La transcriptòmica unicel·lular revela interaccions cèl·lules-cèl·lules del filtre renal alterades després d'una lesió primerenca i selectiva dels podòcits
Jul 01, 2024
Malalties renals cròniques (ERC)encara afecta a 700 milions de persones a tot el mónespecífiquesfic teràpiesmanquen.1 Moltsles malalties renals s'originen in elglomèrul, elfiunitat de filtració del ronyó. El glomèrul està format per (i) podòcits, cèl·lules postmitòtiques especialitzades amb processos del peu elaborats que s'interdigiten formant diafragmes d'escletxa i embolcallant capil·lars glomerulars; (ii) cèl·lules endotelials, que es troben enfront dels podòcits en una membrana basal glomerular compartida (GBM); (iii) cèl·lules mesangials, que formen una matriu que proporciona suport estructural al glomèrul; i (iv) cèl·lules epitelials parietals (PEC), que recobreixen la càpsula de Bowman.2 La lesió dels podòcits, en particular, condueix a moltes malalties renals progressives i molt prevalents, com ara la malaltia renal diabètica (DKD), la glomeruloesclerosi segmentària focal (FSGS) i la síndrome nefròtica (tant idiopàtica com genètica). El patró canònic de lesió provoca la pèrdua de processos interdigitants del peu podòcit, conegut com a esborrament del procés del peu, causat per una reordenació del citoesquelet d'actina. Aquest esborrament condueix a una interrupció del diafragma d'escletxa, la barrera física que funciona com afilter, seguit de despreniment de podòcits o mort.3,4 D'altra banda, a més dels podòcits intactes, la formació i manteniment de laglomerularfibarrera de filtraciórequereixencomunicació intraglomerular, estretament controlada per una sèrie de mecanismes de senyalització autòcrina i paracrina. Per exemple, el factor de creixement endotelial vascular A (VEGFA) és un senyal de supervivència per a cèl·lules endotelials secretades pels podòcits, i el factor de creixement derivat de plaquetes B (PDGFB) és un senyal de supervivència per a cèl·lules mesangials secretades per cèl·lules endotelials.5 La interrupció d'aquestes interaccions cèl·lula-cèl·lula s'observa amb freqüència en una sèrie de malalties glomerulars, com ara FSGS i DKD.6 Per tant, identificar els primers canvis disruptius al glomèrul pot oferir nous objectius i l'oportunitat d'optimitzar l'èxit terapèutic per altractament de les malalties renals.
NOVES HERBES PERTRACTAMENT DE MALALTIES RENOLÓS
Amb el suport de l'Institut Nacional de Diabetis i Malalties Digestives i Renals del NIH, les subvencions DK103658, DK099465 i DK095045 (AG). Comunicació intraglomerular, estretament controlada per una sèrie de mecanismes de senyalització autòcrina i paracrina. Per exemple, el factor de creixement de l'endotelial vascular A (VEGFA) és un senyal de supervivència per a les cèl·lules endotelials secretades pels podòcits, i el factor de creixement derivat de plaquetes B (PDGFB) és un senyal de supervivència per a les cèl·lules mesangials secretades per cèl·lules endotelials.5 Alteració d'aquestes cèl·lules. Les interaccions cel·lulars s'observen amb freqüència en una sèrie de malalties glomerulars, com ara FSGS i DKD.6 Per tant, identificar els primers canvis disruptius al glomèrul pot oferir nous objectius i l'oportunitat d'optimitzar l'èxit terapèutic per al tractament de les malalties renals.
La seqüenciació d'ARN unicel·lular (scRNAseq) ha revolucionat la capacitat d'estudiar els tipus de cèl·lules individuals de teixits complexos i estats cel·lulars després de pertorbacions específiques. mostres humanes així com en alguns estats de malaltia, incloent DKD i nefritis lúpica.9e12 No obstant això, els estudis detallats dels estats de cèl·lules glomerulars s'han vist limitats pel petit nombre de cèl·lules disponibles per a l'anàlisi. A més, els primers canvis específics de tipus cel·lular que es produeixen a totes les cèl·lules glomerulars de la lesió dels podòcits no s'han controlat i encara no s'han definit.
