La senescència reconnecta la detecció del microentorn per facilitar la immunitat antitumoral

RESUM

La senescència cel·lular implica una aturada estable del cicle cel·lular juntament amb un programa secretor que, en alguns casos, estimula l'eliminació immune de les cèl·lules senescents. Utilitzant un model de càncer de fetge immunocompetent en què la senescència desencadena el rebuig del tumor mediat per cèl·lules T CD8, mostrem que la senescència també remodela el proteoma de la superfície cel·lular per alterar com les cèl·lules tumorals senten els factors ambientals, com s'exemplifica amb l'interferó tipus II (IFN). En comparació amb les cèl·lules en proliferació, les cèl·lules senescents regulen el receptor d'IFN, s'hipersensibilitzen a l'IFN microambiental i indueixen de manera més robusta els efectes de maquinària que presenten l'antigen també recapitulats en cèl·lules tumorals humanes sotmeses a senescència induïda per teràpia. La interrupció de la detecció d'IFN a les cèl·lules senescents embota la seva eliminació mediada per la immunitat sense desactivar l'estat de senescència o el seu programa secretor característic. Els nostres resultats demostren que les cèl·lules senescents tenen una capacitat millorada per enviar i rebre senyals ambientals i impliquen que cada procés és necessari per a la seva vigilància immune eficaç.

planta de cistanche per augmentar el sistema immunitari

Feu clic aquí per veure els productes Cistanche Enhance Immunity

【Demanar més】 Correu electrònic:cindy.xue@wecistanche.com / Whats App: 0086 18599088692 / Wechat: 18599088692

SIGNIFICACIÓ:

El nostre treball descobreix una interacció entre la remodelació de teixits i els programes de detecció de teixits que poden ser implicats per la senescència en càncers avançats per fer que les cèl·lules tumorals siguin més visibles per al sistema immunitari adaptatiu. Aquesta nova faceta de la senescència estableix interaccions de senyalització heterotípiques recíproques que es poden induir terapèuticament per millorar la immunitat antitumoral.

INTRODUCCIÓ

La senescència cel·lular és un programa de resposta a l'estrès caracteritzat per una aturada estable del cicle cel·lular i un programa secretor capaç de remodelar l'entorn dels teixits (1). En els teixits normals, la senescència contribueix a l'homeòstasi dels teixits durant la cicatrització de ferides; tanmateix, en teixits envellits o danyats, l'acumulació aberrant de cèl·lules senescents pot causar inflamació crònica i reduir la capacitat regenerativa dels teixits (2-4). En càncer, s'ha demostrat que la senescència media els efectes tant beneficiosos com perjudicials sobre la biologia dels teixits. D'una banda, la senescència proporciona una barrera a la tumorigènesi iniciada pels oncogens i contribueix a l'activitat antitumoral d'algunes teràpies contra el càncer (5, 6). D'altra banda, la persistència de cèl·lules tumorals senescents després de la teràpia pot produir un entorn tissular que afavoreix la recaiguda i la metàstasi (7, 8). Els fonaments moleculars d'aquestes sortides biològiques oposades segueixen sent poc coneguts. Una faceta del programa de senescència que és probable que contribueixi a una biologia tan diversa és el fenotip secretor associat a la senescència (SASP; ref. 9). SASP s'activa mitjançant un procés global de remodelació de la cromatina que evoluciona i està controlat per reguladors epigenètics clau com BRD4 i factors de transcripció proinflamatoris com NF-κB i C/EBP- (10–12). Això, al seu torn, condueix a la inducció de gens que codifiquen proteïnes de remodelació de teixits, com ara metaloproteinases de la matriu, factors de creixement i factors fibrinolítics coneguts per tenir un paper crucial en el procés de cicatrització de ferides (3, 13, 14). Altres components del SASP inclouen quimiocines i citocines que poden alterar la composició i l'estat de les cèl·lules immunitàries dins del teixit, donant lloc a l'orientació i l'eliminació de les cèl·lules senescents (15, 16). No obstant això, l'acumulació aberrant de cèl·lules senescents en molts contextos patològics implica que l'eliminació mediada per la immunitat no és un resultat universal de la senescència o del SASP i planteja la possibilitat que mecanismes addicionals dictin els efectes paradoxalment beneficiosos i perjudicials de la senescència en la biologia dels teixits i la vigilància immune. (17-19).

Certament, la vigilància immune associada a la senescència pot tenir efectes anticancerígens potents, tot i que els mecanismes efectors precisos varien segons el tipus de teixit i cèl·lula (10, 15, 16, 20). En els models de ratolí de carcinoma hepatocel·lular (HCC), les cèl·lules tumorals hepàtiques desencadenadas a la senescència s'eliminen mitjançant mecanismes immunodependents implicats per p53 de tipus salvatge (WT) (15). D'acord, TP53 es muta amb freqüència en l'HCC humà, especialment en els tumors de "classe de proliferació" que mostren el pitjor pronòstic (21, 22). Tot i que la immunoteràpia i els fàrmacs dirigits a TP53-sorgeixen com a estratègies prometedores per millorar els resultats de la malaltia, la base molecular de la resposta i la resistència segueix sent desconeguda (23–25). Per tant, entendre els mecanismes pels quals les cèl·lules tumorals senescents del fetge es fan visibles per al sistema immunitari pot facilitar estratègies per obtenir immunitat antitumoral en l'HCC mutat amb TP53-que es pot estendre a altres tipus de tumors.

Aquí, ens vam proposar establir principis que modulen el reconeixement immunitari i l'eliminació de cèl·lules senescents per identificar mecanismes de senescència accionables que es poden aprofitar per millorar el control immunitari del càncer. Amb aquesta finalitat, hem desenvolupat un nou model "inductible per la senescència" en què les cèl·lules canceroses del fetge es poden canviar selectivament a un estat senescent mitjançant la modulació genètica de p53 endògena. Vam raonar que això imitaria els efectes de les teràpies que desencadenen la senescència (26, 27) alhora que evitem els efectes confusos de les teràpies que indueixen la senescència sobre les cèl·lules immunitàries o altres components de l'entorn dels teixits. Utilitzant aquest model i estenent-lo a altres sistemes, revelem que, a més del SASP, la senescència impulsa una remodelació important del proteoma de la superfície cel·lular i dels programes de senyalització d'una manera que es preveu que alteri fonamentalment la manera com les cèl·lules senten i responen al medi ambient. senyals, exemplificats aquí mitjançant la hipersensibilitat al microambiental tipus II IFN (IFN). Aquest procés permet una regulació més sòlida de la maquinària de processament i presentació d'antigen en cèl·lules tumorals senescents que les fa susceptibles a la vigilància immune in vivo. Així, els nostres resultats revelen un programa de detecció de teixits reconnectat en cèl·lules senescents que actua conjuntament amb SASP per augmentar el seu potencial immunogènic, facilitant així el rebuig del tumor mediat per la immunitat.

cistanche tubulosa: millora el sistema immunitari

RESULTATS

Un p53-model de tumor immunocompetent restaurable per estudiar la vigilància de la senescència

Per estudiar com la senescència reprograma els estats cel·lulars i dels teixits, vam explotar una tècnica d'injecció hidrodinàmica de la vena de la cua (HTVI) (28) per generar un model de càncer de fetge induïble per la senescència controlat per un ARN de forquilla curta p53 restaurable específic del tumor (shRNA). Concretament, es van transfectar in vivo hepatòcits hepàtics adults de ratolins Bl/6 immunocompetents amb un vector transposasa SB13 de la bella dorment i dues construccions de transposons (que codifiquen NrasG12D-IRES-rtTA i TRE-tRFP-shp53, o "NSP") que s'integren al genoma. . En aquest sistema Tet-On, la p53 endògena es suprimeix en presència de doxiciclina (Dox) mitjançant l'activació d'un shRNA inductible vinculat a la RFP (Fig. 1A), que permet el control genètic de la senescència en tumors establerts. En consonància amb la coaparició de mutacions que inactiven TP53 i activen vies de senyalització de proliferació cel·lular (per exemple, cascades PI3K/AKT i RAS/MAPK) en tumors hepàtics humans, la cooperació entre RAS oncogènic i la supressió de p53 va provocar la transformació dels hepatòcits, amb la majoria ratolins que desenvolupen tumors amb característiques poc diferenciades de 5 a 8 setmanes després de l'HTVI. El perfil transcripcional va revelar que aquests tumors murins s'assemblen a la classe de "proliferació" de l'HCC humà (figura suplementària S1A-S1F), que és la classe típica d'HCC humà que alberga mutacions TP53 (21, 22, 29).

