Microscòpia de conductància iònica d'escaneig del glomèrul humà viu

Per a més informació:ali.ma@wecistanche.com

Ruslan Bohovyk1,2|Mykhailo Fedoriuk1,2|Elena Isaeva1,2|Andrew Shevchuk3|Oleg Palygin1|Alexander Staruschenko 1,4

1Departament de Fisiologia, Medical College of Wisconsin, Milwaukee, WI, EUA2Departament de Membranologia Cel·lular, Bogomoletz Institute of Physiology, Kíev, Ucraïna3Departament de Medicina, Imperial College London, Londres, Regne Unit4Clement J. Zablocki VA Medical Center, Milwaukee, WI, EUA

CorrespondènciaAlexander Staruschenko i Ruslan Bohovyk, Departament de Fisiologia, Medical College of Wisconsin, 8701 Watertown Plank Road, Milwaukee, WI 53226, EUA. Correus electrònics: staruschenko@mcw.edu; rbogovik@gmail.com

Informació de finançament Departament d'Afers Veterans, número de subvenció/adjudicació: I01 BX004024; National Heart, Lung, and Blood Institute, número de subvenció/premi: P01 HL116264 i R35 HL135749; Societat Americana de Fisiologia, Número de beca/premi: Premi per a la millora de la carrera de recerca; Institut Nacional de Diabetis i Digestiu iRonyóMalalties, Número de subvenció/adjudicació: DK126720

Resum

El dany dels podòcits és un segell distintiu de les malalties glomerulars, com ara la glomeruloesclerosi segmentària focal, normalment associada a una marcada albuminúria i progressió de la patologia renal. Les anomalies estructurals i la pèrdua dels podòcits també estan relacionades amb la malaltia de canvi mínim i són més freqüentsmalaltia renal diabètica. Aquí vam aplicar la primera tècnica de microscòpia de conductància iònica d'escaneig (SICM) per avaluar l'ésser humà acabat d'aïllar.glomèrulstopologia. SICM ofereix una oportunitat única per avaluarglomèrulpodòcits així com altres segments estructurals de nefrona amb resolució de microscòpia electrònica però en mostres vives. Aquí es mostra l'aplicació del mètode SICM a l'ésser humà viuglomèrul, que proporciona una prova de principi per a futures anàlisis dinàmiques de la morfologia de la membrana i diversos paràmetres funcionals a les cèl·lules vives.

Feu clic per als efectes secundaris de cistanche i Cistanche per a la malaltia renal

1. INTRODUCCIÓ

Glomèrulrepresenta un floc de capil·lars situat a la porció d'entrada de la nefrona, on la sang es filtra selectivament a través de la barrera de filtració glomerular formada per cèl·lules endotelials, membrana basal glomerular i podòcits. Els processos primaris i secundaris dels podòcits adjacents s'entrellacen, creant un diafragma d'escletxa que cobreix bé els capil·lars dels glomèruls. Aquest diafragma té una morfologia complexa i forma la barrera final per a la filtració de la sang contribuint a la selectivitat de mida i permetent la permeabilitat a molècules més petites que l'albúmina. Es va informar d'una reducció del nombre de podòcits i de l'esborrament del procés del peu en la glomeruloesclerosi segmentària focal, la malaltia de canvis mínims i la nefropatia diabètica.1-3A més, la pèrdua i la modificació de la seva arquitectura dels podòcits poden ser evidents en les primeres etapes deronyómalalties que poden subjacent/agreujar la seva progressió. La imatge d'alta resolució de la morfologia cel·lular s'està convertint en una eina essencial i útil per estudiar les estructures cel·lulars i el paper que tenen en la funció cel·lular i la progressió de la malaltia.4 La microscòpia electrònica d'escaneig (SEM) és un mètode molt utilitzat per dur a terme aquests estudis. Tot i així, requereix múltiples procediments complexos per a la preparació de mostres, cosa que fa impossible analitzar una mostra viva.5 Per tant, hi ha una necessitat crítica de desenvolupar noves eines per estudiar les alteracions de la morfologia dels podòcits en mostres vives. El mode Hopping Probe de microscòpia de conductivitat iònica d'escaneig (SICM) és una tècnica que permet obtenir imatges no òptiques d'alta resolució de superfícies cel·lulars vives amb morfologia complexa.6-8El principal avantatge d'aquest mètode és una resolució espacial propera a diversos nanòmetres i un llarg rang Z (vertical), que es pot aplicar a mostres vives amb morfologia complicada en condicions fisiològicament rellevants. El SICM és una tècnica d'imatge multimodal que es pot combinar amb altres tècniques establertes, anàlisis concurrents i dinàmiques de la morfologia de la membrana i diversos paràmetres funcionals, com ara el volum cel·lular, els potencials de membrana, els corrents d'un sol canal iònic i fins i tot la dinàmica dels complexos de proteïnes de membrana. en cèl·lules vives.9-11 Aquí, oferim un exemple de l'aplicació de SICM per analitzar la morfologia dels humans vius.glomèrulestructura.

