Estudi sobre la funció neuroendocrina-immune de Cistanche Deserticola i els seus productes de cocció al vapor de vi d'arròs en un model de rata induïda per glucocorticoides

Contacte: Audrey Hu Whatsapp/hp: 0086 13880143964 Correu electrònic:audrey.hu@wecistanche.com

Bonan Liu, Ji Shi, Zhe Li, Chao Zhang, Pengpeng Liu, Wei Yao i Tianzhu Jia

1 Escola de Farmàcia, Universitat de Medicina Tradicional Xinesa de Liaoning, Dalian 116600, Xina

2 El segon hospital de la Universitat Mèdica de Dalian, Dalian 116600, Xina

Resum

L'habitatge del desertHerba de Cistanchees va registrar per primera vegada al "Shen Nong Herbal Classic" i figura com la medicina a base d'herbes de primer nivell en aquesta publicació. /e Farmacopea xinesa registra que trossos de Cistanche deserticola(CD) i arròs al vaporCistanche deserticola(WCD) es pot utilitzar a la clínica com els principals tipus de decoccions. Després d'haver estat cuit al vapor amb vi d'arròs, es milloren els efectes antienvelliment i tonificants del ronyó-yang. En aquest estudi, hem detectat el contingut químic de Cistanche Deserticola i WCD i el mecanisme farmacològic de la deficiència de yang del ronyó vigoritzant en rates model. Apunta. El propòsit d'aquest estudi va ser examinar els efectes de Cistanche Deseticola i WCD sobre el neuroendocrí-funció immunede deficiència de yang renal en rates model amb sobredosi de glucocorticoides. Materials i mètodes. Es van seleccionar rates Sprague Dawley (SD). Les rates /e s'han injectat subcutàniament amb suspensió d'aigua de corticosterona per a les rates model amb sobredosi de glucocorticoides. Les rates de control positiu /e es van donar amb píndoles Jinkuishenqi i dosis altes, mitjanes i baixesCistanche Deserticola/ suspensions WCD (1,646 g/(kg dia), 5,48 g/(kg dia), 2,74 g/(kg dia) i 1,37 g/(kg dia), respectivament); als grups control en blanc (BC) i control model (MC) se'ls va donar el mateix volum d'aigua destil·lada que els del grup de fàrmacs durant 40 dies consecutius a una dosi d'1 ml/100 g. Després de l'última administració, es va recollir la sang de l'aorta abdominal i els nivells sèrics de T, CRH, ACTH, CORT, cortisol, IL-10, IL-6, IL{-2, TNF - i IFN-c es van mesurar. Es van calcular els índexs d'òrgans de la glàndula tim i la melsa. L'expressió /e de Bax, Bcl-2, caspasa-3, Fas i FasL a la glàndula suprarenal es va mesurar mitjançant immunohistoquímica. Es van observar canvis patològics a la glàndula tim i a la glàndula suprarenal mitjançant la tinció HE (×200). Els subconjunts de limfòcits T a la sang perifèrica es van detectar mitjançant citometria d'altres companys, i també es va mesurar l'expressió d'ARNm CaM als teixits de l'hipotàlem i la hipòfisi mitjançant RT-PCR. Resultats. En comparació amb el grup MC, els grups Cistanche Deserticola i WCD van mostrar augments en l'activitat, l'índex d'òrgans del tim i la melsa, els nivells sèrics de T, CRH, ACTH, CORT, cortisol, IL{20}} i IL. -10, la proporció de CD4 més /CD8 més i l'expressió de Bcl-2, caspasa{-3, Fas, FasL i CaM al teixit de la hipòfisi. /eCistanche Deserticolai els grups WCD també van mostrar reduccions en els nivells d'IL-6, TNF- i IFN-c al sèrum i l'expressió de l'ARNm CaM a l'hipotàlem. Conclusions. Cada dosi de Cistanche Deseticola i WCD podria contrarestar l'hormona sexual desregulada i els factors immunitaris en rates model amb sobredosi de glucocorticoides, millorant i restaurant l'eficàcia de les cèl·lules nervioses hipotalàmiques i millorant.funció immune.