L'ablació de podòcits mitjançant la supressió induïble específica de podòcits d'una proteïna endògena essencial, CTCF, condueix a una malaltia renal proteïnúrica progressiva i CKD.13 Històricament, els models de ratolins CKD es van generar induint lesions renals per toxines exògenes o intervencions quirúrgiques, sistemes subòptims que no aconsegueixen. recapitulant canvis mecànics seqüencials. La supressió de CTCF, una molècula endògena essencial, condueix a una ràpida pèrdua de podòcits, albuminúria progressiva severa, canvis en el metabolisme dels minerals ossis, insuficiència renal i mort prematura.13 El model de supressió de CTCF específic del podòcit inducible (iCTCFpod / ) ofereix l'oportunitat única d'estudiar. canvis en les interaccions cèl·lula-cèl·lula intraglomerular com a conseqüència de la lesió podòcit induïda. L'expressió del podòcit CTCF és indetectable en el primer moment, a 1 setmana d'inducció Cre mediada per doxiciclina en iCTCFpod / ratolins.13 La pèrdua significativa i progressiva de podòcits, mesurada per anàlisi histològica, comença a les 2 setmanes després de la inducció de Cre. En l'estudi actual, es va realitzar una anàlisi detallada a la 1-setmana per identificar els canvis més primerencs en les interaccions cèl·lules intraglomerulars provocades per lesions dels podòcits que finalment condueixen a la ERC.
Materials i mètodes
Cura dels animals
Aquest estudi va ser aprovat pel Comitè d'Ús i Cura d'Animals del Brigham and Women's Hospital de la Harvard Medical School. Tots els estudis amb animals es van realitzar d'acord amb les directrius establertes i aprovades pel Comitè d'Ús i Cura d'Animals del Brigham and Women's Hospital, Harvard Medical School. Els ratolins iCrepod-Ctcfwt/fl es van generar tal com es va descriure anteriorment13 i es van endogàmia per generar ratolins iCrepod-Ctcfwt/fl (iCTCFfl/fL) i iCrepod-Ctcfwt/wt [de tipus salvatge (WT)]. En aquest estudi es van utilitzar ratolins mascles i femelles. La doxiciclina (4 g/L) (Sigma D9891) es va administrar contínuament en aigua potable que contenia sacarosa (50 g/L) (VWR BDH0308) tant a iCTCFfl/fL (genera iCTCFpod / ratolins) com a ratolins de control de camada WT (6 a 8). setmanes d'edat a l'inici de l'ús de doxiciclina) per impulsar l'expressió de Cre específicament als podòcits.
Enriquiment glomerular de ronyó sencer
Els ratolins iCTCFpod / i WT es van sacrificar després d'1 setmana de tractament amb doxiciclina, i els ronyons es van disseccionar i rentar ràpidament amb una solució de sal equilibrada de Hanks freda amb gel (número de catàleg 14170112, Thermo Scientific, Waltham, MA). Després d'eliminar les càpsules renals, els glomèruls es van enriquir a 4ºC mitjançant la tècnica de tamisat14 amb tamisos de 180-mm, 75-mm i 53-mm. Les fraccions enriquides en glomerulars recollides del tamís de 53-mm es van esbandir amb una solució de sal equilibrada de Hanks 1 freda amb gel i es van col·locar sobre gel.
Preparació de suspensions unicel·lulars
Preparació de biblioteques i seqüenciació unicel·lular
Les cèl·lules individuals es van processar mitjançant la plataforma 10 Chromium 30Single Cell mitjançant els kits Chromium Single Cell 30Library, Gel Bead i Chip (10 Genomics, Pleas anton, CA), seguint el protocol del fabricant. Breument, 10, es van afegir cèl·lules 000 a cada canal d'un xip per dividir-les en perles de gel en emulsió a l'instrument Chromium, seguida de la lisi cel·lular i la transcripció inversa amb codi de barres de l'ARN a les gotes. La ruptura de l'emulsió va ser seguida de l'amplificació, la fragmentació i l'addició de l'adaptador i l'índex de mostra. Les biblioteques es van agrupar i es van seqüenciar a Illumina HiSeq.
