènere Cistanche s'han utilitzat com a planta medicinal durant mil·lennis a la Xina; tenir fama de tònic superior; i es coneixen com "Ginseng dels deserts" [1,2].Cistanche tubulosaés un paràsit obligat de les arrels de la planta perenne Tamarix Chinensis. S'ha documentat a la Farmacopea Xinesa com la font autèntica de Cistanches Herba (nom xinès: Roucongrong) des de l'edició de 2005 [3]. La investigació farmacològica moderna sobre les espècies de Cistanche es va iniciar a la dècada de 1980 [4]. Les investigacions farmacològiques van demostrar que els extractes de plantes de Cistanche posseeixen un ampli espectre d'activitats, com curar la deficiència renal i el restrenyiment senil, avançar en la capacitat d'aprenentatge i memorització, contra la malaltia d'Alzheimer, millorar la immunitat, antienvelliment, antifatiga, etc. [1,5–7]. En les últimes tres dècades, s'han combinat estudis farmacològics exhaustius i sistemàtics amb investigacions fitoquímiques per il·luminar la base material dels efectes beneficiosos de les arrels de les plantes de Cistanche. Aquestes enquestes indiquen que els glucòsids feniletanoides (PhGs) eren els principals components efectius a les plantes de Cistanche jugant un paper clau per al tractament de la deficiència renal, la impotència [8], l'anti-envelliment [9] i la malaltia d'Alzheimer [10]. El contingut de dos PhG (echinacòsid i verbascòsid) era obligatori a la farmacopea xinesa. Mentrestant, els hidrats de carboni com el manitol, la sacarosa, la glucosa i la fructosa de les plantes de Cistanche posseeixen la funció laxant i els grups de carbohidrats de les plantes de Cistanche s'han utilitzat per al tractament del restrenyiment [11].
Recursos salvatges deCistanche tubulosaes distribueixen principalment a l'àrea que envolta el desert de Taklamakan al sud de la regió autònoma de Xinjiang a la Xina. De manera semblant a moltes altres espècies utilitzades com a medicaments tradicionals xinesos (MTC), C. tubulosa té un gran valor econòmic i gairebé s'ha extingit en el seu hàbitat salvatge a causa de l'excés de recollida. El cultiu de C. tubulosa va començar a la dècada de 1990 a la Xina per garantir el subministrament de matèries primeres per a Cistanches Herba així com protegir els recursos vegetals silvestres. A partir del 2017, existeixen prop de 13 mil hectàrees de C. tubulosa cultivades a la prefectura de Hotan a Xinjiang [12,13]. Es demanen avenços en la tecnologia de plantació ampliant el cultiu així com millorant la qualitat deCistanche tubulosa.
L'objectiu principal del cultiuCistanche tubulosaés produir Cistanches Herba, essent ric en aquells components efectius. Tanmateix, el contingut dels components efectius de Cistanches Herba, com ara PhG i oligosacàrids, es pot veure afectat significativament per molts factors durant la producció [12,13]. S'hauria d'explorar un sistema de detecció en temps real de la qualitat de C. tubulosa. Per tant, és necessari desenvolupar un mètode d'alt rendiment per satisfer completament el requisit d'analitzar un gran nombre de mostres en un curt període de temps. Tradicionalment, la determinació d'aquests components efectius primaris, com els PhG i els hidrats de carboni, a C. tubulosa s'aconseguia normalment mitjançant cromatografia líquida d'alt rendiment (HPLC) [14,15]. Tot i que és precís i fiable, requereix molt de temps i és laboriós per a la recollida i el processament de dades. A més, també es requereix una gran quantitat de temps i esforç per a la preparació de mostres que normalment implica la polverització, extracció i filtració dels assaigs HPLC. Per tant, cal un principi clar i una eina fàcil d'utilitzar per obtenir una quantitat relativament gran de dades. Afortunadament, l'espectroscòpia d'infraroig proper (NIRS) s'ha utilitzat àmpliament per avaluar productes agrícoles [16], aliments [17], mostres mèdiques [18] i productes farmacèutics [19] perquè és ràpida i no destructiva. Per tant, NIRS podria coincidir exactament amb els requisits per a mesures eficients de TCM, i no és sorprenent que NIRS s'hagi aplicat per a la identificació qualitativa [20, 21] i la quantificació de compostos [22] en TCM.