Introducció

Cistanche deserticola, que s'anomena "ginseng del desert", és una medicina tradicional xinesa que s'ha utilitzat durant segles com a herba yang-tònica per vigoritzar el ronyó i enfortir el yang [1]. S'han registrat vuit espècies i una variació de Cistanches Herba a la Xina i només Cistanche deserticola YC Ma i Cistanche tubulosa (Schenk) Wight es registren a la Farmacopea Xinesa [2]. Els estudis farmacològics van demostrar que Cistanches Herba va mostrar neuroprotector [3], immunomodulador [4], cardioprotector [5], antifatiga [6], antiinflamatori [7], hepatoprotector [8], antioxidant [9], antibacterià [10], laxant. [11] i efectes antitumorals [12]. L'ampli espectre d'activitats biològiques reportades d'aquest gènere s'ha atribuït a la complexa i variada composició fitoquímica. Cistanche deserticola conté glicòsids feniletanoides, iridoides, polisacàrids [13], etc. El contingut de glucòsids feniletanoides és el més alt dels materials medicinals originals [14]. El processament de la matèria mèdica xinesa (CMM) és una tècnica farmacèutica tradicional per complir els diferents requisits per tractar, dispensar i fer preparacions segons la teoria de la medicina tradicional xinesa. Aquests productes processats s'anomenen peces de decocció, que s'utilitzen a les clíniques. Els objectius del processament són millorar l'eficàcia i/o reduir la toxicitat dels fàrmacs bruts. La farmacopea xinesa de 2015 va registrar que les rodanxes gruixudes de Cistanche (CD) i el Cistanche al vapor d'arròs (WCD) es podrien utilitzar com a peces de decocció a la clínica. El nostre grup d'investigació va demostrar que l'efecte laxant es va alleujar i que els efectes antienvelliment i estimulants del yang del ronyó es van millorar després que el Cistanche es cuit al vapor amb vi d'arròs [15].

La funció de l'eix hipotàlem-hipòfisi-glàndula suprarenal-timus (HPAT) està alterada en la síndrome de deficiència de ronyó-yang [16]. Els pacients amb deficiència de yang renal també tenen una disfunció immune extensa. La disfunció de l'eix HPA està estretament relacionada amb la immunodeficiència. La teoria de la xarxa neuroendocrina-immune (NEI) mostra que els sistemes immunitari i neuroendocrí comparteixen molts lligands i receptors [17], i l'hipotàlem es considera el pivot per enllaçar el neuroendocrí amb els sistemes immunitaris.

En aquest estudi, vam replicar la deficiència de ronyó-yang en rates models amb injecció de corticosteroides exògens i vam explorar el mecanisme de la deficiència de ronyó-yang en resposta a diferents productes processats de Cistanche deserticola des de la perspectiva de l'endocrí.funció immune.

Materials i mètodes

Materials i reactius.

Cistanche deserticolaes va recollir d'Alashan Neimenggu el 2019.5 i va ser identificat com a tiges carnoses seques de Cistanche deserticola YC Ma pel professor Yanjun Zhai (Escola de Farmàcia, Universitat de Medicina Tradicional Xinesa de Liaoning, Xina). Els exemplars de val es van conservar al Centre Tecnològic d'Enginyeria de Processament de Liaoning.

Els compostos estàndard d'un jugol es van comprar a Chengdu Pure Chem-Standard Co., Ltd. (Chengdu, Xina); El cistàsid F, l'echinacòsid, el cistànósid A i l'iso-acteòsid es van comprar a Must Company (Sichuan Xina); L'acteòsid es va comprar a Dalian Meilun Bio. Co., Ltd. (Dalian, Xina). L'acetonitril i el metanol de grau MS es van comprar a Merck KGaA (Darmstadt, Alemanya). L'àcid fòrmic de grau HPLC es va comprar a Merck KGaA (Darmstadt, Alemanya). El vi d'arròs es va comprar a Zhejiang Brand Tower Shaoxing Wine Co., Ltd. (Zhejiang, Xina).

