SLC37A2, una molècula relacionada amb el fòsfor augmenta en les cèl·lules del múscul llis a l'aorma calcificat

Calcificació vascularés una font important demalaltia cardiovascularen pacients amb malaltia renal crònica.Hiperfosfatèmiacondueix a un augment de l'afluència intracel·lular de fòsfor, que condueix a un augment de cèl·lules semblants als osteoblasts a les cèl·lules del múscul llis vascular. PiT-1 transita el fosfat a les cèl·lules del múscul llis vascular. Tanmateix, el mecanisme de la calcificació vascular no s'entén completament. Aquest estudi va investigar molècules candidates relacionades amb el fòsfor diferents de PiT-1. Vam plantejar la hipòtesi que les molècules relacionades amb el fòsfor pertanyien atransportador de solutla superfamília (SLC) estaria implicada en la calcificació vascular. Com a resultat de l'anàlisi de microarrays d'ADN, ens vam centrar en SLC37A2 i vam demostrar que l'expressió d'ARNm d'aquestes cèl·lules augmentava a les cèl·lules del múscul llis aòrtic calcificat (AoSMC). S'ha informat que SLC37A2 transporta tant intercanvis de glucosa-6-fosfat/fosfat com de fosfat/fosfat. L'anàlisi in vitro va demostrar que l'expressió SLC37A2 no es va veure afectada per la inflamació a AoSMC. L'expressió d'ARNm i proteïna SLC37A2 va augmentar en AoSMC calcificat. In vivo, l'anàlisi va demostrar que l'expressió d'ARNm de SLC37A2 a l'aorta demalaltia renal crònicarates es va correlacionar amb gens marcadors osteogènics. A més, SLC37A2 es va expressar a la zona de calcificació vascular arates amb malaltia renal crònica. Com a resultat, vam demostrar que SLC37A2 és una de les molècules que augmenta ambcalcificació vascularin vitro i in vivo.

Paraules clau: SLC37A2,calcificació vascular, cèl·lules musculars llises aòrtiques,malaltia renal crònica, hiperfosfatèmia

FEU CLIC AQUÍ PER OBTENIR EXTRACTE DE CISTANX ORGÀNIC NATURAL AMB 25% ECHINACOSIDE I 9% ACTEOSIDE PER A LA FUNCIÓ RENOLÓ

Servei de suport de Wecistanche: el major exportador de cistanche a la Xina:

Correu electrònic:wallence.suen@wecistanche.com

WhatsApp/Tel:+86 15292862950}

Compreu per obtenir més detalls de les especificacions:

https://www.xjcistanche.com/cistanche-shop

Com el nombre de pacients ambmalaltia renal crònica(ERC) augmenta, el nombre de pacientsque requereixen diàlisiaugmentarà també. La majoria de morts en pacients sotmesosdiàlisisón deguts amalalties cardiovascularstal cominsuficiència cardíaca, trastorns cerebrovasculars, o infart de miocardi. (,2) Una font important demalaltia cardiovascularés la calcificació ectòpica,() una anormalitat causada per la formació i la deposició de cristalls de fosfat de calci als teixits tous. (4 6) Diversos factors, com ara la inflamació. L'estrès oxidatiu i l'augment dels nivells plasmàtics de calci (Ca) i fòsfor (P) estan implicats en la progressió de la calcificació vascular. Entre aquests factors, la hiperfosfatèmia s'associa més fortament amb la calcificació vascular. (7.8) La hiperfosfatèmia és causada per una ingesta excessiva de P en presència de disminució de la funció renal. Per tant, els pacients sotmesos a diàlisi han de limitar la ingesta de P. (79-12) No obstant això, s'ha informat quecalcificació vascularja avança quan s'inicia la diàlisi; també s'ha vist en pacients amb ERC en fase inicial quan la hiperfosfatèmia no és evident. (3) En conseqüència, és important prevenir la calcificació vascular en pacients amb ERC en fase inicial per millorar el pronòstic de vida.