En aquest estudi, el contingut de sis components efectius, inclosos l'equinacòsid, el verbascòsid, el manitol, la sacarosa, la glucosa i la fructosa en 116 lots de mostres de C. tubulosa que es van recollir a la prefectura de Hotan a Xinjiang entre 2013 i 2015 van ser determinats per HPLC. Posteriorment, es van establir els models de calibratge d'aquests sis components amb el mètode de regressió parcial de mínims quadrats (PLSR). Aquests models es van validar després amb el coeficient de correlació i els errors de predicció en els conjunts de calibratge. Els resultats van demostrar que el mètode desenvolupat es podria utilitzar com a mètode fiable per a l'anàlisi quantitativa de C. tubulosa.
Resultat
Anàlisi HPLC
El contingut d'echinacòsid i verbascòsid es va determinar mitjançant un mètode HPLC-UV ben definit a la literatura [3, 23] i es van determinar quatre hidrats de carboni (manitol, sacarosa, glucosa i fructosa) mitjançant un mètode HPLC-ELSD ben definit en la literatura [24] per a les 116 mostres. Els mètodes de preparació i determinació de la mostra es van descriure a les seccions 3.1 i 3.3. La figura 1 mostra els cromatogrames característics dels estàndards mixtes. Es pot veure que els sis components efectius estaven separats de referència i, per tant, es podrien quantificar. El mètode HPLC es va validar abans de la prova de mostra. Els resultats principals del mètode HPLC es mostren a la taula 1. En els resultats es mostren una relació lineal favorable (r=0.9998) i una recuperació (98,5 per cent ) del mètode de determinació d'equinacòsid, el mateix resultat que tots els cinc components. Per tant, el contingut dels sis components efectius es pot determinar amb precisió. Tots els intervals de contingut determinats es resumeixen a la taula 1.
Anàlisi NIRS
La figura 2 mostra els espectres NIR (4000–10,000 cm−1) de les mostres de C. tubulosa. Els pics d'absorció significatius van aparèixer de 4000 cm-1 a 7500 cm-1 en totes les mostres, mentre que van aparèixer suaus fluctuacions de 7500 cm-1 a 10.000 cm-1. La deriva de la línia de base dels espectres NIR es va produir perquè la mostra es va veure fàcilment afectada per factors com la mida i el color de les partícules (figura 2A). Els pretractaments matemàtics dels espectres es van utilitzar per reduir la influència d'informació innecessària fins a cert punt. Els pretractaments matemàtics inclouen primera derivació (1a derivació), segona derivació (2a derivació), varietat normal estàndard (SNV) i correcció de dispersió multiplicativa (MSC). La figura 2B mostra la segona derivació dels espectres NIR de C. tubulosa, i òbviament s'observen les variacions significatives que es van produir a partir de tres regions, 4000–4500 cm−1, 5000–5500 cm−1 i 7000–7500 cm−1. .
Establiment de Models de Calibratge Quantitatius
La regressió de mínims quadrats parcials (PLSR) és un mètode de modelització clàssic i s'ha aplicat àmpliament en models quantitatius a causa de l'alta qualitat dels resultats. Els avantatges de PLSR inclouen la seva bona capacitat de previsió i relativa simplicitat. El PLSR també s'ha aplicat àmpliament en l'establiment de models de calibratge quantitatius de TCM [25]. A partir dels espectres NIR pretractats i el model d'anàlisi quantitativa NIR dels sis components efectius de C. tubulosa es va establir mitjançant el mètode PLSR amb dades d'anàlisi HPLC com a valors reals. Les 116 mostres es van dividir aleatòriament en conjunts de calibratge i validació amb una proporció de 3:1. Les condicions més adequades per al calibratge es van escollir per un RMSEC baix i un coeficient de correlació alt.