Corticosterona (CAS: 50-22-6, puresa > 98 per cent, TCI Shanghai Development Ltd. Co.), pastilles de chinkuei shin chewan (Beijing Tongrentang Technology Development Co., Ltd.), rata ACTH, CRH, T, IL{{ Els kits de detecció ELISA 2}}, IFN-c, TNF-, IL-2 i IL-10 es van comprar a Nanjing Jian cheng Co., Ltd. /e El kit ELISA de cortisol de rata va ser proporcionat per BOSK Co. ., anticòs CD4 de rata, anticòs CD8a (núms. 561833 i 559976), lisat de RBC (Solarbio, R1010), solució tampó PBS (Solarbio, P1020-500), TRIzol (MAN0001271), CaM i -actina aigües amunt i Els primers aigües avall van ser proporcionats pel kit de transcripció inversa de Guangzhou Invitrogen Co. (núm. RR037A) i el kit de síntesi d'ADNc (núm. 10000068167) va ser proporcionat per Bole Life Medicine Products (Shanghai) Co., Ltd. Cloroform, isopropanol, etanol al 75 per cent, i la solució d'uretà eren totes analíticament pures i produïdes per Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd. L'aigua ultrapura va ser produïda pel sistema Milli-Q (18,2 MΩ, Millipore, MA, EUA).

Instruments experimentals

Un marcador d'enzims (Thermo, model 3530911931), rentadora automàtica de plaques (model HBS- 4009), mesurador de força d'empunyeu i tracció de pantalla digital (model VICTOR- 50N), centrífuga de congelació d'alta velocitat (model Sigma 3k15). ), ultra microespectrofotòmetre (model B-50Q), amplificador de gens (model L96G), PCR quantitativa de fluorescència en temps real (model StepOne), citòmetre de flux (model AC66051710132), micròtom de parafina (model Laika), microscopi (Olympus). , model BS-53) i un instrument d'aigua pura (model F7JA36507).

Preparació de mostres per a UPLC-Q-TOF-MS i experiments farmacològics.

El WCD es va processar a partir del mateix lot de Cistanche deserticola al nostre laboratori. Per a la preparació de WCD, es van infusionar peces de CD secs (5 mm de gruix) (100 g) amb vi d'arròs (30 ml), es van cuinar al vapor a alta pressió (1,25 kPa) durant 4 h i després es van assecar a 55 graus.

Les pols gruixudes de CD i WCD es van remullar en etanol 1 0 vegades al 95 per cent durant 0,5 h, es van extreure a reflux 3 vegades cada vegada durant 1 h i es van filtrar i es van combinar els filtrats de 3 vegades. Es va recuperar /e etanol a pressió reduïda i es va obtenir l'extracte per a l'administració. /e extracte (1 ml) es va afegir al 50 per cent de metanol, portant el volum total a 20 ml, i es va emmagatzemar a 4 graus per a l'anàlisi del contingut.

Condicions UPLC-QqQ-MS per a l'anàlisi d'extractes de CD i WCD

Es va utilitzar el sistema UPLC-MS/MS amb el programari MassLynx 4.1 Analyst per realitzar l'adquisició i el processament de dades. La columna analítica /e era un Acquity UPLC BEH C18 (1{{10}}0 mm × 2,1 mm, 1,7 μm) a una temperatura de 40 graus C. /e la fase mòbil era 0, 1 per cent de solució aquosa d'àcid fòrmic (A) i acetonitril que contenia 0,1 per cent d'àcid fòrmic (B). El gradient d'elució /e va ser de 0,00–1,00 min amb un 3 per cent de B, 1,01–2,00 min amb un 3 per cent -11,5 per cent de B, 2,01–3.{{ 29}} min amb un 12 per cent de B, 3,01–4.00 min amb un 15 per cent de B, 4,01–5.00 min amb un 20 per cent de B, 5,01–6.00 min amb 22 per cent de B, 6,01–8.00 min amb un 25 per cent de B, i 8,01–9.{00 min amb un 10 per cent de B. /e el cabal era de 0,3 ml/min i el volum d'injecció era 1,0 μl.