Símptomes de la malaltia renal de Cistanche

2. MATERIALS I MÈTODES

Per a l'experiment, vam utilitzar una part de l'àrea cortical de l'ésser humà trasplantat descartatronyódisseccionats i emmagatzemats en una solució de conservació de Wisconsin seguida de la incubació en una solució salina fisiològica oxigenada (PSS).12 Els glomèruls renals es van aïllar mitjançant una tècnica de vibrodisssociació tal com s'ha descrit anteriorment.13 Aquest enfocament permet l'aïllament ràpid de glomèruls renals ben conservats dels humans.ronyons. Per realitzar imatges SICM, humà recentment aïllatglomèrules van unir a la superfície de vidre de poli-L-lisina col·locada a la cambra cel·lular plena de solució de PSS. Les mostres es van col·locar manualment en les direccions xy sota un microscopi òptic invertit Nikon TE2000-U (Nikon Instruments). Per a la sonda de salt, es van utilitzar nanopipetes de vidre de borosilicat d'imatge SICM amb una resistència d'aproximadament 100 MΩ, que correspon a un diàmetre de punta estimat d'uns 120 nm. Les nanopipetes es van extreure amb l'extractor horitzontal flamejat/marró P-97 (Sutter Instruments, Novato, CA). Les nanopipetes es van omplir amb la mateixa solució PSS utilitzada per al bany i es van col·locar en la direcció z amb un actuador piezoelèctric. El corrent iònic que flueix per les nanopipetes es va mesurar amb un amplificador de pinça de pegat Axopatch 700B (Axon Instruments) en mode de pinça de tensió i es va controlar pel controlador universal modificat a mida (ICAPPIC Ltd, Regne Unit), que controlava simultàniament el posicionament de la mostra i la pipeta. 6 Tots els experiments es van realitzar a temperatura ambient (20-22 graus). Per a la imatge d'estructures complicades com ara podòcits processos del peu a laglomèrul, vam utilitzar el mode SICM de retrocés/salt, que és el més aplicable per a la imatge de la topografia de les cèl·lules vives amb alta resolució. mostra. Aleshores, la nanopipeta s'acosta al llarg de l'eix z a la superfície de la mostra fins que el nivell de corrent mesurat baixa fins al punt de consigna preestablert corresponent a ~ 1,0 per cent -1,2 per cent del corrent de referència. En aquest moment, s'acaba l'aproximació, les coordenades XYZ dels actuadors piezoeléctrics XY i Z es registren com a coordenada de la superfície de la mostra per al primer punt d'imatge i la pipeta es retira de la superfície. A continuació, aquest procediment es repeteix a cada punt d'imatge al llarg de l'eix xy determinat per la resolució predeterminada i l'abast de l'àrea d'escaneig. Per a la figura 1B, el rang d'escaneig i les resolucions d'imatge eren de 30 µm × 30 µm i 512 px × 512 px, i per a la figura 1C eren de 5 µm × 5 µm i 480 px × 480 px, respectivament. Les dades de topografia SICM en brut i el postprocessament d'imatges es van realitzar mitjançant el programari d'anàlisi de microscòpia SICM ImageViewer (ICAPPIC Ltd, Regne Unit).