A partir del treball anterior (15), vam preveure que la reactivació de p53 al sistema anterior desencadenaria la senescència i activaria la immunitat antitumoral. En conseqüència, la retirada de Dox va desencadenar regressió tumoral dramàtica durant diverses setmanes, donant lloc a una supervivència prolongada dels animals (Fig. 1B i C). L'anàlisi dels tumors als 14 dies després de la retirada de Dox va revelar la regulació a la baixa esperada de l'shRNA p53 (tal com la visualitza el reporter RFP enllaçat) i l'acumulació de -galactosidasa associada a la senescència (SA- -gal) sense cap efecte notable sobre el RAS-efector p-ERK (Fig. 1D). De la mateixa manera, es va observar un augment de l'activitat SA- -gal i dels perfils transcripcionals associats a SASP, juntament amb una aturada proliferativa concomitant, a les cèl·lules tumorals explantades de 6 a 8 dies després de la restauració de p53 (figura suplementària S2A-S2H). Cal destacar que l'empelt d'aquests cultius (mantinguts a Dox per mantenir el silenciament de p53) en ratolins immunocompetents alimentats amb Dox va produir tumors secundaris sincrònics i focals que van retrocedir amb una cinètica similar a la dels tumors primaris després de la retirada de Dox (figura 1B; figura suplementària S3A–). S3E). Els experiments de control utilitzant un sistema Tet-Off o incorporant un shRNA p53 constitutiu van descartar la possibilitat que el mateix Dox tingués cap efecte sobre el comportament del tumor al nostre model (figura suplementària S3F i S3G). Per tant, aquest sistema permet la inducció eficient de la senescència a les cèl·lules tumorals sense recórrer a teràpies que també poden alterar el sistema immunitari de l'hoste. Donada la seva flexibilitat afegida, vam utilitzar el model de trasplantament ortotòpic (en endavant "NSP") per a molts dels estudis mecanicistes que es descriuen a continuació. Com s'esperava, les marcades regressions tumorals esmentades anteriorment van ser mediades per la immunitat. Per tant, els tumors NSP que van sorgir després del trasplantament en ratolins immunodeprimits Nude i Rag2-/-Il2rg-/- (R2G2) van experimentar una resposta citostàtica destacada, però no van poder retrocedir, amb els animals R2G2 que van mostrar els defectes més profunds (Fig. 1E-G; suplementari). Fig. S3H i S3I). Com que els ratolins nus són defectuosos en la immunitat adaptativa i R2G2 també està compromès per a aspectes de la immunitat innata, aquests resultats impliquen que el sistema immunitari adaptatiu és essencial per a una regressió eficient del tumor en el model i establir un context experimental ben controlat per explorar les bases mecàniques de aquests efectes.

planta de cistanche per augmentar el sistema immunitari

La senescència provoca un canvi de l'evasió immune del tumor al reconeixement immune

Per caracteritzar els efectes paracrins supressors de tumors de la senescència, a continuació vam caracteritzar els microambients immunitaris dels tumors que contenen p53-suprimits (anomenats "proliferants") i p53-restaurats (anomenats "senescents" ) cèl·lules tumorals després d'1 setmana de retirada de Dox, un moment en què s'estableix la senescència, però els tumors encara no han retrocedit (Figs suplementàries S2, S3 i S4A). Les lesions que contenen cèl·lules tumorals senescents van mostrar un augment d'1,8- vegades en les cèl·lules immunes CD45+ totals en comparació amb els controls proliferants (Fig. 2A; refs. 15, 16). Les anàlisis immunofenotípiques i histològiques (al dia 9 després de la retirada de Dox) van revelar que això implicava un augment destacat del percentatge de limfòcits (cèl·lules B, cèl·lules T CD4 i cèl·lules T CD8) i una disminució del percentatge de Gr1+ Cèl·lules/neutròfils supressors derivats de mieloides (CD11b+Gr1+Ly6Clo; Fig. 2B; Fig. Suplementàries. S4B). Tot i que la fracció de macròfags com a percentatge de la població total de CD45 es va mantenir sense canvis, els nombres absoluts van augmentar notablement (Fig. 2A i B; Fig. Suplementària S4C-S4E). Dins de la població de cèl·lules T, l'acumulació de cèl·lules T CD8 mostrava marcadors de l'experiència d'antigen (CD44+, CD69+) i va albergar una població augmentada de cèl·lules efectores (CD44+CD62L−; Fig. .2C; ref. 30). Aquesta remodelació global de l'entorn immunitari va provocar un augment significatiu de la proporció CD3:neutròfils per als tumors que contenen cèl·lules senescents (figura suplementària S4F), efectes consistents amb augments similars de la proporció CD3:neutròfils que s'han associat amb la reactivitat immune en humans. tumors hepàtics (31). La remodelació es va poder visualitzar mitjançant imatges 3D després de la neteja del teixit (Fig. 2D; Fig. Suplementària S4G i S4H; Vídeo suplementari S1; ref 32).

Figura 1. Un model de tumor p53-restaurable per estudiar la vigilància immune de la senescència. A, Generació del model p53-restaurable de càncer de fetge de ratolí impulsat per NRAS mitjançant el sistema de transposó de la bella dorment lliurat mitjançant HTVI. (Creat amb BioRender.com.) B, ultrasonografia representativa de models de càncer de fetge amb injecció ortotòpica i HTVI en el moment indicat després de la restauració de p53. C, Anàlisi de supervivència de ratolins en el model HTVI. D, Hematoxilina i eosina representatives (H&E), immunofluorescència (IF) i tinció de -galactosidasa (SA- -gal) associada a la senescència de p53-suprimida (p53 desactivada) i restaurada (p53 activada per a 14 dies) seccions tumorals generades a partir del model HTVI. Barres d'escala, 5{{30}} μm. E–G, injecció ortotòpica de cèl·lules tumorals NSP transduïdes per vector GFP-luciferasa als fetges de soques de ratolí immunocompetents i immunodeficients. E, Canvi de mida del tumor mesurat per ultrasons després de la restauració de p53. R2G2, Rag2-Ratolí de doble eliminació Il2rg. Les dades es presenten com a mitjana ± SEM. n Major o igual a 9 per a cada soca. F, Imatges macroscòpiques representatives als 21 dies de p53 o punt final p53 fora del tumor. G, tinció representativa d'IHC de cèl·lules tumorals marcades amb GFP el dia 21 després de la restauració de p53. Barres d'escala, 100 μm. **, P <0,01; ***, P <0,001.

Per identificar els tipus de cèl·lules immunes específiques responsables de la vigilància immune de les cèl·lules tumorals senescents, vam generar cohorts paral·leles de ratolins que contenen tumors NSP ortotòpics i vam examinar l'impacte de l'esgotament de diverses poblacions de cèl·lules immunitàries en les regressions del tumor després de la retirada de Dox. Mentre que el bloqueig d'anticossos dirigits a neutròfils/monòcits (Gr1), cèl·lules assassines naturals (NK) (NK1.1) i cèl·lules T CD4 (GK1.5) no va tenir cap efecte, l'esgotament de les cèl·lules T CD8 (2.43) i els macròfags (utilitzant clodronat liposomal). , que s'adreça selectivament als macròfags (CD11b+F4/80+), però no a les cèl·lules dendrítiques clàssiques (CD11b−CD11c+MHC−II+CD103+; refs. 33, 34) van deteriorar notablement la regressió del tumor (Fig. 2E; Fig. S4I suplementària). Per caracteritzar com la senescència tumoral impulsada per p{22}} dóna lloc a una immunitat antitumoral productiva, vam realitzar una anàlisi d'ARN-seq (scRNA-seq) unicel·lular de cèl·lules CD45 recentment aïllades de NSP proliferant i senescent. tumors aviat després de la retirada de Dox (8 dies; Fig. complementària S5A i S5B) i va utilitzar l'algoritme de prova d'abundància diferencial Milo (35) per capturar els canvis d'estat cel·lular dins dels tipus de cèl·lules immunitàries que mediaven aquest procés (Fig. complementària S5C-S5F). d'acord amb la seva contribució a la regressió del tumor, les subpoblacions de cèl·lules T CD8 i macròfags van mostrar canvis marcats en la quantitat i l'estat. Pel que fa a les cèl·lules T, els tumors proliferants (p53-suprimits) es van enriquir significativament en estats T CD8 que presentaven una alta expressió tant de marcadors de disfunció (Tox, Tigit, Lag3, Ctla4, Pdcd1/PD1 i Cd160) com de marcadors d'activació (Prf1). Fig. 2F i G; Fig. complementària S5G; Taula complementària S1). Aquestes cèl·lules T CD8 també van mostrar nivells elevats de Tnfrsf9, un marcador conegut per delimitar subconjunts de cèl·lules T que tenen la capacitat de revitalitzar-se en l'HCC humà i altres tipus de càncer (36, 37). En fort contrast, a les lesions senescents (p{53-reactivades), les poblacions de CD8 T semblaven molt activades, mostrant nivells baixos de marcadors de disfunció i una alta expressió de citocines efectores (p. ex., Ifng, Tnf; taula suplementària S1). En conseqüència, el perfil transcripcional dels teixits tumorals a granel va mostrar signatures immunològiques actives i citotòxiques en tumors senescents en regressió (figura suplementària S5H; ref. 38).

Figura 2. La senescència desencadena un canvi de tumor d'evasió immune a reconeixement immune. A, Imatges representatives de la tinció de CD45 i GFP que marquen cèl·lules immunitàries i cèl·lules tumorals, respectivament, en tumors p53-suprimits i p53-restaurats (7 dies després de la restauració de p53). A la dreta, la quantificació de l'àrea de tinció de CD45+ es va calcular a partir de 3 camps aleatoris per ratolí. Cada punt representa un ratolí. B, Anàlisi de citometria de flux del paisatge immune global en un model de tumor hepàtic NSP ortotòpic. L'immunofenotipat dels tumors senescents es realitza 9 dies després de la retirada de Dox, un punt de temps en què l'estat senescent està completament establert, però abans de la regressió massiva del tumor. G-MDSC, cèl·lules supressores derivades del mieloide granulocític; M-MDSC, cèl·lules supressores derivades del mieloide monocític. Les dades s'agrupen de 2 experiments independents, amb n=7 al grup proliferant i n=9 al grup senescent. Tingueu en compte que, a mesura que augmenta el nombre absolut de cèl·lules CD45+ en lesions tumorals senescents de NSP (A), també ho fan el nombre total dels tipus cel·lulars indicats. C, Anàlisi de citometria de flux de cèl·lules T CD8. Les dades s'agrupen de 2 experiments independents, amb n=11 en els grups proliferants i n=10 en els grups senescents. Els experiments es van realitzar 9 dies després de la retirada de Dox. D, Imatges representatives de neteja de teixits dels tumors hepàtics ortotòpics NSP. Les cèl·lules T, els neutròfils i la vasculatura estan marcades per tinció de CD3, MPO i CD31, respectivament. Les mostres es van recollir 9 dies després de la retirada de Dox. E, Canvi de mida del tumor mesurat per ultrasons després de la restauració de p53 en ratolins després d'esgotar tipus de cèl·lules immunitàries específiques mitjançant anticossos o fàrmacs. F, diagrama esquerra, d'aproximació i projecció de varietat uniforme (UMAP) de cèl·lules T CD8 aïllades de tumors senescents reactivats (SEN) p53-proliferants suprimits (PRO) i p{{30}}. A la dreta, anàlisi d'enriquiment del conjunt de gens dels gens marcadors d'esgotament de cèl·lules T en cèl·lules T CD8+ de tumors proliferants (p53-suprimits) versus senescents (p53-reactivats). NES, puntuació d'enriquiment normalitzada; Pval, valor P. G, gràfic UMAP de l'expressió de gens seleccionats (Cd8a, Cd44, Tnfrsf9, Cd69, Tox i Fasl) entre cèl·lules T CD8 aïllades de senescents (p{{4{0}}reactivats) i proliferants (p{{ {41}}suprimits) tumors. H, Imatges representatives d'immunofluorescència de cèl·lules T CD8 i tinció de macròfags F4/80-positiva al tumor hepàtic NSP ortotòpic. Les mostres de tumors es van recollir 9 dies després de la retirada de Dox. Les dades es presenten com a mitjana ± SEM. Totes les barres d'escala, 100 μm. Es va utilitzar una prova t de Student de dues cues. *, P <0,05; **, P <0,01.