Es va utilitzar l'espectròmetre de masses triple quàdruple Waters (Xevo TQD, Waters Corp., Milford, MA, EUA) equipat amb una font d'ionització per electrospray (ESI) en el mode d'ions negatius. /e el gas de desolvació era nitrogen amb un cabal de 500 L/h a una temperatura de 250 graus. Tots els compostos detectats es van mesurar en el mode de monitorització de reaccions múltiples (MRM); La taula 1 mostra els paràmetres d'energia, i la taula 2 mostra les corbes de calibratge dels components analitzats.

Preparació de substàncies de referència

Tubulòsid A (3,02 mg), equinacòsid (3,00 mg), 2′-acetilacteòsid (2,34 mg), acteòsid (2,45 mg), isoacteòsid (0,61 mg), cistanòsid F (2,14 mg), salidroside (3,39 mg), àcid genipòdic (2,84 mg), ajugol (1,58 mg) i catalpol (2,39 mg) es van dissoldre en metanol per preparar una solució de reserva. La solució stock /e es va diluir amb metanol per obtenir les concentracions adequades per a les solucions estàndard de treball. Totes les solucions preparades es van emmagatzemar a 4 graus abans del seu ús.

Preparació i Agrupació de Models Animals

Es van comprar rates mascles SD (180-220 g) a Liaoning Chang sheng Biotechnological Co., número de permís d'animals: SCXK (Liao) 2015-0001. Totes les rates es van mantenir amb accés lliure al menjar i l'aigua a 25 graus i una humitat relativa del 30 al 50 per cent. Els animals es van allotjar durant 7 dies abans dels experiments.

Cent rates es van dividir aleatòriament en 1{{30}} grups: grup control en blanc (BC), grup control model (MC), grup control positiu (PC), grup control vi d'arròs (WC), CD grup de dosis altes (CD-HD), grup de dosis mitjanes de CD (CD-MD), grup de dosis baixes de CD (CD-LD), grup de dosis altes de WCD (WCD-HD), grup de dosis mitjanes de WCD (WCD-MD) ), i el grup de dosis baixes de WCD (WCD-LD). Les dosis /e de CD-HD/WCD-HD, CD-MD/WCD-MD i CD-LD/WCD-LD van ser de 5,48 g/(kg ∙ d), 2,74 g/ (kg ∙ d) i 1,37 g /(kg ∙ d), respectivament. La dosi /e per al grup PC va ser d'1,646 g/(kg ∙ d) i per al grup WC, 1 mL/100 g durant 40 dies. /e 6è dia després de l'administració, les rates es van injectar per via subcutània amb la suspensió d'aigua de corticosterona (corticosterona més 0,1 per cent de dimetilsulfòxid més 0,1 per cent de Tween-80 més 0,9 per cent de sodi clorur) excepte el grup BC [18]. La concentració /e de corticosterona era de 5 g/L i la dosi era de 0,1 ml/100 g. A les rates /e del grup BC se'ls va donar solució salina normal més un 0,1 per cent de sulfòxid de dimetil més un 0,1 per cent de Tween- 80 més un 0,9 per cent de clorur de sodi per injecció a la mateixa dosi.

Determinació de les funcions de l'eix HPA

Prova de pes, temperatura i potència de retenció:Es va realitzar una prova de pes cada 3 dies i es va prendre la temperatura cada 6 dies. durant l'experiment. El dia 39, la força màxima de l'extremitat posterior es va mesurar amb un mesurador d'adherència. Les rates es van col·locar en plataformes llises, fent que la seva extremitat posterior agafi el pal. Les rates /e agafaran instintivament qualsevol objecte per evitar que es mogui cap enrere quan s'estira la cua fins que la força de tracció superi l'adherència. Quan la rata va perdre l'adherència, el preamplificador podria registrar automàticament la força màxima d'adherència.

Determinació del nivell de T, CRH, ACTH, CORT i cortisol en sèrum: una hora després de l'última administració, les rates van ser anestesiades mitjançant injecció intraperitoneal d'una solució d'uretà (20 g/100 ml). /ca, es van recollir mostres de sang, es van centrifugar a 3500 r durant 15 min per obtenir el sèrum i es van emmagatzemar a -20 graus. Les concentracions de T, CRH, ACTH, CORT i cortisol es van mesurar amb kits ELISA de rata segons les instruccions del fabricant.