Reacció en cadena d'hibridació
Tots els reactius de la reacció en cadena d'hibridació (HCR) v3 (sondes, forques i tampons) es van comprar a Molecular Technologies (Pasadena, CA). Es van muntar seccions primes de teixit (10 m) en 24-plaques de fons de vidre de pou (número de catàleg 82050-898, VWR, Radnor, PA) recobertes amb un 1:5{{38} } dilució de (3-aminopropil)trietoxisilà (número de catàleg 440140, Sigma-Aldrich). Es van afegir al teixit les solucions següents: formalina al 10% (número de catàleg 100503- 120, VWR) durant 15 minuts, dos rentats d'1 PBS (número de catàleg AM9625, Thermo Fisher Scientific), EtOH al 70% gelat a 20ºC. C durant 2 hores (fins a la nit), tres rentats de 5 citrat de sodi salí amb 0,2% de Tween-20 (SSCT) (número de catàleg 15557044, Thermo Fisher Scientific), tampó d'hibridació (Molecular Technologies) durant 10 minuts, sondes a tampó d'hibridació durant la nit, quatre rentats de tampó de rentat (Molecular Technologies) durant 15 minuts, tres rentats de 5 SSCT, tampó d'amplificació (Molecular Technologies) durant 10 minuts i tres rentats de 15 minuts amb 5 SSCT (1:10,{31). }} DAPI, número de catàleg TCA2412-5MG, VWR) al segon rentat. Les forques es van desnaturalitzar per calor al tampó d'amplificació durant la nit. Les mostres es van emmagatzemar i es van fer imatges en 5 SSCT. La imatge es va realitzar en un disc confocal giratori (Yokogawa W1 a Nikon Eclipse Ti) que operava el programari AR NIS-elements. L'anàlisi i el processament d'imatges es van realitzar amb la versió 2.1.0/1.53c del programari ImageJ Fiji (NIH, Bethesda, MD; http://imagej.nih.gov/ij).
Tractament de dades i control de qualitat
A Cellranger toolkit (version 2.1.1) was used to perform demultiplexing using the cellranger mkfastq command and the cellranger count command for alignment to the mouse transcriptome, cell barcode partitioning, collapsing unique molecular identifier (UMI) to transcripts, and gene-level quantification. Cells were filtered to include cells expressing a minimum of 500 genes and a maximum of 4000 genes. Furthermore, the percentage of reads mapping to mitochondrial genes was capped at 12%. DoubletFinder was used to identify potential doublets.15 Clusters with >El 75% de les cèl·lules classificades com a doblets d'alta confiança es van eliminar de l'anàlisi posterior. Les cèl·lules restants classificades com a doblets d'alta confiança també es van eliminar de l'anàlisi posterior. L'anàlisi va implicar la reducció del mostreig del nombre de cèl·lules per tenir en compte aquesta diferència. Per exemple, si hi havia menys cèl·lules WT en un tipus de cèl·lula determinat, es va utilitzar una mostra aleatòria de cèl·lules iCTCF igual al nombre de cèl·lules WT per a l'anàlisi d'expressió diferencial.
Clúster no supervisat i reducció de la dimensionalitat
La configuració predeterminada del paquet Seurat R16 versió 3.0 es va utilitzar per a la normalització (NormalizeData) dels recomptes d'expressió gènica, la identificació de gens variables (FindVariableGenes), la recerca d'ancoratges d'integració (FindIntegrationAnchors) i la integració de les mostres (IntegrationData) . Es va produir una variació no desitjada a causa del nombre d'UMI i la proporció de mapes de lectures als gens mitocondrials (ScaleData). La reducció de la dimensionalitat es va realitzar mitjançant anàlisis de components principals (RunPCA) en els gens altament variables. La funció PCElbowPlot() es va utilitzar per distingir els components principals per a una anàlisi posterior. Per agrupar totes les cel·les, els primers 40 components principals capturaven prou tota la variància. Es van identificar clústers molecularment diferents mitjançant els paràmetres predeterminats (FindClusters) i una resolució de 0.4 (FindNeighbors). Les dades es van processar i escalar tal com es descriu anteriorment després de subconfigurar les cèl·lules glomerulars. Es van utilitzar un total de 30 components principals per a la agrupació aigües avall amb una resolució de 0,3 (FindNeighbors).
Classificació de tipus cel·lular
Els gens marcadors o enriquits en clúster es van calcular mitjançant la prova de suma de rang de Wilcoxon (FindAllMarkers) per a l'expressió diferencial de gens a les cèl·lules del clúster en comparació amb la resta de cèl·lules i seleccionant aquells gens que superen el valor P ajustat (taxa de descobriment fals) de {{1 }}.05 com a representant del clúster. La identitat del clúster es va assignar comparant gens basats en dades amb una llista de gens curats per la literatura per a tipus de cèl·lules renals madures.