que condueix a un augment de l'afluència de P a les cèl·lules musculars llises vasculars (VSMC). L'afluència de P es realitza mitjançant PiT-1, un transportador a la superfície de la membrana cel·lular de VSMC. PiT- és un membre de la superfamília de transportadors de soluts (SLC), que inclou un transportador de fosfat sòdic codificat per SLC20A1.04 PiT- transporta fosfat a través de les membranes cel·lulars dependents de Na i, posteriorment, la mineralització de la matriu a causa dels nivells elevats de p.s) Com a intracel·lular Els nivells de P augmenten, VSMC comença a expressar factors de transcripció osteogènics, com el factor de transcripció relacionat amb runt 2(Runx2)(16) Aquest efecte és seguit per una major expressió de gens específics dels osteoblasts, com l'osteopontina i l'osteocalcina. A més, es va reduir l'expressió de proteïnes específiques del múscul llis. com ara la proteïna del múscul llis 22-0 (SM22-0), es produeix. Com a resultat, VSMC es transforma en cèl·lules semblants als osteoblasts. (1718) Estudis clínics recents han demostrat que els nivells sanguinis de calci. les partícules de proteïnes (CPP), que representen partícules col·loïdals de fosfat de calci, augmenten amb la disminució de la funció renal. (19-21)A més, s'han informat correlacions amb els nivells de CPP i P en sang.2o2i) És possible que la CpP pugui desencadenar la progressió de la calcificació vascular.22-24)

Tanmateix, s'ha observat calcificació vascular en pacients amb ERC en fase inicial amb nivells plasmàtics de P normals. (13) A més. L'ARNm PiT-1 s'expressa de manera omnipresent en tots els teixits. Així, una altra molècula pot actuar principalment a l'àrea de la calcificació vascular. Hi ha informes queinflamacióafavoreix la calcificació vascular. Factors inflamatoris com la interleucina (IL)-1B, IL-6 i el factor de necrosi tumoral alfa (TNF-a) van induir la diferenciació de VSMC en cèl·lules semblants als osteoblasts (2s26) TNF-a indueix la calcificació vascular a través de la via de l'AMPc, que té un paper en la diferenciació dels osteoblasts.2728) IL-6 regula diverses vies que condueixen a la calcificació vascular de VSMC2-31) A més. IllB, IL-6 i TNF-a també són factors associats a l'augment de la calcificació vascular induïda per nivells elevats de p.3233) Tanmateix. Les dades actuals no expliquen completament el mecanisme vascular

calcificació induïda per aquests factors. Vam plantejar la hipòtesi que podria haver-hi altres molècules relacionades amb P com les de la superfamília SLC, implicades en la calcificació vascular. Ens vam centrar en les proteïnes de membrana de la superfamília SLC i vam investigar molècules potencialment candidates relacionades amb P diferents de PiT-1 per a la implicació en la calcificació vascular. A més, es va examinar la relació entre les molècules candidates i la calcificació vascular en vídeo i in vivo.

Materials i mètodes

Cultiu cel·lular. Es van obtenir cèl·lules musculars llises humanes òrtiques (AoSMC) de Lonza (Basilea, Suïssa) AoSMC es va cultivar segons les instruccions del fabricant. Les AoSMC es van mantenir en un medi de creixement (medi basal de cèl·lules musculars llises complementat amb sèrum boví fetal al 5% (FBS), factor de creixement epidèrmic, insulina, factor de creixement de fibroblasts-B i gentamicina/amfotericina-B). Els mitjans de comunicació es canvien cada dos dies. Els AoSMC es van cultivar en una incubadora humidificada al 5% de CO a 37 graus i es van mantenir fins que es va arribar a la confluència i després es van utilitzar en experiments.

AoSMC calcificada. La calcificació d'AoSMC es va induir tal com s'ha descrit anteriorment.435) Les AOSMC es van cultivar en medi Eagle modificat de Dulbecco suplementat amb FBS al 15% i penicil·lina-estreptomicina i es van cultivar amb 2,6 mM de P durant 3, 6, 9, 12 i 14 dies. La concentració de P es va ajustar mitjançant el tampó PNaH, PO/Na i HPO. pH 7,2). Altres AoSMC no es van cultivar amb 2, 6 mM de P.