Observacions al microscopi: es va observar l'estructura morfològica del teixit de la glàndula suprarenal mitjançant una tinció HE. El teixit suprarenal es va fixar en paraformaldehid al 10 per cent, es va deshidratar en etanol, es va fer transparent amb una solució de xilè, incrustat per mètodes convencionals, es va tallar a rodanxes de 4 μm de gruix, es va desparafinar amb solució de xilè, es va hidratar amb el gradient d'etanol i després es va tenyir amb hematoxilina i eosina. solució de tinció. Després de fer-se transparent amb xilè, la placa es va segellar amb goma neutra i es va observar al microscopi.

Tinció immunohistoquímica de l'expressió de proteïnes Bax, Bcl-2, caspasa{-3, Fas i FasL a la glàndula suprarenal

Les seccions suprarenals de rata fixades amb formalina i incrustades en parafina es van desparafinar i es van rehidratar després de tallar-les amb un gruix de 4 μm. Per al bloqueig de l'activitat de la peroxidasa endògena, les seccions es van preincubar en un bloc de peròxid d'hidrogen durant 1 0 min. Les seccions es van submergir en citrat 0,01 M (pH 6,0) i es van escalfar fins a ebullició. El procés /e es va repetir després de 5-10 min. Després de refredar-se, les seccions es van rentar amb PBS (pH 7,2-7,6) 1-2 vegades, es van deixar a temperatura ambient durant aproximadament 5 minuts i es van rentar amb PBS (pH 7,2-7,6) 2-3 vegades. /e Es va afegir una solució de bloqueig de BSA al 5 per cent a temperatura ambient i l'excés de líquid de la secció es va treure 20 minuts més tard. Es van afegir anticossos primaris diluïts específics per Fas/FasL, Bcl-2/Bax i caspasa{-3 (1:100 diluït amb PBS) i es van incubar a 37 graus durant 1 hora o 4 graus durant la nit. Les seccions /e es van rentar 2-3 vegades amb PBS (pH 7,2-7,6). / ca, es va afegir IgG anti-ratolí de cabra biotinilada i les seccions es van assecar a 20-37 graus durant 20 min i es van rentar amb PBS (pH 7,2-7,6) 4 vegades durant 5 min. Després d'un rentat a fons en PBS, les seccions es van incubar amb una barreja de reactius A i B durant 30 min, es van incubar amb PBS durant 45 min i, finalment, es van desenvolupar amb substrat DAB (DAKO) durant 30 min abans de ser lleugerament contrastades amb hematoxilina, deshidratades, i muntat.

Determinació de les funcions immunitàries

Càlcul de l'índex d'òrgans immunitaris:Una hora després de l'última administració, les rates van ser anestesiades mitjançant una injecció intraperitoneal de solució d'uretà (20 g/100 ml), i després es va retirar la melsa i la glàndula tim i es van pesar immediatament en una caputxa estèril. Els coeficients de pes de la melsa o del tim (per cent) de la melsa o el pes del tim (mg)/pes corporal (g).

Resultats experimentals

UPLC-QqQ-MSAnalysis:Per aconseguir la millor separació, la forma del pic i un temps d'anàlisi curt, en el nostre experiment preliminar es van estudiar les condicions cromatogràfiques, inclosa la columna, la fase mòbil i el programa de gradient. /e cromatogrames típics amb mode MRM es presenten a la figura.A la taula 4, vam poder veure que el contingut de glicòsids de feniletanol a la WCD va augmentar en comparació amb els de la CD, especialment per a l'equinacòsid i l'acteòsid, mentre que el contingut d'iridoides es va reduir a la WCD.