Els canvis al compartiment dels macròfags van proporcionar més proves que la senescència de les cèl·lules tumorals va desencadenar un canvi d'evasió immune a vigilància. Per tant, scRNA-seq, immunofenotipat i histologia van indicar que els fenotips de macròfags associats al tumor van passar de F4/80lo; Estats CD11chi (clúster 8), incloses les poblacions de PD-L1+ immunosupressores (característiques dels tumors de HCC humans amb mal pronòstic; refs. 39, 40) a F4/80hi; Estats CD11c− (clúster 0), definits per una alta expressió d'una signatura gènica de presentació d'antigen (Figs suplementàries S5E-S5J i S6A i S6B; Taula suplementària S1). Cal destacar que aquests F4/80hi associats a la senescència; Els macròfags CD11c− eren particularment sensibles al tractament amb clodronat liposomal (figura suplementària S6C–S6E), que també va provocar una reducció significativa de la fracció de cèl·lules T CD8 actives però no de cèl·lules T CD4 (figura suplementària S6F i S6G), cosa que indica un CD8. Resposta immune dependent de T que implica cooperació amb macròfags. En conseqüència, les anàlisis histològiques van confirmar que les cèl·lules T CD8 acumulades i els macròfags F4/80+ es co-enriquien amb freqüència després de la inducció de la senescència en els tumors (figura 2H; figura suplementària S4D). Col·lectivament, aquestes anàlisis biològiques i moleculars donen suport a un model en què la senescència de cèl·lules tumorals indueix un canvi brusc de l'evasió immune a la vigilància immune mediada per canvis en els macròfags i els estats de les cèl·lules T CD8, donant lloc a una immunitat antitumoral productiva i, finalment, al rebuig del tumor.

La senescència remodela els programes de detecció de teixits i el paisatge de la superfície cel·lular

A continuació, ens vam proposar explotar el model anterior per entendre els mecanismes moleculars responsables de fer visibles les cèl·lules tumorals senescents al sistema immunitari. La inducció de la senescencia implica un programa de remodelació de la cromatina que silencia els gens proliferatius i activa molts gens que codifiquen factors SASP, amb aquest últim programa depenent en gran mesura del lector potenciador BRD4 (10). Per tant, vam realitzar experiments de perfil transcripcional en cèl·lules NSP en condicions de proliferació (p53-suprimida) versus senescent (p53- restaurada) en absència i presència de JQ1, un fàrmac que inhibeix la funció BRD4 (taula suplementària S2). ). D'acord amb les expectatives, la restauració de p53 va reduir dràsticament l'expressió de gens proliferatius i va induir l'expressió de factors SASP coneguts (Fig. 3A; Fig. Suplementària S7A; ref. 7), incloses diverses citocines conegudes per estimular les cèl·lules T (Cxcl16, Il18). ) o activació i reclutament de macròfags (Csf2, que codifica la proteïna GM-CSF) o prèviament vinculat a la senescència (Igfbp7, Igfbp3, Pdgfa). Tal com s'havia previst del treball anterior (10), moltes de les transcripcions de codificació SASP regulades (~ 65%) depenien de BRD4- (figura suplementària S7B). De la mateixa manera, es van secretar una sèrie de factors de creixement i moduladors immunes de les cèl·lules senescents, tal com es van avaluar mitjançant assaigs de citocines multiplexades, inclosos els atraients de cèl·lules T i macròfags CCL5, CXCL9 i GMCSF, així com el factor de remodelació de la vasculatura VEGF (figura suplementària). S7C). Per tant, la senescència a les cèl·lules tumorals NSP restaurades p53-s'associa a un SASP robust, coherent amb la marcada remodelació de l'ecosistema immunitari caracteritzat anteriorment.

Sorprenentment, l'examen de la localització subcel·lular dels gens expressats de manera diferencial (DEG) va revelar que les cèl·lules tumorals senescents no només van augmentar la seva expressió de factors SASP secretats ("extracel·lulars", EC), sinó que també van mostrar canvis importants en els nivells d'expressió de les transcripcions que codifiquen proteïnes de superfície. ("membrana plasmàtica", PM; Fig. 3B). De fet, el 25% dels DEG totals regulats van codificar proteïnes PM, un enriquiment significatiu que es va desviar de la distribució aleatòria (15%; Fig. 3B). Els PM-DEG dinàmics es van relacionar amb la transducció de senyalització de la proteïna tirosina quinasa (Nrp1, Egfr), l'activitat del receptor de citocines (Ifngr1), els receptors de la matriu extracel·lular (Itgb3, Cd44) i els transportadors d'ions (Slc12a1, Slc24a3) i van capturar molècules conegudes associades a la senescència Cd44, Vcam1 i Itgb3), cosa que suggereix que les cèl·lules senescents poden tenir una capacitat millorada per interactuar i detectar el seu entorn (Fig. 3C; Fig. Suplementària S7D; refs. 41-43). Curiosament, l'augment associat a la senescència en l'expressió de moltes d'aquestes proteïnes PM va ser embotit per JQ1, cosa que suggereix que la seva inducció pot formar part del programa de remodelació de la cromatina més ampli acoblat a SASP (Fig. 3D; ref. 10). Cal destacar que també es van produir canvis profunds en la transcripció de gens que codifiquen proteïnes PM en cèl·lules tumorals NSP deficients en p53- tractades amb la combinació de fàrmacs trametinib i palbociclib que indueix la senescència (figura suplementària S7E, panell superior; taula suplementària S2; ref. 20) i en una sèrie de 13 línies de càncer humà mutant TP53 WT i TP53- genèticament diverses derivades de càncers de fetge, mama, pulmó i còlon induïts a la senescència per diversos desencadenants (Fig. 3E; Fig. S7F; ref. 44). Això va ser especialment robust per als PM-DEG regulats a l'alça (però no regulats a la baixa), que recorda els efectes observats per als factors SASP EC (Fig. 3E; Fig. S7E suplementària, panell inferior). Per tant, l'expressió marcadament alterada de les proteïnes de la superfície cel·lular que vam observar al nostre model s'estén més enllà de la senescència induïda per p53-i pot ser un segell distintiu de l'estat senescent.

Figura 3. La senescència remodela els programes de detecció de teixits i el paisatge de la superfície cel·lular. A, Anàlisi d'enriquiment del conjunt de gens (Reactome) de dades d'ARN-seq de cèl·lules tumorals de fetge NSP proliferant (PRO, p53 apagada) versus senescents (SEN, p53 activada durant 8 dies). NES, puntuació d'enriquiment normalitzada. B, Localització subcel·lular de DEG (P <0.05; canvi de plecs > 2) en tots els gens detectats [transcripcions per milió de quilobases (TPM) > 1] de RNA-seq. C, Anàlisi d'ontologia gènica (GO) de DEGs que codifiquen proteïnes PM regulades a les cèl·lules senescents. TM, transmembrana. D, Anàlisi transcriptòmica de tots els DEG (proliferant vs senescent) en presència o absència de tractament amb JQ1. El clúster C1 (en vermell) conté els gens específics de la senescència sensibles a JQ1, i el clúster C4 (en blau) conté els gens específics de la proliferació sensibles a JQ1. E, metaanàlisi del conjunt de dades d'ARN-seq de SENESCopedia mitjançant la localització subcel·lular de DEG (igual que la figura 2D) i la prova exacta de Fisher per examinar l'enriquiment relatiu dels EC/PM-DEG regulats a l'alça i a la baixa desviats de la distribució aleatòria. Vegeu també la figura suplementària S7E i S7F. F, anàlisi d'espectrometria de masses (MS) del proteoma enriquit amb PM en cèl·lules proliferants i senescents. El nivell de proteïna es normalitza a l'expressió mitjana de la proteïna de totes les mostres. Els controls són les mostres sense etiquetatge de biotina que serveix de fons. Les caixes vermelles i blaves representen proteïnes enriquides en cèl·lules senescents i en proliferació, respectivament. n=6 tant per als grups experimentals senescents com en proliferació, i n=3 i 4, respectivament, per al seu control. G, distribució de proteïnes PM anotades per GeneCards regulades a l'alça i a la baixa i perfilades per MS. NC, cap canvi. H, trama del volcà de proteïnes PM anotades per GeneCards perfilades per MS.

Per validar la remodelació global dels factors PM en la senescència a nivell de proteïnes, vam realitzar proteòmica superficial en cèl·lules tumorals NSP en proliferació isogènica i senescent, mitjançant un mètode d'enriquiment d'etiquetatge de biotina, en què les proteïnes de la superfície cel·lular es van marcar amb biotina impermeable a la membrana, purificat i sotmès a espectrometria de masses (Fig. 3F; Fig. Suplementària S7G; ref. 45). Es va observar una forta correlació entre les rèpliques biològiques en cada condició (figura suplementària S7H), amb les proteïnes detectades enriquides per a proteïnes PM anotades en un 60% després de la inducció de la senescència induïda per p53-. De les 887 proteïnes que es van detectar de manera reproducible, més del 50% es van expressar de manera diferent. La majoria de proteïnes expressades de manera diferencial es correlacionaven bé amb la direccionalitat observada a les nostres dades de perfil transcripcional, tot i que algunes es van expressar de manera diferencial sense un canvi corresponent en els nivells de transcripció (figura suplementària S7I).