Anàlisi de l'expressió gènica diferencial
L'anàlisi d'expressió diferencial per parelles a Seurat (FindMarkers) es va utilitzar amb el llindar de canvi de plec de registre establert a {{0}}.01 i els paràmetres predeterminats per analitzar l'expressió diferencial entre les cèl·lules iCTCFpod / i WT en un clúster específic. Dins de FindMarkers, ident.1 es va establir a iCTCFpod / cèl·lules específiques del clúster i ident.2 es va establir a les corresponents cèl·lules WT específiques del clúster. Els gens amb un P ajustat <0, 05 es van considerar significatius.
Anàlisi de sobrerepresentació
L'anàlisi de sobrerepresentació es va utilitzar per determinar si alguna funció o procés biològic conegut estaven sobrerepresentats o enriquits a la(s) llista(s) de gens expressats de manera diferencial.17 Per a l'anàlisi de sobrerepresentació es va utilitzar el paquet R clusterProfiler18, concretament la funció enrichGO. Es van utilitzar els paràmetres per defecte, amb les excepcions d'ont Z BP, pvaluecutoff Z 0.25 i qvaluecutoff Z 0}.25. A continuació, es va utilitzar el paquet R enrichplot (GitHub, https://github.com/YuLab-SMU/enrichplot, últim accés el 30 d'agost de 2021), específicament la funció emapplot, per visualitzar els resultats d'enriquiment traçant els termes d'enriquiment principals.
Anàlisi de receptors de lligands
iTALK19 es va utilitzar per mapar receptors a lligands que es van expressar de manera diferent en iCTCFpod / podòcits. Concretament, rawParse es va utilitzar per calcular l'expressió mitjana de cada gen, utilitzant dades escalades de Seurat. FindLR utilitzant el tipus de dades Z meancount es va utilitzar per identificar parells de lligands i receptors. Els parells d'interès de lligands i receptors es van representar mitjançant els paràmetres predeterminats de LRPlot. El gruix de les línies indica l'expressió mitjana relativa del lligand i la mida de la punta de la fletxa indica l'expressió mitjana relativa del receptor.
Anàlisi de NicheNet
El paquet R NicheNet20 es va utilitzar per predir les interaccions de lligandreceptors que podrien provocar canvis en l'expressió gènica en el tipus de cèl·lula d'interès. Tots els grups de podòcits i tots els grups endotelials es van combinar per a aquesta anàlisi. Es van utilitzar tots els paràmetres predeterminats a excepció d'establir un llindar de tall inferior de 0.11 per preparar_lligand_objectiu_visualització. Processament i quantificació d'imatges HCR Les imatges es van processar mitjançant el programari ImageJ2 (NIH, Bethesda, MD; http://imagej.nih.gov/ij). Per als fitxers ImageJ, es va utilitzar la versió 2.1.0/1.53c (http://imagej.net/ Col·laboradors (últim accés el 2 d'agost de 2020). Els fitxers ND2 en brut es van restar en segon pla mitjançant el mètode Rolling Ball (rodament de la pila lliscant Z 50) A continuació, es van projectar les intensitats mitjanes de les imatges de la pila Z i es van dividir i guardar els canals d'imatge per separat, la versió 3.1.5 de CellProfiler (Broad Institute of MIT i Harvard, Cambridge, MA)21 per a la segmentació cel·lular basada en la intensitat de la fluorescència. del canal DAPI i per mesurar la intensitat de fluorescència integrada a la resta de canals es van avaluar quatre iCTCFpod / ratolins per a l'anàlisi estadística Es van quantificar tots els glomèruls de tres imatges de Welch.
Servei de suport de Wecistanche: el major exportador de cistanche a la Xina:
Correu electrònic:wallence.suen@wecistanche.com
Whatsapp/Tel:+86 15292862950
Compreu per obtenir més detalls de les especificacions:
https://www.xjcistanche.com/cistanche-shop
FEU CLIC AQUÍ PER OBTENIR EXTRACTE DE CISTANX ORGÀNIC NATURAL AMB 25% ECHINACOSIDE I 9% ACTEOSIDE PER A LA FUNCIÓ RENOLÓ