microarrays d'ADN. Es va utilitzar l'ARN total de mostres d'AoSMC cultivades i no cultivades amb 2, 6 mM de P. L'ARN total 5.0 ug es va analitzar mitjançant un microarray d'ADN (Agilent Technologies, Tòquio, Japó). SurePrint G3 Human GE 8 x 60k ver. 2 Es va utilitzar microarray per examinar uns 26,000 gens. La relació es va calcular dividint el nivell d'expressió d'AoSMC cultivat amb 2,6 mM durant 12 dies pel nivell d'expressió d'AoSMC no cultivat amb 2,6 mM P

microarrays d'ADN

Es va utilitzar l'ARN total de mostres d'AoSMC cultivades i no cultivades amb 2, 6 mM de P. L'ARN total 5.0 ug es va analitzar mitjançant un microarray d'ADN (Agilent Technologies, Tòquio, Japó). SurePrint G3 Human GE 8 x 60k ver. 2 Es va utilitzar microarray per examinar uns 26,000 gens. La relació es va calcular dividint el nivell d'expressió en AoSMC cultivat amb 2,6 mM durant 12 dies pel nivell d'expressió en AoSMC no cultivat amb 2,6 mM P. Expressió de SLC37A2 en inflamació vascular. Per induir una resposta inflamatòria en AoSMC, les cèl·lules es van cultivar amb medi de creixement fins que van arribar a la confluència i després es van tractar amb 1 ugmL de lipopolisacàrids (LPS) (LPS d'Escherichia coli O111: B4; Sigma, St. Louis, MO) durant 24 i 72 anys sense 2,6 mM P. Altres AoSMC no es van cultivar amb anàlisi de reacció en cadena de la polimerasa (PCR) en temps real. L'ARN total es va extreure d'AoSMC tractat amb LPS durant 24 i 72 h i cèl·lules no tractades amb LPS. La PCR quantitativa en temps real basada en verd SYBR es va realitzar mitjançant ADNc sintetitzat i un conjunt d'imprimadors adequats per a cada gen objectiu amb un sistema de PCR en temps real aStepOnePlus (Applied Biosystems, FosterCity, CA). Les seqüències d'encebadors eren les següents: IL-6.5-AATTCGGTACATCCTCGACGG-3' i 5-GCCATCTTTGGAAGGTTCAGG-3' humana; humà SLC37A2,5TCACTTTAGTGCCAAGGAGGC-3' i 5CCATTGGTGTAGTCAGAGACG-3'; Els nivells d'expressió de gliceraldehid-3-fosfat deshidrogenasa (GAPDH5'-CTGCACCACCAACTGCTTAGC- i 5-CTTCGGGIGGCAGTGATGGC{{-3.IL{{-6 i SLC37A2) es van calcular després de la normalització amb GAPLCDH.A2. AoSMC.El total es va extreure d'AoSMC no cultivat amb 2,6 mM de P i cèl·lules AoSMC cultivades amb 2,6 mM de P durant 3, 6, 9, 12 i 14 dies. Es va realitzar PCR en temps real utilitzant l'ADNc sintetitzat. Les seqüències d'encebadors eren com segueix: Runx2 humà, 5-TGAGGCCGCTTCTCCAACCC-3' i 5-CTCTGGCTTTGGGAAGAGCCG-3. Els nivells d'expressió d'ARNm de Runx2 i SLC37A2 es van calcular després de la normalització amb APPH.

Anàlisi de Western Blotting.

La proteïna total es va recollir a partir de mostres d'AoSMC cultivades en les mateixes condicions que s'utilitzen per a l'anàlisi de PCR en temps real. Aquestes mostres es van lisar amb solució salina tamponada amb Tris (pH 75) complementada amb un 5% de NP -40 i un còctel d'inhibidors de proteases a l'1%. Les mostres de concentració de proteïnes es van mesurar mitjançant el kit d'assaig de proteïnes BCA (Thermo FisherScientific.Waltham, MA). i la concentració es va ajustar mitjançant western blotting, es van separar 10 ug de proteïna en un gel de poliacrilamida al 10% mitjançant electroforesi en gel de dodecilsulfat de sodi-poliacrilamida. La membrana es va tractar amb anticossos SLC37A2 (Novus Biologicals, Centennial, CO) o GAPDH (GeneTex, Irvine, CA) com a anticossos primaris, incubats amb anticossos conjugats amb peroxidasa de rave picant lgG (R&D Systems, Minneapolis, MN) com a anticossos secundaris. i es visualitza amb Amersham ECL Select (GE Healthcare. Buckinghamshire, Anglaterra) i un analitzador d'imatges luminescents (LAS-1000 plus, FUNIIFILM, Tòquio, Japó). La banda es va quantificar mitjançant lmagel.

Experimental

Tots els protocols d'estudi van ser aprovats pel Comitè d'Ètica de la Universitat de Hyogo, Escola de Ciències Humanes i Medi Ambient. Es van comprar rates Sprague-Dawley mascles de dotze setmanes a Japan SLC (Shizuoka, Japó). Les rates es van mantenir en un cicle de 12-clar, 12-h fosc (09:00-21:00) i es va permetre l'accés lliure al menjar i aigua extrapura.