Beneficis de cistanche per a homes que enforteixen el sistema immunitari

Les proteïnes de la superfície cel·lular anotades detectades per espectrometria de masses després de la inducció de la senescència incloïen diverses anteriorment vinculades a la senescència (per exemple, CD44 i VCAM1), diversos factors de creixement i receptors de citocines (per exemple, EGFR, ICAM1 i IFNGR1) i altres factors menys caracteritzats (Fig. 3F–H; Fig suplementària S7J i S7K). Cal destacar que el conjunt de proteïnes enriquides a la superfície cel·lular identificades al nostre model va mostrar una superposició limitada amb les identificades en fibroblasts humans sotmesos a senescència induïda per oncogens (46), cosa que suggereix heterogeneïtat entre tipus cel·lulars o desencadenants de senescència. Independentment, aquests resultats mostren que, a més de reconnectar el seu programa secretor, les cèl·lules senescents experimenten canvis profunds en el contingut i l'abundància de proteïnes de la superfície cel·lular i impliquen que les cèl·lules senescents adquireixen trets distintius de detecció del microambient que poden influir en el seu estat i destí in vivo. .

Les cèl·lules senescents estan preparades per detectar IFNg i amplificar la senyalització d'IFNg

Per identificar vies que podrien influir funcionalment en com les cèl·lules senescents senten el seu entorn, vam extreure conjunts de dades transcripcionals i proteòmiques per a canvis associats a la senescència vinculats a la immunitat antitumoral. Curiosament, l'anàlisi d'ontologia gènica (GO) va revelar que la resposta d'interferó gamma (IFN) de tipus II (47) es trobava entre les 5 vies anotades principals enriquides durant la senescència i depenent dels programes potenciadors específics de l'estat cel·lular (és a dir, sensibles a JQ1- és a dir, "C1" de la figura 3D; figura suplementària S8A). Entre les transcripcions alterades, vam observar diversos reguladors positius de la senyalització d'IFN, inclosa la subunitat del receptor d'IFN IFNGR1 (una de les proteïnes més significativament regulades de les nostres dades proteòmiques) i múltiples efectors d'interferó (Irf1, Irf7 i Irf9; refs. 47, 48). Fig. 4A-C; Fig. complementària S8B i S8C). A més d'aquests gens augmentats sensibles a Brd4-, les transcripcions que codifiquen reguladors negatius de la senyalització d'IFN (Ptpn2, Socs1 i Socs3) es van reduir significativament (Fig. 4C; refs. 49, 50). Es van observar canvis similars a les cèl·lules tumorals NSP tractades amb diferents inductors de senescència (Fig. 4C; Fig. suplementària S8D–S8G) i, de manera més àmplia, en un panell de 13 càncers humans derivats de mama, pulmó, fetge i còlon. línies cel·lulars disparades a la senescència (Fig. 4D; ref. 44). Per tant, els canvis en l'expressió dels components de senyalització d'IFN tipus II són una característica general de les cèl·lules senescents, independentment del tipus cel·lular, el genotip cel·lular, l'espècie i la naturalesa de l'inductor de la senescència. L'augment simultània dels efectors de senyalització d'IFN i la disminució dels reguladors negatius ens van portar a plantejar la hipòtesi que les cèl·lules senescents es preparen per detectar IFN dins del seu entorn. Per provar aquesta hipòtesi directament, vam tractar cèl·lules NSP proliferants i senescents amb IFN recombinant i vam realitzar anàlisis d'immunoblot de l'activació de la senyalització JAK-STAT. Tot i que l'IFN va augmentar dràsticament els nivells basals de STAT1 en ambdós estats, les cèl·lules senescents van acumular més STAT1 fosforilada, independentment del desencadenant de la senescència (Fig. 4E; Fig. Suplementària S8H). A més, també vam trobar un nivell augmentat de JAK1 fosforilada a les cèl·lules senescents restaurades p53-, donant suport encara més a la nostra troballa sobre una via de senyalització JAK-STAT més activa en cèl·lules senescents que detecten IFN (figura suplementària S8I). Tal com es va predir a partir de les anàlisis transcripcionals, la senescència també va provocar una disminució de la proteïna PTPN2 (51), independentment de la presència d'IFN exògen (Fig. 4E). Així, les cèl·lules senescents activen de manera més eficient la senyalització d'IFN en resposta a la limitació de la concentració d'IFN a l'entorn.

La senescència i l'IFNg EC regulen de manera cooperativa la maquinària de processament i presentació d'antígens

Per entendre millor la contribució funcional de la detecció d'IFN al programa de senescència, a continuació vam comparar els estats fenotípics i transcripcionals de cèl·lules tumorals NSP senescents en proliferació i p53-restaurada tractades amb IFN recombinant a un nivell baix (50 pg/mL) o dosi més alta (1 ng/ml). Tot i que l'addició d'IFN exògen a les cèl·lules tumorals en proliferació o senescent va tenir un efecte insignificant en la viabilitat, la proliferació o l'expressió gènica SASP de qualsevol tipus de cèl·lula a les dosis provades (Fig. 5A; Fig. Suplementària S9A-S9D), canvis marcats en Es va observar l'expressió gènica de la via IFN vinculada a l'estat senescent. Concretament, l'agrupament supervisat de la "signatura de resposta IFN" de Hallmark a través de cèl·lules proliferants i senescents va revelar tres mòduls DEG: (i) gens que es regulen a la baixa durant la senescència independentment de l'IFN (inclosos els reguladors negatius esmentats anteriorment); (ii) gens que estan regulats durant la senescència independentment de l'IFN; i, curiosament, (iii) un conjunt substancial de DEG que són induïts de manera cooperativa per la combinació de senescència i IFN (Fig. 5B). Per tant, la senescència desencadena canvis quantitatius i qualitatius en la resposta transcripcional a IFN. Una sortida ben establerta de la senyalització d'IFN que regula la susceptibilitat de les cèl·lules a la vigilància immune adaptativa és una capacitat augmentada de presentació d'antigen mediada per molècules MHC de classe I (MHC-I; refs. 47, 52). De fet, molts dels gens regulats a les cèl·lules senescents (gens de classe ii) o superinduïts en presència d'IFN exògen (gens de classe iii) incloïen components de la maquinària de presentació d'antigen. Entre els gens induïts durant la senescència (gens de classe ii) hi havia Tap1, transportadors associats al processament d'antigen, i Psme1, un factor proteasoma associat al processament d'antigen (53). Els hipersensibles a l'IFN exògen (gens de classe iii) incloïen Nlrc5, un coactivador transcripcional dels gens MHC-I (54); el factor de muntatge MHC-I Tapbp; i la subunitat MHC-I B2m. Altres dos gens de classe iii eren components de l'immunoproteasoma (Psmb8 i Psmb9) les accions dels quals poden alterar el repertori dels pèptids presentats quan es sobreexpressen i s'associen amb una millor resposta del tumor al bloqueig del punt de control immune (55). Aquesta sortida amplificada d'IFN a les cèl·lules senescents es va confirmar per RT-qPCR i es va mantenir a nivells encara més alts d'IFN exògen (Fig. 5C; Taula complementària S3). D'acord amb el procés multifactorial descrit anteriorment, aquest efecte no es va observar a les cèl·lules tumorals en proliferació, fins i tot les que sobreexpressen un ADNc d'IFNGR1 i / o es van tractar amb IFN (figura suplementària S10A-S10D).

Figura 4. Les cèl·lules senescents estan preparades per detectar i amplificar la senyalització d'IFN. A i B, nivell IFNGR1 en cèl·lules proliferants i senescents perfilades per espectrometria de masses (A) i validades per citometria de flux (B). AU és una unitat arbitrària. Les dades es presenten com a mitjana ± SEM. n=6 tant per als grups proliferants com per als senescents. C, Anàlisi transcriptòmica de gens seleccionats que regulen la senyalització d'IFN a partir de dades d'ARN-seq de 3 línies cel·lulars independents p53-restaurables (NSP, NSM2 i NSP5) que restauren p53 juntament amb cèl·lules NSP tractades amb altres dos desencadenants de la senescència. SEN/PRO, senescent/proliferant; T + P, trametinib més palbociclib. D, expressió d'ARNm de gens seleccionats implicats en la senyalització d'IFN en línies cel·lulars humanes desencadenadas a la senescència. Tractament: Ali, alisertib; Eto, etopòsid; el número indica la durada del tractament (dies). Les dades s'obtenen del conjunt de dades públic SENESCopedia (44). E, Top, anàlisi d'immunoblot de cèl·lules NSP sota diferents desencadenants senescents en presència o absència d'IFN (1 ng/mL). A baix, quantificació de la intensitat del senyal de la immunoblot. p-STAT1, fosfo-STAT1 (Tyr701).