FIGURA 1 Aplicació d'imatges de microscòpia de conductància iònica d'escaneig. A, humà acabat d'aïllarglomèrulunit a la superfície de vidre de poli-lisina. A l'esquerra es mostra una micropipeta que s'apropa a la superfície del glomèrul per realitzar imatges SICM. B, un exemple de components de barrera de filtració del glomèrul, inclosos els vasos coberts de podòcits i processos del peu, visualitzats per SICM. 45 min per a l'exploració de l'àrea total (30 × 30 µm, resolució 512 × 512 píxels; l'eix z canvia 15 µm). C, visió ampliada de l'arquitectura dels processos secundaris dels podòcits humans revelats per SICM d'alta resolució. 12 min per a l'exploració de l'àrea total (resolució 5 × 5 µm, resolució 480 × 480 píxels; l'eix z canvia 3 µm). Es mostren les barres d'escala

3. RESULTATS I DISCUSSIÓ

La qualitat d'imatge SICM és comparable a SEM i permet un examen precísglomèrull'estructura superficial, inclosos els vasos sanguinis i els podòcits, i l'arquitectura dels processos secundaris del peu.4 En el nostre estudi anterior, vam utilitzar la imatge SICM per estimar els canvis estructurals patològics en els processos del peu podòcit en rates amb nefropatia diabètica tipus 2 (T2DN). va realitzar una anàlisi comparativa de l'arquitectura tridimensional de la barrera de filtració dels podòcits en rates no diabètics i T2DN. Les nostres dades van revelar una pèrdua significativa dels processos del peu podòcit als glomèruls T2DN, proporcionant una avaluació precisa dels canvis histopatològics que es van produir en la nefropatia diabètica que subjacent a la nefrinúria i l'albumínúria en aquestes rates. -estructura superficial dimensional del glomèrul humà viu recentment aïllat. Els glomèruls renals humans són estructures esfèriques amb un diàmetre d'uns 300 µm16; així, la punta de la pipeta s'ha d'apropar amb cura a la part superior de la regió d'interès. La nostra configuració SICM té un rang d'escàner d'eix z de 25 µm i eix xy de 30 × 30 µm, que ens va permetre obtenir una imatge d'alta resolució de gran part delglomèrulsuperfície. El temps d'adquisició depèn molt de l'abast d'escaneig, la resolució i la mida de la punta de l'elèctrode de salt. Per a la imatge de cèl·lules vives en estructures complexes com el glomèrul acabat d'aïllar, el temps d'exploració varia de 10 a 50 minuts per fotograma (vegeu la llegenda de la figura per a més detalls). L'efecte acumulatiu de l'alta resolució, la gran àrea d'escaneig i les fluctuacions estocàstiques en els sistemes vius poden donar lloc a artefactes d'imatge representats com a desplaçaments horitzontals i verticals entre els cicles de reposició de pipetes esperant. Tingueu en compte que en geometries complexes amb els canvis sobtats en les ubicacions de la superfície, tant el temps d'adquisició com els artefactes d'imatge, com ara píxels foscos o dolents, podrien augmentar. La imatge de topografia SICM (figura 1A) il·lustra els capil·lars glomerulars coberts per processos de podòcits primaris i secundaris clarament visibles. El SICM permet adquirir imatges de mostra amb diferents rangs d'exploració a escala nanomètrica, mantenint un nivell de resolució suficient.17 La figura 1B representa l'arquitectura dels processos secundaris del peu de podòcits humans revelats per SICM d'alta resolució. Es pot utilitzar una anàlisi addicional d'aquestes imatges de topografia per estudiar els canvis morfològics dels processos del peu podòcit en condicions patològiques i en resposta a diverses aplicacions de fàrmacs.