Regulació per a la funció de l'eix HPA: les rates del grup MC i dels grups experimentals van mostrar símptomes de deficiència renal-yang gradualment després de rebre corticosterona. Els símptomes /e, com ara pèrdua de pes, hipotèrmia, pèrdua de brillantor del cabell, esperit caigut, retard en la resposta, la disminució significativa del consum d'aigua i l'activitat, van millorar molt en els grups CD i WCD. La figura 2(a) mostra els canvis de pes. El pes /e de cadascun dels grups de drogues va augmentar, especialment en els grups CD-HD i WCD-HD. L'augment de pes en el grup MC va ser el més baix. La figura 2 (b) mostra els canvis de temperatura, que va ser el més baix del grup MC, i la temperatura va augmentar als grups WCD-HD, WCD-MD i WCD-LD.

Nivells de T, CRH, ACTH, CORT i cortisol: la figura 3 mostra que, en comparació amb els del grup BC, el nivell de T, CRH, ACTH i CORT al sèrum de rata va disminuir (P <0. 01)="" i="" el="" nivell="" de="" cortisol="" va="" disminuir="" (p=""><0.05) al="" grup="" mc.="" en="" comparació="" amb="" els="" del="" grup="" mc,="" el="" nivell="" de="" t="" en="" els="" grups="" wcd-hd="" i="" wcd-md="" va="" augmentar="" (p=""><0.{01), el="" nivell="" de="" crh="" en="" el="" wcd-ld,="" els="" grups="" wcd-md="" i="" wc="" van="" millorar="" (p=""><0,01), el="" contingut="" d'acth="" va="" augmentar="" als="" grups="" cd-hd,="" wcd-md="" i="" wcd-hd="" (p=""><0,01), el="" nivell="" de="" cort="" es="" va="" millorar="" a="" els="" grups="" cd-md,="" wcd-md="" i="" wcd-hd="" (p=""><0,01) i="" millorat="" en="" els="" grups="" cd="" hd="" i="" wcd-ld="" (p=""><0,05), i="" el="" nivell="" de="" cortisol="" va="" augmentar="" en="" cadascun="" dels="" grups="" de="">

Resultats de l'observació al microscopi: el teixit de la glàndula suprarenal es pot dividir en la capa cortical i la capa medul·lar. Les capes corticals inclouen capes globulars, feixos i reticulars. Les cèl·lules contenen més lípids i la capa medul·lar està formada principalment per cèl·lules de feocromocitoma i una petita quantitat de teixit fibrós. Com es mostra a la figura 4, vam trobar que tot era normal al grup BC, mentre que al grup MC, l'escorça suprarenal tenia una hiperplàsia evident, atròfia cel·lular i una densitat creixent. La franja bulbosa es va engrossir i la zona fascicular translúcida, la zona reticular estreta i les cèl·lules més petites van mostrar un color desigual i una congestió capil·lar. Al grup de PC, els límits corticals i medul·lars eren visibles. Les cèl·lules de les bandes globulars i del paquet estaven disposades uniformement i l'estructura morfològica s'havia restaurat. Es va observar la mateixa millor restauració en els grups WCD, i els efectes en el grup WCD-MD van ser millors que els dels grups WCD-HD i WCD-LD. La morfologia de la glàndula suprarenal en els grups CD no era tan bona com la dels grups WCD.

Immunohistoquímica: l'apoptosi neuronal està controlada per molts gens apoptòtics i antiapoptòtics, principalment el gen promotor de l'apoptosi Bax i els gens antiapoptòtics de la família de gens Bcl-2. Bcl-2 es localitza en orgànuls reactius productors d'oxigen com els mitocondris, el reticle endoplasmàtic i les membranes nuclears. Bcl-2 té poc impacte sobre els radicals lliures d'oxigen, però pot prevenir el dany oxidatiu a les cèl·lules. Bax es transporta des del citoplasma a la membrana mitocondrial, canvia l'estructura de la membrana mitocondrial i afavoreix l'alliberament del citocrom c i la inducció de l'apoptosi.