També coherent amb els canvis d'expressió gènica descrits anteriorment, les cèl·lules tumorals senescents van regular més fortament el MHC-I en resposta a nivells baixos d'IFN exògen en comparació amb els homòlegs proliferants. Per tant, mentre que els nivells de superfície cel·lular de MHC-I tant de cèl·lules proliferants com senescents eren baixos a la línia de base i induïts per IFN exògen, les cèl·lules senescents van mostrar un augment significatiu de l'expressió de proteïna MHC-I (Fig. 5D). Es van observar sinergies similars per a l'expressió HLA a la superfície cel·lular (idèntica a MHC-I en ratolins) en cèl·lules canceroses humanes del fetge i altres tipus de càncer desencadenats a la senescència amb Butlin, que implica un programa de senescència dependent de l'ap53-(56) , o trametinib/palbociclib, que s'adreça preferentment a les cèl·lules tumorals amb una via MAPK activada (figura suplementària S11A-S11D; ref. 20). Cal destacar que els efectes combinatoris del tractament amb fàrmacs i l'IFN sobre l'expressió HLA van requerir la inducció de la senescència i no es van produir a les cèl·lules tumorals hepàtiques que no van poder senescència a causa d'una mutació p53 espontània o modificada per enginyeria (que respon a l'esquema) o una via MAPK no hiperactivada (irresponsiva). a trametinib/palbociclib). A més, tot i que les vies de resposta d'IFN tipus I i II inclouen components superposats, el tractament amb IFN exògen no podria substituir l'IFN per produir una inducció robusta de MHC-I en cèl·lules senescents ni una inducció fortament diferencial entre cèl·lules proliferants i senescents en el nostre model de restauració p53. Fig. complementària S11E i S11F). Aquestes dades impliquen que les cèl·lules murines i humanes desencadenadas per a la senescència adquireixen una capacitat augmentada de processament i presentació d'antigens en presència de quantitats limitants d'IFN.

Les cèl·lules tumorals senescents hiperactiven la via de senyalització d'IFNg in vivo

Per determinar les conseqüències in vivo del recablejat de la senyalització d'IFN identificada a les cèl·lules senescents, a continuació vam adaptar un sistema reporter de detecció d'IFN (IGS) per visualitzar directament l'activació de la senyalització intracel·lular d'IFN en temps real (57). Aquest reporter consisteix en una sèrie de seqüències consensuades activades per IFN, que tenen especificitat per a l'IFN de tipus II sobre altres senyals (57), seguides d'una seqüència d'ADNc que codifica per a la proteïna fluorescent ZsGreen1 i està vinculada a un transgen RFP expressat de manera constitutiva per visualitzar les cèl·lules transduïdes (57). Fig. 6A). Les cèl·lules tumorals NSP que expressaven aquesta construcció van ser positives per a la RFP i van mostrar un augment depenent de la dosi del senyal ZsGreen1 després del tractament amb IFN in vitro que va augmentar després de la inducció de p53 o després del tractament amb fàrmacs que indueixen la senescència (Fig. 6B; Fig. S12A i S12B suplementàries) .

A continuació, vam utilitzar aquest sistema per controlar l'activitat de senyalització després de la inducció de senescència en tumors. Les cèl·lules tumorals transduïdes per reporter (a Dox) que expressaven RFP constitutiva es van injectar als fetges de receptors singènics alimentats amb Dox i, després de la manifestació del tumor, es va eliminar Dox per induir l'expressió de p53 i desencadenar la senescència com es va veure anteriorment (vegeu les figures 1 i 2). Els tumors en regressió es van aïllar 9 dies després de la retirada de Dox per a la imatge en 3D de l'activitat del reporter i l'avaluació paral·lela de la senyalització d'IFN en comparació amb els controls proliferants (de ratolins mantinguts a Dox). Tal com s'il·lustra a la figura 6C, les cèl·lules tumorals en proliferació mostraven poca o cap expressió de reporter, mentre que les cèl·lules tumorals desencadenadas per senescència in vivo mostraven un senyal ZsGreen1 més destacat (Fig. 6C i D; Vídeo suplementari S2). Aquest efecte va coincidir amb un augment específic dels nivells de proteïna IFN (però no IFN tipus I) en extractes de teixit tumoral (Fig. 6E; Fig. S12C suplementària).

Per provar si la composició alterada de les cèl·lules immunitàries en tumors senescents (Fig. 2; Figs suplementàries S5-S6) va contribuir a la millora del senyal del reporter IGS, vam realitzar assajos de cocultiu in vitro que permetien l'exposició de cèl·lules tumorals senescents o proliferants a un igual nombre de cèl·lules T CD8 activades, que vam identificar mitjançant dades de scRNA-seq com la font cel·lular predominant d'IFN in vivo (Fig. 6F-H). Les cèl·lules senescents encara mostraven un augment significatiu del senyal ZsGreen1 en comparació amb els controls proliferants (Fig. 6I). D'acord amb una activació de senyalització no autònoma de les cèl·lules, l'IFN no es va detectar en medis condicionats de cèl·lules tumorals NSP en condicions proliferatives o senescents (figura suplementària S12D), però l'IFN es va detectar fàcilment en cocultiu amb cèl·lules T CD8, un efecte que va ser millorat encara més amb l'addició de macròfags i associat amb un augment de la classe I del MHC a les cèl·lules senescents, així com una major activació de les cèl·lules T CD8 (figura suplementària S12E-S12J). Col·lectivament, aquestes dades donen suport a un model pel qual les interaccions heterotípiques entre les cèl·lules tumorals senescents i les cèl·lules immunitàries sensibilitzen el tumor a l'IFN exògen, donant lloc a una presentació millorada d'antigen i una vigilància immune eficient.

Figura 5. La senescència i l'IFN EC cooperen per regular la maquinària de processament i presentació d'antigen. A i B, expressió d'ARNm de gens en cèl·lules NSP proliferants i senescents in vitro en presència o absència de tractament amb IFN (50 pg/mL). El nivell d'ARNm es normalitza a l'expressió mitjana del gen en totes les mostres. A, factors SASP de codificació DEG al nostre model. B, gens de resposta IFN de la base de dades de signatures Hallmark. C, RT-qPCR de gens de la via de presentació d'antigen seleccionats en cèl·lules proliferants i senescents tractades amb una concentració baixa (50 pg/mL) o alta (1 ng/mL) d'IFN. Les mostres són de 2 rèpliques biològiques. D, nivell de MHC-I de cèl·lules proliferants i senescents tractades amb IFN durant 24 hores mesurades per citometria de flux. MFI, intensitat de fluorescència mitjana. Les dades es presenten com a mitjana ± SEM.

Figura 6. La senescència millora la senyalització heterotípica mediada per IFN de cèl·lules immunitàries activades a cèl·lules tumorals. Una il·lustració gràfica del reporter de l'IGS. (Creat amb BioRender.com.) B, Esquerra, diagrames de citometria de flux representatius que mesuren senyals ZsGreen1 en cèl·lules NSP proliferants i senescents tractades amb 1 ng/mL IFN. A la dreta, quantificació del percentatge de cèl·lules ZsGreen1-positives després del tractament amb IFN. MFI, intensitat de fluorescència mitjana. C i D, imatge representativa en 3D de tumors netejats amb teixit de la línia cel·lular NSP del fetge injectada ortotòpicament que expressa el reporter IGS (C). Quantificació de 3 camps seleccionats aleatòriament del tumor hepàtic de cada ratolí (D). n=5 i n=3 per als grups proliferants i senescents (9 dies després de la restauració de p53), respectivament. Barres d'escala, 100 μm. E, superior, assaig de matriu de perles citomètriques per al nivell d'IFN de mostres de lisat de teixit tumoral in vivo (7 dies després de la restauració de p53). A la part inferior, transcripcions dels gens indicats d'ARN-seq de mostres massives in vivo de tumors generades per HTVI (PRO, p53 apagat; SEN, restauració p53 durant 12 dies). TPM, transcripcions per milió de quilobase. El clúster Ifna/b assenyalat conté 14 subtipus Ifna i 1 gen Ifnb. F i G, expressió d'Ifng en cèl·lules immunitàries que s'infiltran en tumors perfilades per scRNA-seq en el model trasplantable NSP (com a la figura 2, una mostra recollida el dia 8 després de la restauració de p53). H, Gràfic d'aproximació i projecció de múltiples uniformes de l'expressió de Havcr2 (codificant TIM3) i Ifng en cèl·lules T CD8 collides de lesions tumorals proliferants (P) i senescents (S). El panell superior es replica de la figura 2F (esquerra) per indicar les cel·les corresponents a cada condició. I, Quantificació de la intensitat de ZsGreen1 de les cèl·lules tumorals NSP a l'experiment de cocultiu de cèl·lules tumorals OT-I i que expressen SIINFEKL (proporció efector-objectiu, 5:1) després de 20 hores de cocultiu. Senyal mesurat per citometria de flux. T + P, trametinib més palbociclib. Vegeu els detalls experimentals a la figura suplementària S12E. Les dades es presenten com a mitjana ± SEM. Es va utilitzar la prova t de Student de dues cues. *, P <0,05; **, P <0,01; ***, P <0,001.

La senyalització d'IFNg a les cèl·lules tumorals senescents és necessària per a la vigilància immune

Els nostres resultats impliquen que l'eliminació mediada per la immunitat de les cèl·lules tumorals senescents NSP implica els efectes combinats de SASP, conegut per estimular el reclutament de cèl·lules immunitàries (10, 20, 58), juntament amb una capacitat prèviament subestimada de les cèl·lules senescents per millorar la detecció i la resposta a Senyals EC, com es mostra aquí amb IFN. Per provar la contribució del programa de detecció d'IFN associat a la senescència a la vigilància immune de les cèl·lules tumorals senescents, vam examinar com la interrupció de l'IFNGR a les cèl·lules tumorals, o l'esgotament d'IFN a l'hoste, afecta l'eliminació de les cèl·lules tumorals NSP després de la inducció de la senescència. . De fet, la regressió del tumor (però no la senescència per si mateixa; la figura suplementària S13A–S13D) es va veure afectada per l'eliminació (KO) d'IFNGR1 (Fig. 7A i B; la figura suplementària S14A–S14C), un efecte que va ser encara més pronunciat per a Tumors intactes amb IFNGR empeltats en ratolins Ifng-/- (Fig. 7C i D) i associats amb la pèrdua esperada de MHC-I de superfície a les cèl·lules tumorals (figura suplementària S14D i S14E).