Selecció de la banda d'ona per als models de calibratge
La selecció d'una banda d'ona adequada va ser un pas important per a la construcció de models de calibratge. En aquest estudi, es van comparar els espectres d'interval NIR de 4000–7500 cm-1 (recomanat pel programari d'analista TQ) i 4{000-10.000 cm-1. Es va observar que aquest rang no era adequat per al calibratge a l'interval entre 4000 cm-1 i 7500 cm{-1 de la taula 2. Per tant, en l'estudi actual, els intervals espectrals dels sis constituents químics eren tots seleccionats de l'interval de 4000 a 10.000 cm-1 comparant els rendiments de RMSEC i el coeficient de correlació.
Selecció del nombre òptim de factors per als models de calibratge
El PLSR explica la màxima variabilitat de les dades reduint la dimensionalitat de les dades de l'espectre mitjançant el càlcul de factors. El problema de la "inadaptació" va aparèixer a causa d'una informació insuficient que va resultar d'un nombre limitat de factors; tanmateix, l'elecció dels factors més grans que els valors òptims introduïts en el model provocarà el problema del "sobreajustament". Tant la "inadaptació" com la "sobreadaptació" reduiran el poder predictiu dels models establerts [22]. La figura 3 mostra la relació entre RMSECV i factors per als sis compostos. Per tant, vam seleccionar aquells factors corresponents als valors més baixos de RMSECV. La selecció òptima de factors per als models de calibratge es mostra a la taula 3.
Selecció de pretractament espectral per als models de calibratge
Un altre factor d'influència més crític per als models de calibratge és el pretractament espectral que té com a objectiu reduir la influència de la dispersió i la deriva de la línia de base, millorar les relacions senyal-soroll i eliminar les variacions irregulars. Es van utilitzar mètodes de correcció de dispersió multiplicativa (MSC) i de variació normal estàndard (SNV) per eliminar la influència de la dispersió de la radiació habitual. Per resoldre els efectes de la deriva de la línia de base, es van comparar els espectres de la primera i la segona derivada i es va seleccionar la segona derivació [26]. Per obtenir l'efecte desitjable, vam suavitzar els espectres amb l'algoritme de filtre Savitzky-Golay (SG) abans de la derivació per evitar l'ampliació del soroll. La taula 3 mostra la informació sobre el pretractament espectral i els seus resultats per als models de calibratge.
Avaluació dels models establerts
Un bon model de calibratge NIRS hauria de tenir valors RMSEC i RMSEP baixos, així com un coeficient de correlació elevat (r) i petites diferències entre RMSEC i RMSEP [27–29]. Els models de calibratge dels sis compostos seleccionats es van establir segons els procediments esmentats anteriorment (Taula 3). Els valors RMSEC i r per al conjunt de calibratge d'echinacòsid eren 27,6 i 0,9808, respectivament. Els paràmetres de rendiment d'altres models de compostos químics es mostren a la Taula 3, de la qual podem concloure que els models establerts emergeixen resultats de predicció satisfactoris i es poden utilitzar per a l'anàlisi quantitativa ràpida de C. tubulosa. A la figura 4 es mostren gràfics de dispersió dels sis compostos químics per fer que els models de calibratge siguin més descriptius i observats visualment. Com es mostra a la figura 4, es van produir diferències menors entre els valors predictius i mesurats, perquè la majoria de punts es van distribuir al voltant de la corba regressiva amb una equació com y=x. Per tant, es van observar excel·lents rendiments predictius a la figura 4.
Materials i mètodes
Preparació de la mostra
Es van recollir cent setze mostres de C. tubulosa de la prefectura de Hotan a la regió autònoma de Xinjiang entre 2013 i 2015. Totes les mostres es van conrear, però es van recollir en diferents etapes de creixement. El pes fresc de les mostres oscil·lava entre 20 g i 1000 g. Després d'assecar-se al sol, les mostres seques es van triturar i es van tamisar a través d'un 60-tamís de malla [3,23].