Les dietes experimentals inclouen una dieta control P (1,0% P, 0,6Ca, 20% proteïna), una dieta amb adenina (0,75% adenina , 1,0% P, 0,6% Ca, 2,5% proteïna), una dieta baixa en P (LP) (0,2% P,0 ,6% Ca, 10%proteïna) i una dieta alta en P (HP) (1,0% P, 0,6% Ca, 10% proteïna) basada en la dieta AIN93-G (Oriental Llevat, Tòquio, Japó) amb caseïna com a font de proteïnes.3637) S'ha informat que una dieta baixa en proteïnes afavoreix la calcificació vascular en rates amb insuficiència renal induïda per adenina, de manera que es va realitzar una restricció proteica.3738)Abans d'agrupar, totes les rates (n=23) van ser alimentats amb una dieta MF estàndard (llevat oriental) durant una setmana per aclimatar-se. A les 13 setmanes d'edat, les rates es van dividir en 2 grups: el grup control (n=5) i el grup ERC induït per adenina (n=18). El grup control va rebre la dieta control P durant 6 setmanes. . El grup de CKD induït per adenina va rebre la dieta d'adenina durant unes 3 setmanes i després es va dividir en 2 subgrups: el grup CKD-LP (n=8) o el grup CKDHP (n=10). Les rates del grup CKD-LP i del grup CKD-HP van rebre la dieta LP i la dieta HP durant 3 setmanes, respectivament, durant el període experimental, la ingesta d'aliments es va registrar diàriament. Durant la dieta d'adenina, es van recollir mostres de sang de la vena de la cua entre les 10:00 i les 11:00 del matí un cop per setmana fins a la segona setmana, i després una vegada cada 2 dies per controlar els nivells plasmàtics. Durant la dieta LP o la dieta HP, es van recollir mostres de sang un cop per setmana. Es van recollir mostres d'orina i es va registrar el volum d'orina una vegada a la setmana. Les rates es van sacrificar amb anestèsic mitjançant isoflurà (Wako Pure Chemical Industries. Osaka Japó) i laparotomies. Es van recollir mostres de sang de la vena cava inferior i de l'aorta toracoabdominal per a l'anàlisi.

Expressió de SLC37A2 a l'aorta.

Aproximadament un terç de l'aorta toracoabdominal recollida es va utilitzar per visualitzar la calcificació i realitzar la immunotinció. L'aorta es va incrustar en parafina i es van tallar seccions 4-um. Les seccions es van tenyir mitjançant un mètode Von Kossa per al kit de calci (Polysciences. Warrington, PA) segons les instruccions del fabricant. anàlisi d'immunotinció es va realitzar amb seccions en sèrie. Les seccions es van incubar amb anticossos SLC37A2 durant la nit a 4 graus i després es van tractar amb Histofine Simple Stain Rat MAX-POMULTI) (Nichirei Biosciences, Tòquio, Japó) durant 30 min a temperatura ambient. A continuació, es van tractar les seccions amb un kit de substrat DAB (Nichirei).

L'ARN total es va extreure de la resta de l'aorta toracoabdominal congelada. La PCR en temps real es va realitzar mitjançant l'ADNc sintetitzat. Les seqüències d'imprimació eren les següents: osteo-pontina de rata, 5ACCCATCTCAGAAGCAGAATC-3' i 5ATCCATGTGGTCATGGCTTTC-3' i; rata SLC37A2, 5-TAGTCCCAGCTTCGAGTACGG-3' i 5'-CTGATGGGCTTTCTTGGACATG{-3. Els nivells d'expressió d'ARNm d'osteopontina i SLC37A2 es van calcular després de la normalització amb GAPDH

Anàlisi estadística.

Les dades es presenten com a mitjana + SE. Les diferències entre grups es van analitzar mitjançant la prova t. En experiments AoSMC calcificats induïts per fosfats, es van analitzar les diferències mitjançant una anàlisi de variància unidireccional seguida del mètode de Dunnett. En els experiments del model CKD, les diferències es van analitzar mitjançant la prova K ruskal-Wallis seguida del mètode Steel-Dwass. Els coeficients de correlació (rs) es van determinar mitjançant la prova de rang de coeficients de correlació de Spearman. Per a totes les proves. valors p de dues cues<0.05 were considered statistically significant.