D'acord amb la contribució coneguda de la senyalització d'IFN i la cèl·lula tumoral MHC-I a la implicació de CD8+ (59), els tumors que no tenien IFNGR1 o que es van desenvolupar en receptors Ifng-/- contenien menys cèl·lules T CD8 que els seus homòlegs WT en tots dos. estats proliferants i senescents (figura suplementària S14F) mentre encara indueixen un infiltrat immune robust que inclou macròfags abundants (Fig. 7E i F; Fig. complementària S14G). Independentment, el fenotip de vigilància de la senescència deteriorada no va ser simplement el resultat d'aquesta disminució de les cèl·lules T CD8. Els assajos de cocultiu que proporcionaven una exposició uniforme de cèl·lules tumorals IFNGR1 KO i WT a cèl·lules T CD8 i macròfags encara mostraven la mort depenent d'IFNGR1-de cèl·lules tumorals senescents (figura suplementària S15A-S15E), una dependència que requeria la presència d'ambdues T. cèl·lules i macròfags i això no es va observar en cèl·lules tumorals en proliferació en les mateixes condicions. En conjunt, aquestes dades indiquen que la capacitat millorada de les cèl·lules senescents per detectar l'IFN microambiental actua conjuntament amb el reclutament de cèl·lules immunitàries estimulades per SASP per permetre interaccions heterotípiques de reforç mútuament entre cèl·lules tumorals, macròfags i cèl·lules T activades que milloren la presentació d'antigen i la vigilància immune. , donant lloc a potents regressions tumorals.

DISCUSSIÓ

Habilitat per un model de tumor murí en què l'evasió immune del càncer versus la vigilància de la senescència està sota un estricte control genètic, revelem com les cèl·lules senescents alteren dràsticament la seva capacitat d'enviar i rebre senyals ambientals (figura suplementària S16). D'acord amb els programes de senescència coneguts, la inducció de senescència impulsada per p53-va conduir al silenciament de gens proliferatius i va induir el SASP. Tanmateix, també vam observar un efecte profund en l'expressió gènica de les proteïnes PM, incloent una sèrie de receptors de factors de creixement i receptors de citocines que es preveu que alterin dràsticament la resposta de les cèl·lules senescents als senyals ambientals. És important destacar que, tot i que vam utilitzar un model de càncer de fetge com a sistema experimental principal, es va observar un recablejat similar en l'expressió de sensors de superfície cel·lular i programes de gens que sensibilitzaven els senyals ambientals en una àmplia gamma de cèl·lules tumorals murines i humanes tractades amb inductores de senescència. agents, cosa que implica que el programa de detecció alterat és un segell general de l'estat senescent.

Beneficis de cistanche per a homes que enforteixen el sistema immunitari

Una de les vies de detecció prominents alterades a les cèl·lules senescents implica la senyalització d'IFN tipus II. En el nostre model de càncer de fetge i en tots els estats senescents que vam examinar, la senescència s'acompanya de canvis d'expressió transcripcionals i proteïnes intrínsecs a la cèl·lula que es preveuen per millorar la senyalització de l'IFN exògen. De fet, les cèl·lules senescents van activar de manera més robusta els efectors d'IFN en resposta a l'IFN in vitro i in vivo, i tant es requereix una via efectora d'IFN intacta com l'IFN a l'entorn per a l'eliminació eficient de cèl·lules tumorals senescents mediada per cèl·lules T CD8. Tot i que l'anàlisi de les vies dels transcriptomes de cèl·lules senescents identifica invariablement la senyalització d'IFN de tipus II com una característica enriquida, els solapaments entre els components de senyalització de tipus I i II i el fet que l'IFN normalment no es detecti com a factor SASP han deixat qüestions mecàniques sobre la senyalització d'IFN tipus II en la senescència. en gran part inexplorat. Els nostres estudis demostren que aquest enriquiment en les signatures de senyalització d'IFN de cèl·lules senescents reflecteix una capacitat millorada de detecció d'IFN la sortida del qual és més destacada in vivo.

Figura 7. La senyalització d'IFN en cèl·lules tumorals senescents és necessària per a la vigilància immune. A, Ifngr1 KO de cèl·lules NSP proliferatives i senescents validades per citometria de flux. B, fenotip de regressió tumoral d'Ifngr1 KO o cèl·lules tumorals transfectades amb sgRNA de control injectades ortotòpicament en ratolins Bl / 6N després de la restauració de p53. Un sgRNA de control dirigit a un desert genètic situat a Chr8 (Ctrl KO) serveix de control. C, Fenotip de regressió tumoral de cèl·lules tumorals NSP parentals injectades ortotòpicament en ratolins WT o Ifng KO després de la restauració de p53. D, Imatges macroscòpiques representatives del tumor recollides el dia 21 després de la restauració de p53 de C. E, Anàlisi de citometria de flux de l'abundància de CD45 al tumor dels grups indicats. F, immunofluorescència representativa en el tumor p{{10}}suprimit (proliferant) i p53-restaurat (senescent, 7 dies després de la restauració de p53) de l'amfitrió indicat. Les cèl·lules tumorals NSP es van transduir amb un vector que expressava GFP per a la seva visualització. Barres d'escala, 50 μm. Les dades es presenten com a mitjana ± SEM. Es va utilitzar la prova t de Student de dues cues. **, P <0,01; ***, P <0,001.

Potser la sortida més ben establerta de la senyalització d'IFN tipus II implica la seva capacitat per induir la maquinària de presentació d'antigen. De fet, l'IFN va induir l'expressió a la superfície cel·lular de MHC-I (o HLA a les cèl·lules humanes) al nostre model tant en condicions de proliferació com de senescència. Tanmateix, la regulació de l'MHC-I induïda per IFN va ser més pronunciada a les cèl·lules senescents, un efecte que es correlacionava amb l'augment de l'expressió del transportador associat al processament d'antigen, altres factors de processament d'antigen i components estructurals de MHC-I. Es va observar una hipersensibilitat similar a l'IFN en la inducció de MHC-I/HLA a les línies cel·lulars de càncer de fetge i pulmó humans desencadenats a la senescència. Aquests resultats impliquen que el programa de senescència pot millorar la presentació d'antigen a les cèl·lules no immunes, facilitant així la immunovigilància del tumor. Els nostres resultats donen suport a un model pel qual l'impacte final de les cèl·lules senescents en la biologia dels teixits està dictat pels efectes combinats de com envien i reben senyals ambientals. Les cèl·lules senescents no només indueixen el SASP, que desencadena la remodelació del teixit i altera l'estat cel·lular i la composició de les cèl·lules immunitàries a l'entorn, sinó que també alteren dràsticament el seu surfaceoma, donant lloc a una capacitat diferencial per detectar factors ambientals, aquí exemplificat per IFN. És important destacar que la interrupció de la senyalització d'IFN no va tenir cap efecte sobre la inducció de la senescència o el SASP del nostre sistema, però va deteriorar les regressions tumorals posteriors, cosa que indica que la detecció ambiental alterada actua de manera conjunta amb el SASP per determinar el resultat final del programa de senescència, en aquest cas, vigilància immune. Aquests efectes semblen formar part d'un programa epigenètic coordinat, ja que tant el SASP com els programes de detecció mostren una dependència destacada del factor de remodelació de la cromatina BRD4.

Tot i que el mecanisme de vigilància immune del nostre model depèn dels efectes cooperatius de les poblacions de cèl·lules T CD8 i de macròfags que reflecteixen una transició d'un microambient tumoral "immune fred" a un "immune calent", altres tipus de cèl·lules immunitàries innates o adaptatives poden reconèixer. i aclarir les cèl·lules senescents en diferents contextos, o, alternativament, la vigilància immune pot no produir-se en absolut (18, 19). Sens dubte, algunes d'aquestes distincions reflecteixen l'heterogeneïtat en la secreció del factor SASP (13, 14), tot i que els nostres resultats plantegen la possibilitat que l'extensió i la naturalesa de la detecció ambiental alterada també pugui influir en com les cèl·lules senescents afecten la biologia dels teixits. Tot i que l'eliminació de la detecció d'IFN (mitjançant Ifngr1 KO) i la supressió de MHC-I (B2M KO) a les cèl·lules tumorals senescents van deteriorar la seva vigilància immune in vivo, no va abolir completament la regressió del tumor després de la inducció de la senescència, cosa que indica que la detecció d'IFN a les cèl·lules senescents és no és l'única via que contribueix a la regressió del tumor. Independentment, el fet que les cèl·lules senescents puguin respondre de manera diferent als senyals ambientals implica que el seu estat molecular final en els teixits serà diferent que en el cultiu cel·lular, posant de manifest la necessitat de caracteritzar millor el procés in vivo.

Els nostres resultats poden ajudar a explicar els efectes paradoxals de la biologia de la senescència en la fisiologia i la malaltia i tenir implicacions per a l'ús efectiu de la terapèutica moduladora de la senescència. Per exemple, en el nostre model, la diferència entre l'eliminació i la persistència de cèl·lules senescents del tumor es va determinar, almenys en part, per la presència d'IFN ambiental i la integritat de la senyalització d'IFN tipus II a les cèl·lules senescents. Això suggereix que la variació en la capacitat de les cèl·lules senescents per reclutar i detectar cèl·lules immunes secretores d'IFN o altres tipus de cèl·lules immunitàries podria afectar profundament l'eliminació de cèl·lules senescents, de manera que la disminució de l'IFN ambiental o la disminució de la senyalització d'IFN tipus II podrien permetre la persistència de les cèl·lules senescents dins dels teixits. En el context del càncer, les teràpies que indueixen la senescència de cèl·lules tumorals, un programa citostàtic, poden desencadenar una regressió del tumor mediada per la immunitat o resensibilitzar els tumors al bloqueig del punt de control immune, però aquests no són els resultats universals. Com a tal, l'heterogeneïtat en el SASP (que pot variar entre els tipus de cèl·lules tumorals i els inductors de senescència) o la detecció i sortida d'IFN [potser afectats per la supressió o la mutació de la via IFN o els components HLA (60) o els mecanismes de transcripció reversibles descoberts aquí] poden influir. l'eficàcia d'aquestes teràpies en pacients. D'acord amb aquesta noció, la inducció impulsada per la teràpia de perfils SASP específics prediu els resultats dels pacients en un subgrup de pacients amb càncer d'ovari (61). Per contra, les estratègies per millorar la vigilància immune de les cèl·lules senescents augmentant la seva sensibilitat a IFN (per exemple, amb inhibidors de PTPN2) poden ajudar a esbiaixar la producció del programa cap al rebuig de les cèl·lules tumorals. Preveiem que investigar aquest i altres programes de remodelació i detecció de teixits en biòpsies tumorals pre i posttractament (per exemple, mitjançant perfils transcriptòmics o proteòmics) pot exposar nous biomarcadors de resposta i/o estratègies combinades per millorar la gestió clínica del càncer.