L'aplicació de la tècnica SICM per investigar l'estructura superficial tridimensional de les mostres de teixit tou, inclosaglomèruli cèl·lules de podòcits, va ser introduït inicialment per Nakajima et al4. Els autors van utilitzarronyórodanxes per comparar aquesta tècnica amb SEM convencional. Aquí, hem ampliat aquests estudis al glomèrul humà viu. Amb aquest enfocament, vam revelar el gran potencial de la tècnica SICM per a l'examen ràpid i fiable delglomèrulbarrera de filtració. Un dels grans avantatges del SICM (a més de l'ús de mostres vives) és que no requereix procediments de preparació de mostres múltiples que normalment es necessiten per a la imatge de microscòpia EM, inclosa la solució de deshidratació i fixació. Per tant, SICM permet evitar la contracció de les mostres observades amb EM, que pot conduir a dimensions reals enganyoses. És important destacar que el SICM en temps real en glomèruls recentment aïllats també permet provar la dinàmica del moviment dels processos del peu en resposta a l'exposició aguda a fàrmacs d'interès. Finalment, la pipeta SICM es pot utilitzar per realitzar enregistraments amb pinça de pegat de corrents d'un sol canal18. Amb aquesta finalitat, després de la reconstrucció del mapa de topografia, el programari d'adquisició (ICAPPIC Ltd, UK) va permetre un fre controlat del vidre SICM. sonda de salt a la superfície de la cambra, disminuint la resistència dels microelèctrodes a les condicions de fixació del pegat (7 a 12 MΩ) i fent-la adequada per a l'enregistrament d'un sol canal en el mateix experiment. El SICM permet la selecció de la ubicació exacta de l'elèctrode de pinça de pegat a la superfície de la cèl·lula basant-se en dades topogràfiques mitjançant un enfocament vertical ben controlat amb precisió nanomètrica, donant lloc a la formació fàcil d'un gigaseal de contacte amb la membrana cel·lular anomenada Smart Patch.19

En resum, el mètode descrit aquí té un potencial excel·lent per als estudis de glomèruls i altres segments de nefrona recentment aïllats. A més, demostra que és possible utilitzar humansronyómostres sense preparació elaborada per avaluar els canvis morfològics en l'estudi de les patologies.

Cistanche per a la malaltia renal

AGRAÏMENTS

La investigació al laboratori dels autors va ser finançada pel Departament d'Afers Veterans I01 BX004024, l'Institut Nacional del Cor, Pulmó i Sang R35 HL135749 i P01 HL116264, l'Institut Nacional de Diabetis i Digestiu iRonyóMalalties R01 DK126720 i el premi per a la millora de la carrera de recerca de la Societat Americana de Fisiologia.

CONFLICTE D'INTERESSOS

El Dr. Andrew Shevchuk és accionista i rep els honoraris de consultoria d'ICAPPIC Ltd. Tots els altres autors no han declarat interessos en competència.

APORTACIONS DE L'AUTOR

Ruslan Bohovyk: Conceptualització (igual); Curació de dades (principal); Anàlisi formal (principal); Redacció-esborrany original (igual); Redacció-revisió i edició (igual). Mykhailo Fedoriuk: Curació de dades (suport); Anàlisi formal (de suport); Redacció-revisió i edició (igual). Elena Isaeva: Conceptualització (suport); Curació de dades (suport); Anàlisi formal (de suport); Redacció-esborrany original (suport); Redacció-revisió i edició (igual). Andrew Shevchuk:Conceptualització (suport); Programari (suport); Redacció de l'esborrany original (suport); Redacció-revisió i edició (igual). Oleg Palygin: Conceptualització (igual); Anàlisi formal (de suport); Metodologia (suport); Administració de projectes (suport); Redacció-esborrany original (suport); Redacció-revisió i edició (igual). Alexander Staruschenko: Conceptualització (principal); Administració de projectes (líder); Recursos (plomb); Supervisió (líder); Redacció-esborrany original (igual); Redacció-revisió i edició (igual).

DECLARACIÓ DE DISPONIBILITAT DE DADES

Les dades que donen suport a les conclusions d'aquest estudi estan disponibles a l'autor corresponent a petició raonable.