Hi havia una expressió al citoplasma suprarenal de la proteïna Bax i Bcl{{0}}. La tinció /e va mostrar totes les partícules grogues. En comparació amb la del grup BC, la densitat òptica mitjana de la proteïna Bax al grup MC va augmentar significativament (P <0.01). en="" comparació="" amb="" la="" del="" grup="" mc,="" la="" densitat="" òptica="" mitjana="" dels="" grups="" cd-ld="" i="" wcd-ld="" va="" disminuir="" significativament="" (p=""><0, 01)="" (figura="" 5="">Els resultats van demostrar que la CD i la WCD podrien induir l'apoptosi a les cèl·lules inflamatòries i reduir el dany suprarenal mitjançant la promoció de l'expressió de la proteïna FasL i la unió a la proteïna Fas, activant la proteïna caspasa-3 i desencadenant una cascada de caspases. L'efecte del grup WCD-HD va ser el millor.

Determinació de la funció immune

Índex d'òrgans immunitaris

En comparació amb els del grup BC, el coeficient del tim i l'índex de melsa del grup MC van disminuir significativament (P <{{0}}.01). en="" comparació="" amb="" el="" grup="" mc,="" el="" grup="" wcd-md="" va="" tenir="" la="" diferència="" més="" gran="" (p=""><0, 05).="" el="" coeficient="" de="" timus="" gairebé="" tornava="" al="" nivell="" normal.="" per="" a="" l'índex="" de="" melsa,="" els="" grups="" wcd="" md,="" wcd-ld="" i="" cd-md="" van="" mostrar="" diferències="" significatives="" en="" comparació="" amb="" el="" del="" grup="" mc="" (p=""><0, 01)="" (vegeu="" la="" figura="" 6).="" per="" tant,="" el="" tractament="" amb="" wcd="" i="" cd="" podria="" protegir="" els="" òrgans="" immunitaris="" i="" els="" efectes="" de="" wcd="" eren="">

Detecció de subconjunts de limfòcits T en sang perifèrica

El percentatge de cèl·lules CD4 plus al quadrant superior esquerre i de cèl·lules CD8 més al quadrant inferior dret a la BC i a cada grup de fàrmacs va ser superior al del grup MC. En comparació amb la del grup BC, la proporció de CD4 més /CD8 més va disminuir significativament en el grup MC (P <0.01). en="" comparació="" amb="" la="" del="" grup="" mc,="" la="" proporció="" de="" cd4="" plus="" d8="" plus="" va="" augmentar="" significativament="" en="" el="" grup="" pc,="" el="" grup="" wcd="" i="" el="" grup="" cd-hd="" (p=""><0,01) (figura="" 7).="" determinació="" del="" nivell="" d'il{="" {12}},="" il-6,="" il-2,="" tnf-="" i="" ifn-c="" al="">

La figura 8 mostra que, en comparació amb el del grup BC, el nivell d'IL-6, TNF- i IFN-c va augmentar significativament (P <0.01). nivell="" d'il-10="" i="" il-2="" va="" disminuir="" al="" grup="" mc.="" en="" comparació="" amb="" el="" del="" grup="" mc,="" el="" nivell="" d'il-6,="" tnf-="" i="" ifn-c="" va="" disminuir="" i="" il-10="" i="" il{-2="" van="" augmentar="" en="" sèrum="" en="" cadascun="" dels="" grups="" de="" fàrmacs.="" l'efecte="" de="" wcd="" va="" ser="" millor="" que="" l'efecte="" de="" cd,="" especialment="" en="" el="" grup="" wcd-md,="" en="" el="" qual="" l'efecte="" era="" proper="" al="" del="" grup="">

Resultats de l'experiment d'observació del microscopi del teixit del timus

La figura 9 mostra que al grup BC hi havia un gran nombre de limfòcits. Els limfòcits i els reticulòcits estaven disposats de manera fluixa al centre amb timòcits rodons o ovals dispersos. No hi havia necrosi, ni infiltració de cèl·lules inflamatòries ni canvis anormals.

El grup MC va mostrar una gran quantitat de teixit de necrosi limfoide, amb una disposició desordenada de limfòcits i reticulòcits al centre. Van desaparèixer els timòcits rodons o ovalats, es va evidenciar una degeneració cel·lular massiva o necrosi i hi va haver infiltració cel·lular inflamatòria amb canvis patològics anormals.