REFERÈNCIES

1. Di Micco R, Krizhanovsky V, Baker D, d'Adda di Fagagna F. Senescència cel·lular en l'envelliment: de mecanismes a oportunitats terapèutiques. Nat Rev Mol Cell Biol 2021;22:75–95.

2. Muñoz-Espin D, Serrano M. Senescència cel·lular: de la fisiologia a la patologia. Nat Rev Mol Cell Biol 2014;15:482–96.

3. Demaria M, Ohtani N, Youssef SA, Rodier F, Toussaint W, Mitchell JR, et al. Un paper essencial per a les cèl·lules senescents en la cicatrització òptima de ferides mitjançant la secreció de PDGF-AA. Dev Cell 2014;31:722–33.

4. Xu M, Pirtskhalava T, Farr JN, Weigand BM, Palmer AK, Weivoda MM, et al. Els senolítics milloren la funció física i augmenten la vida útil en la vellesa. Nat Med 2018;24:1246–56.

5. Serrano M, Lin AW, McCurrach ME, Beach D, Lowe SW. El Ras oncogènic provoca una senescència cel·lular prematura associada a l'acumulació de p53 i p16INK4a. Cell 1997;88:593–602.

6. Ewald JA, Desotelle JA, Wilding G, Jarrard DF. Senescència induïda per la teràpia en càncer. J Natl Cancer Inst 2010;102:1536–46.

7. Coppe JP, Desprez PY, Krtolica A, Campisi J. El fenotip secretor associat a la senescència: el costat fosc de la supressió del tumor. Annu Rev Pathol 2010;5:99–118.

8. Demaria M, O'Leary MN, Chang J, Shao L, Liu S, Alimirah F, et al. La senescència cel·lular promou els efectes adversos de la quimioteràpia i la recaiguda del càncer. Cancer Discov 2017;7:165–76.

9. Coppe JP, Patil CK, Rodier F, Sun Y, Munoz DP, Goldstein J, et al. Els fenotips secretors associats a la senescència revelen funcions no autònomes de cèl·lules del RAS oncogènic i del supressor de tumors p53. PLoS Biol 2008;6:2853–68.

10. Tasdemir N, Banito A, Roe JS, Alonso-Curbelo D, Camiolo M, Tschaharganeh DF, et al. BRD4 connecta la remodelació potenciadora amb la vigilància immune de la senescència. Cancer Discov 2016;6:612–29.

11. Chien Y, Scuoppo C, Wang X, Fang X, Balgley B, Bolden JE, et al. El control del fenotip secretor associat a la senescència per NF-kappaB promou la senescència i millora la quimiosensibilitat. Genes Dev 2011;25:2125–36.

12. Kuilman T, Michaloglou C, Vredeveld LC, Douma S, van Doorn R, Desmet CJ, et al. Senescència induïda per oncogen retransmesa per una xarxa inflamatòria dependent de la interleucina. Cell 2008;133:1019–31.

13. Basisty N, Kale A, Jeon OH, Kuehnemann C, Payne T, Rao C, et al. Un atles proteòmic de secretomes associats a la senescència per al desenvolupament de biomarcadors d'envelliment. PLoS Biol 2020;18:e3000599.

14. Hernandez-Segura A, de Jong TV, Melov S, Guryev V, Campisi J, Demaria M. Unmasking transcriptional heterogeneity in senescent cells. Curr Biol 2017;27:2652–60.

15. Xue W, Zender L, Miething C, Dickins RA, Hernando E, Krizhanovsky V, et al. La senescència i l'eliminació del tumor es desencadenen per la restauració de p53 en carcinomes hepàtics murins. Nature 2007;445:656–60.

16. Kang TW, Yevsa T, Woller N, Hoenicke L, Wuestefeld T, Dauch D, et al. La vigilància de la senescència dels hepatòcits pre-malignes limita el desenvolupament del càncer de fetge. Nature 2011;479:547–51.

17. Ovadya Y, Landsberger T, Leins H, Vadai E, Gal H, Biran A, et al. La vigilància immune deteriorada accelera l'acumulació de cèl·lules senescents i l'envelliment. Nat Commun 2018;9:5435.

18. Lujambio A. Netejar, o no netejar (cèl·lules senescents)? Aquesta és la pregunta. Bioassaigs 2016;38 Suppl 1:S56–64. 19. Di Mitri D, Toso A, Chen JJ, Sarti M, Pinton S, Jost TR, et al. El tumor que infiltra les cèl·lules mieloides Gr-1+ antagonitza la senescència en càncer. Nature 2014;515:134–7.

20. Ruscetti M, Leibold J, Bott MJ, Fennell M, Kulick A, Salgado NR, et al. La citotoxicitat mediada per cèl·lules NK contribueix al control del tumor mitjançant una combinació de fàrmacs citostàtics. Science 2018;362:1416–22.

21. Llovet JM, Kelley RK, Villanueva A, Singal AG, Pikarsky E, Roayaie S, et al. Carcinoma hepatocel·lular. Nat Rev Dis Primers 2021;7:6.

22. Chiang DY, Villanueva A, Hoshida Y, Peix J, Newell P, Minguez B, et al. Guanys focals de VEGFA i classificació molecular del carcinoma hepatocel·lular. Cancer Res 2008;68:6779–88.

23. Llovet JM, Castet F, Heikenwalder M, Maini MK, Mazzaferro V, Pinato DJ, et al. Immunoteràpies per al carcinoma hepatocel·lular. Nat Rev Clin Oncol 2022;19:151–72.

24. Sangro B, Sarobe P, Hervas-Stubbs S, Melero I. Avenços en immunoteràpia per al carcinoma hepatocel·lular. Nat Rev Gastroenterol Hepatol 2021;18:525–43.

25. Levine AJ. Orientar la proteïna P53 per a teràpies contra el càncer: l'impacte translacional de la investigació P53. Cancer Res 2022;82:362–4.

26. Xiao Y, Chen J, Zhou H, Zeng X, Ruan Z, Pu Z, et al. La combinació de la monoteràpia d'ARNm de p53 amb el bloqueig del punt de control immune reprograma el microentorn immune per a una teràpia eficaç del càncer. Nat Commun 2022;13:758.

27. Demir O, Barros EP, Offutt TL, Rosenfeld M, Amaro RE. Una visió integrada de la dinàmica, la funció i la reactivació de p53. Curr Opin Struct Biol 2021;67:187–94.

28. Suda T, Liu D. Lliurament de gens hidrodinàmics: els seus principis i aplicacions. Mol Ther 2007;15:2063–9.

29. Hoshida Y, Nijman SM, Kobayashi M, Chan JA, Brunet JP, Chiang DY, et al. L'anàlisi integrativa del transcriptoma revela subclasses moleculars comunes de carcinoma hepatocel·lular humà. Cancer Res 2009;69:7385–92.

30. Kaech SM, Hemby S, Kersh E, Ahmed R. Perfil molecular i funcional de la diferenciació de cèl·lules T CD8 de memòria. Cell 2002;111:837–51.

31. Bruix J, Cheng AL, Meinhardt G, Nakajima K, De Sanctis Y, Llovet J. Factors pronòstics i predictors del benefici de sorafenib en pacients amb carcinoma hepatocel·lular: anàlisi de dos estudis de fase III. J Hepatol 2017;67:999–1008.

32. Adrover JM, Aroca-Crevillen A, Crainiciuc G, Ostos F, Rojas-Vega Y, Rubio-Ponce A, et al. El "desarmament" programat del proteoma dels neutròfils redueix la magnitud de la inflamació. Nat Immunol 2020;21: 135–44.

33. Zeisberger SM, Odermatt B, Marty C, Zehnder-Fjallman AH, Ballmer-Hofer K, Schwendener RA. Esgotament de macròfags associats al tumor mediat per clodronat: un enfocament de teràpia antiangiogènica nou i altament eficaç. Br J Cancer 2006;95:272–81.

34. De Simone G, Andreata F, Bleriot C, Fumagalli V, Laura C, Garcia-Manteiga JM, et al. Identificació d'un subconjunt de cèl·lules de Kupffer capaç de revertir la disfunció de les cèl·lules T induïda per l'encebació hepatocel·lular. Immunitat 2021;54:2089–100.

35. Dann E, Henderson NC, Teichmann SA, Morgan MD, Marioni JC. Prova d'abundància diferencial en dades d'una sola cèl·lula mitjançant gràfics de k-veïns més propers. Nat Biotechnol 2022;40:245–53.

36. Kim HD, Park S, Jeong S, Lee YJ, Lee H, Kim CG, et al. 4–1BB delimita l'estat d'activació diferent de les cèl·lules T CD8(+) esgotades que s'infiltran en el tumor en el carcinoma hepatocel·lular. Hepatologia 2020;71:955–71.

37. Li Y, Wang Z, Jiang W, Zeng H, Liu Z, Lin Z, et al. Les cèl·lules T TNFRSF9(+) CD8(+) infiltrants de tumors defineixen diferents subconjunts de carcinoma renal de cèl·lules clares amb pronòstic i resposta immunoterapèutica. Oncoimmunologia 2020;9:1838141.

38. Bindea G, Mlecnik B, Tosolini M, Kirilovsky A, Waldner M, Obenauf AC, et al. La dinàmica espaciotemporal de les cèl·lules immunitàries intratumorals revelen el paisatge immunitari en el càncer humà. Immunitat 2013;39:782–95.