Recollida de dades espectroscòpiques NIR
Els espectres NIR de les mostres es van recollir a un interval de 8 cm-1 sobre la regió espectral de 4000-10.000 cm{-1 amb un sistema Antaris MXFT-NIR (Thermo Scientific, Madison, WI, EUA) equipat amb un adaptador de reflectància de fibra òptica de mà. Cada espectre es va obtenir amb una mitjana de 64 exploracions. Es va deixar que totes les mostres s'equilibressin a temperatura ambient (25 ºC) abans de l'exploració d'espectres NIR per assegurar-se que les mostres s'analitzaven a la mateixa temperatura. La humitat al laboratori es va mantenir a un nivell ambiental.
Recollida de dades HPLC
Preparació d'extracció
Es va extreure un gram de pols de C. tubulosa amb 50 ml de metanol al 50 per cent en un matràs cònic amb ultrasons (500 W, 40 kHz) durant 30 min. L'extracte es va emmagatzemar a 4 ◦ C. El sobrenedant de l'extracte es va filtrar per obtenir una mostra per a l'anàlisi HPLC [3, 23].
Determinació simultània d'echinacòsid i verbascòsid amb HPLC-UV
L'anàlisi de cromatografia líquida es va dur a terme en un sistema Shimadzu UHPLC (Shimadzu, Kyoto, Japó) que consta de dues unitats de lliurament de dissolvents LC{-20ADXR, una bomba LC-20AD, un mostreig SIL-20ACXRauto , un forn de columna CTO-20AC, un detector DAD SPD-M20A, desgasificador DGU-20A3R i un controlador ICBM-20.
Una columna Grace Prevail Carbohydrate ES (150 × 2,1 mm, 2,7 mm) utilitzada per a les separacions cromatogràfiques es va mantenir a 35 ◦C. La fase mòbil estava formada per acetonitril (A) i 0,1 per cent d'àcid fòrmic aquós (B) i es va lliurar seguint el programa de gradient de la següent manera: 0-7 min, un gradient lineal de 10-20 percentatge A; 7–15 min, 20 per cent A; i de 15 a 20 min, un gradient lineal del 20 al 10 per cent A. La taxa de companys de la fase mòbil va ser de 0,4 ml/min. El control UV es va realitzar a 330 nm.
Determinació simultània de manitol, sacarosa, glucosa i fructosa amb HPLC-ELSD
L'HPLC es va realitzar en un sistema LC Agilent sèrie 1100 (Palo Alto, CA, EUA) format per un desgasificador aG1322A, una bomba quaternària G1311A, un mostreig automàtic G1311A, un controlador de temperatura de columna G1316A i un detector DAD G1315B.
Es va utilitzar una columna Sigma Prevail Carbohydrate ES (4,6 × 250 mm, 5 µm) per a separacions cromatogràfiques i es va mantenir a una temperatura de columna de 25 ◦C. La fase mòbil estava composta per acetonitril i aigua (77:23, v/v) i un aliat isocràtic subministrat a una velocitat similar de 0,7 ml/min. L'efluent es va controlar mitjançant un detector de dispersió de la llum evaporativa (ELSD) amb paràmetres predeterminats [23, 24].
Tractament de dades
Es va utilitzar TQ Analyst (versió 8.0, Thermo Scientific, Madison, WI, EUA) per realitzar la divisió dels conjunts de calibratge i validació, el pretractament matemàtic dels espectres, l'establiment dels models de calibratge i altres càlculs. Per fer les figures es va utilitzar Origin (versió 9.1).
Conclusions
Agraïments: aquest treball va comptar amb el suport del National Science and Technology Planning Project of China (2015BAD29B00-04).
Contribucions de l'autor: Xinhong Wang va concebre i dissenyar els experiments. Xinhong Wang i Xiaoguang Wang van realitzar els experiments. Xinhong Wang i Yuhai Guo van escriure el document.
Conflictes d'interessos: els autors declaren que no hi ha conflictes d'interessos.
Referències
Jiang, Y.; Tu, PF Anàlisi de components químics en espècies de cistanche. J. Cromatogr. 2009, 1216, 1970–1979. [CrossRef] [PubMed]
Xu, R.; Chen, J.; Chen, S.-L.; Liu, T.-N.; Zhu, W.-C.; Xu, J. Cistanche deserticola Ma cultivat com a nou cultiu a la Xina. Genet. Recurs. Crop Evol. 2008, 56, 137–142. [Ref creuat]
Edició del Comitè de Farmacopea Xinesa. Farmacopea xinesa, 2005a ed.; Chemical Industrial Press: Beijing, Xina, 2005; Volum 1, pàg. 90.