39. Kuang DM, Zhao Q, Peng C, Xu J, Zhang JP, Wu C, et al. Els monòcits activats a l'estroma peritumoral del carcinoma hepatocel·lular afavoreixen el privilegi immune i la progressió de la malaltia a través de PD-L1. J Exp Med 2009;206:1327–37.

40. Lu LG, Zhou ZL, Wang XY, Liu BY, Lu JY, Liu S, et al. El bloqueig de PD-L1 allibera propietats antitumorigèniques intrínseques dels macròfags glicolítics en el carcinoma hepatocel·lular. Gut 2022;71:2551–60.

41. Milanovic M, Fan DNY, Belenki D, Dabritz JHM, Zhao Z, Yu Y, et al. La reprogramació associada a la senescència afavoreix la tija del càncer. Nature 2018;553:96–100.

42. Yousef H, Czupalla CJ, Lee D, Chen MB, Burke AN, Zera KA, et al. La sang envellida afecta l'activitat del precursor neuronal de l'hipocamp i activa la microglia mitjançant la cèl·lula endotelial cerebral VCAM1. Nat Med 2019;25:988–1000.

43. Rapisarda V, Borghesan M, Miguela V, Encheva V, Snijders AP, Lujambio A, et al. La integrina beta 3 regula la senescència cel·lular activant la via TGF-beta. Cell Rep 2017;18:2480–93.

44. Jochems F, Thijssen B, De Conti G, Jansen R, Pogacar Z, Groot K, et al. La SENESCopedia del càncer: una delimitació de la senescència de cèl·lules canceroses. Cell Rep 2021;36:109441.

45. Perna F, Berman SH, Soni RK, Mansilla-Soto J, Eyquem J, Hamieh M, et al. Integració de proteòmica i transcriptòmica per a la teràpia combinatòria sistemàtica de receptors d'antigen quimèrics de l'AML. Cancer Cell 2017;32:506–19.

46. ​​Hoare M, Ito Y, Kang TW, Weekes MP, Matheson NJ, Patten DA, et al. NOTCH1 media un canvi entre dos secretomes diferents durant la senescència. Nat Cell Biol 2016;18:979–92.

47. Castro F, Cardoso AP, Goncalves RM, Serre K, Oliveira MJ. Interferó gamma a la cruïlla de la vigilància o evasió immune del tumor. Front Immunol 2018;9:847.

48. Platanias LC. Mecanismes de senyalització mediada per interferó tipus I i tipus II. Nat Rev Immunol 2005;5:375–86.

49. Manguso RT, Pope HW, Zimmer MD, Brown FD, Yates KB, Miller BC, et al. El cribratge CRISPR in vivo identifica Ptpn2 com a objectiu d'immunoteràpia contra el càncer. Nature 2017;547:413–8.

50. Song MM, Shuai K. El supressor de la senyalització de citocines (SOCS) 1 i les proteïnes SOCS3 però no SOCS2 inhibeixen les activitats antivirals i antiproliferatives mediades per interferó. J Biol Chem 1998;273:35056–62.

51. Kleppe M, Soulier J, Asnafi V, Mentens N, Hornakova T, Knoops L, et al. PTPN2 regula negativament el JAK1 oncogènic en la leucèmia limfoblàstica aguda de cèl·lules T. Blood 2011;117:7090–8.

52. Zhou F. Mecanismes moleculars de l'IFN-gamma per regular a l'alça el processament i la presentació de l'antigen de classe I del MHC. Int Rev Immunol 2009;28:239–60.

53. McCarthy MK, Weinberg JB. L'immunoproteasoma i la infecció viral: un regulador complex de la inflamació. Front Microbiol 2015; 6:21.

54. Yoshihama S, Vijayan S, Sidiq T, Kobayashi KS. NLRC5/CITA: un actor clau en la vigilància immune del càncer. Tendències Càncer 2017;3:28–38.

55. Kalaora S, Lee JS, Barnea E, Levy R, Greenberg P, Alon M, et al. L'expressió d'immunoproteasoma s'associa amb un millor pronòstic i resposta a les teràpies de control en el melanoma. Nat Commun 2020; 11:896.

56. Efeyan A, Ortega-Molina A, Velasco-Miguel S, Herranz D, Vassilev LT, Serrano M. Induction of p53-dependent senescence by the MDM2 antagonist nutlin-3a in mouse cells of fibroblast origen. Cancer Res 2007;67:7350–7.

57. Hoekstra ME, Bornes L, Dijkgraaf FE, Philips D, Pardieck IN, Toebes M, et al. Modulació a llarga distància de cèl·lules tumorals espectadors per IFNgamma secretat per cèl·lules T CD8(+). Nat Cancer 2020;1:291–301.

58. Ruscetti M, Morris JPt, Mezzadra R, Russell J, Leibold J, Romesser PB, et al. La remodelació vascular induïda per la senescència crea vulnerabilitats terapèutiques en el càncer de pàncrees. Cell 2020;181:424–41.

59. Dighe AS, Richards E, Old LJ, Schreiber RD. Creixement millorat in vivo i resistència al rebuig de cèl·lules tumorals que expressen receptors gamma IFN negatius dominants. Immunitat 1994;1:447–56.

60. Gao J, Shi LZ, Zhao H, Chen J, Xiong L, He Q, et al. Pèrdua de gens de la via gamma de l'IFN a les cèl·lules tumorals com a mecanisme de resistència a la teràpia anti-CTLA-4. Cel·la 2016;167:397–404.

61. Paffenholz SV, Salvagno C, Ho YJ, Limjoco M, Baslan T, Tian S, et al. La inducció de la senescència dicta la resposta a la quimioteràpia i la immunoteràpia en models preclínics de càncer d'ovari. Proc Natl Acad Sci USA 2022;119:e2117754119.

62. Shao DD, Xue W, Krall EB, Bhutkar A, Piccioni F, Wang X, et al. KRAS i YAP1 convergeixen per regular l'EMT i la supervivència del tumor. Cell 2014;158:171–84.

63. Zhu C, Kim K, Wang X, Bartolome A, Salomao M, Dongiovanni P, et al. L'activació de l'hepatòcit Notch indueix fibrosi hepàtica en l'esteatohepatitis no alcohòlica. Sci Transl Med 2018;10:eaat0344.

64. Susaki EA, Tainaka K, Perrin D, Yukinaga H, Kuno A, Ueda HR. Protocols CUBIC avançats per a la neteja i la imatge de tot el cervell i el cos sencer. Nat Protoc 2015;10:1709–27.

65. Bolger AM, Lohse M, Usadel B. Trimmomatic: a flexible trimmer for Illumina sequence data. Bioinformàtica 2014;30:2114–20. 66. Dobin A, Davis CA, Schlesinger F, Drenkow J, Zaleski C, Jha S, et al. STAR: alineador universal d'ARN-seq ultraràpid. Bioinformàtica 2013;29:15–21.

67. Anders S, Pyl PT, Huber W. HTSeq-un marc de Python per treballar amb dades de seqüenciació d'alt rendiment. Bioinformàtica 2015;31:166–9.

68. Love MI, Huber W, Anders S. Estimació moderada del canvi de plecs i la dispersió per a les dades d'ARN-seq amb DESeq2. Genoma Biol 2014;15:550.

69. Chen EY, Tan CM, Kou Y, Duan Q, Wang Z, Meirelles GV, et al. Enrichr: eina d'anàlisi d'enriquiment de llista de gens HTML5 interactiva i col·laborativa. BMC Bioinf 2013;14:128.

70. Foroutan M, Bhuva DD, Lyu R, Horan K, Cursons J, Davis MJ. Valoració de la mostra única de fenotips moleculars. BMC Bioinf 2018;19:404.

71. Binder JX, Pletscher-Frankild S, Tsafou K, Stolte C, O'Donoghue SI, Schneider R, et al. COMPARTIMENTS: unificació i visualització de l'evidència de localització subcel·lular de proteïnes. Base de dades (Oxford) 2014;2014:bau012.

72. Xarxa de recerca de l'Atles del genoma del càncer. Caracterització genòmica integral i integradora del carcinoma hepatocel·lular. Cèl·lula 2017; 169:1327–41.

73. Colaprico A, Silva TC, Olsen C, Garofano L, Cava C, Garolini D, et al. TCGAbiolinks: un paquet R/Bioconductor per a l'anàlisi integradora de dades TCGA. Nucleic Acids Res 2016;44:e71.

74. Hanzelmann S, Castelo R, Guinney J. GSVA: anàlisi de variació del conjunt de gens per a dades de microarrays i RNA-seq. BMC Bioinf 2013;14:7.

75. Bankhead P, Loughrey MB, Fernandez JA, Dombrowski Y, McArt DG, Dunne PD, et al. QuPath: programari de codi obert per a l'anàlisi d'imatges de patologia digital. Sci Rep 2017;7:16878.

76. Bernstein NJ, Fong NL, Lam I, Roy MA, Hendrickson DG, Kelley DR. Solo: identificació de doblets en RNA-Seq unicel·lular mitjançant aprenentatge profund semisupervisat. Cell Syst 2020;11:95–101.

77. Satija R, Farrell JA, Gennert D, Schier AF, Regev A. Spatial reconstruction of single-cell gene expression data. Nat Biotechnol 2015;33:495–502.

78. McInnes L, Healy J, Melville J. UMAP: aproximació i projecció de varietat uniforme per a la reducció de dimensions. arXiv: 1802.03426 [Preimpressió]. 2018. Disponible a: https://doi.org/10.48550/arXiv.1802.03426.

79. Traag VA, Waltman L, van Eck NJ. De Lovaina a Leiden: garantir comunitats ben comunicades. Ciència Rep 2019;9:5233.

80. Korsunsky I, Millard N, Fan J, Slowikowski K, Zhang F, Wei K, et al. Integració ràpida, sensible i precisa de dades d'una sola cel·la amb Harmony. Nat Methods 2019;16:1289–96.