Kobayashi, H.; Komatsu, J. Constituents of cistanchE herba (1). Yakugaku Zasshi 1983, 103, 508–511. [CrossRef] [PubMed]
Cançó, ZH; Lei, L.; Tu, PF Avenços en la investigació de l'activitat farmacològica en plantes de cistanche huffing. Et enllaç. Barbeta. Tradit. Herba. Drogues 2003, 34, 473–476.
Xiong, Q.; Kadota, S.; Tani, T.; Namba, T. Efectes antioxidants dels feniletanoides de Cistanche deserticola. Biol. Farmàcia. Bou. 1996, 19, 1580–1585. [CrossRef] [PubMed]
Xuan, GD; Liu, CQ Investigació sobre l'efecte dels glicòsids feniletanoides (PEG) de la Cistanche deserticola sobre l'anti-envelliment en ratolins vells induït per D-galactosa. J. Chin. Med. Mater. 2008, 31, 1385–1388.
Sato, T.; Kozima, S.; Kobayashi, K.; Kobayashi, H. Estudis farmacològics sobre Cistanchis Herba. I. Efectes dels components de Cistanchis Herba sobre el sexe i el comportament d'aprenentatge en ratolins amb estrès crònic. Yakugaku Zasshi 1986, 105, 1131–1144. [Ref creuat]
Shen, CY; Jiang, JG; Yang, L.; Wang, DW; Zhu, W. Ingredients actius anti-envelliment d'herbes i nutracèutics utilitzats en la medicina tradicional xinesa: mecanismes farmacològics i implicacions per al descobriment de fàrmacs. Br. J. Pharmacol. 2016, 11, 1395–1425. [CrossRef] [PubMed]
Li, N.; Wang, J.; Ma, J.; Gu, Z.; Jiang, C.; Yu, L.; Fu, X. Efectes neuroprotectors de la teràpia amb herbes Cistanches en pacients amb malaltia d'Alzheimer moderada. Evid. Complement de base. Altern. Med. 2015, 2015. [CrossRef] [PubMed]
Gao, JY; Jiang, Y.; Dai, F.; Han, ZL; Liu, HY; Bao, Z.; Zhang, TM; Tu, PF Estudi sobre constituents laxants a Cistanche deserticola YC Ma. Mod. Barbeta. Med. 2015, 17, 307–310.
Tu, PF; Chen, QL; Jiang, Y.; Guo, YH; Yang, TX; Wang, XY; Aierkan, M.; Li, XB; Du, Y.; Nan, ZD; et al. Tècniques de cultiu de Cistanche tubulosa i el seu hoste Tamarix spp. Mod. Barbeta. Med. 2015, 17, 349–358.
Tu, PF; Jiang, Y.; Guo, YH; Tian, YZ; Li, XB; Wang, XY; Wei, J.; Chen, QL; Aierkan, M. Desenvolupament de la indústria ecològica de cistanches herba per promoure la civilització ecològica de la regió del desert occidental. Mod. Barbeta. Med. 2015, 17, 297–301.
Lu, DY; Zhang, JY; Yang, ZY; Liu, HM; Li, S.; Wu, BJ; Ma, ZG Anàlisi quantitativa de cistanches herba mitjançant cromatografia líquida d'alt rendiment juntament amb detecció de matrius de díodes i espectrometria de masses d'alta resolució combinada amb mètodes quimiomètrics. J. Set. Sci. 2013, 36, 1945–1952. [CrossRef] [PubMed]Molecules 2017, 22, 843 9 de 9
Jiang, Y.; Li, SP; Wang, YT; Chen, XJ; Tu, PF Diferenciació d'herbes cistanches per empremta digital amb cromatografia líquida d'alt rendiment-detecció de matrius de díodes-espectrometria de masses. J. Cromatogr. 2009, 1216, 2156–2162. [CrossRef] [PubMed]