En els grups de CD, les característiques morfològiques dels limfòcits havien tornat a la normalitat, i la disposició dels limfòcits centrals i dels reticulòcits era gairebé normal. Els timòcits rodons o ovalats s'havien recuperat, però quedaven un petit nombre de limfòcits degeneratius o necròtics i cèl·lules inflamatòries infiltrades.

En els grups WCD i el grup PC, les característiques morfològiques dels limfòcits es van reparar millor. Els limfòcits i els reticulòcits del centre estaven ben alineats, els timòcits rodons o ovals eren gairebé normals, però quedava un petit nombre de limfòcits infiltrants i degeneratius.

Expressió del gen de la proteïna CaM

Es va considerar el valor RQ (ARNm CaM/ARNm -actina) per examinar l'expressió de l'ARNm CaM. El RQ del grup BC va ser 1. L'expressió de l'ARNm CaM a l'hipotàlem del grup MC va augmentar significativament (P <0.01), mentre="" que="" el="" valor="" va="" disminuir="" en="" el="" wcd-hd,="" grups="" wcd-md,="" wcd="" ld="" i="" cd-hd="" (p=""><{{10}},05) (figura="" 10).="" l'expressió="" de="" l'arnm="" cam="" a="" la="" hipòfisi="" del="" grup="" mc="" va="" ser="" inferior="" a="" la="" del="" grup="" bc="" (p=""><0, 01).="" l'expressió="" als="" grups="" wcd-hd,="" wcd-md,="" wcd-ld,="" cd-hd="" i="" cd-ld="" va="" augmentar="" (p=""><0, 05)="" i="" l'efecte="" als="" grups="" wcd="" va="" ser="" millor="" que="" l'efecte="" als="" grups="">

Discussió

La Farmacopea Xinesa [2] registra que el CD i el WCD es poden utilitzar a la clínica com els principals tipus de peces de decocció. Després de ser cuit al vapor amb vi d'arròs, es van potenciar els efectes antienvelliment i tonificants del ronyó-yang. Mitjançant UPLC-QqQ-MS, vam detectar els canvis quantitatius en la base del material químic durant el procés de cocció al vapor del vi d'arròs. Els glucòsids iridoides eren inestables i el contingut d'aquests glucòsids va disminuir, fins i tot esdevenint indetectables. El contingut de glicòsids de feniletanol també va canviar, cosa que podria induir canvis en la farmacodinàmica i l'efecte clínic.

El model clàssic de deficiència de ronyó-yang es va replicar mitjançant la injecció subcutània de corticosterona [19]. La sobredosi de corticosterona podria inhibir el secret de CRH a l'hipotàlem. Mentrestant, el secret de l'ACTH també es va inhibir. /e el nivell d'hormona de l'escorça suprarenal va disminuir i, per tant, es va reduir la funció de l'eix HPA. La hipofunció de l'eix HPA és una característica comuna de la deficiència del ronyó-yang [20]. Aleshores, les rates mostren fenòmens de "esgotament" i els símptomes estan d'acord amb els de la deficiència de ronyó-yang a la clínica.

Al grup MC, el nivell de CRH, ACTH, T i CORT en sèrum de rata va disminuir significativament (P <{0}}.01). després="" de="" ser="" tractats="" per="" cd="" i="" wcd,="" el="" contingut="" de="" crh,="" acth,="" t,="" cort="" i="" cortisol="" va="" augmentar="" fins="" a="" cert="" punt,="" i="" l'efecte="" de="" wcd-md="" va="" ser="" el="" millor,="" gairebé="" igual="" al="" del="" grup="" de="" pc.="" aquests="" resultats="" van="" indicar="" que="" l'equilibri="" hormonal="" relatiu="" a="" l'eix="" hpa="" s'havia="" destruït="" al="" grup="" mc,="" cd="" i="" wcd="" podrien="" millorar="" la="" recuperació="" funcional="" dels="" nivells="" hormonals="" anormals="" de="" l'eix="" suprarenal,="" però="" l'efecte="" de="" wcd="" va="" ser="">

La modulació de la proporció de membres de la família Bcl{{0}} és un dels mecanismes bàsics pels quals Fas/FasL media la via del receptor de la mort, i la família Bcl{-2 regula la via mitocondrial [21]. El factor inhibidor de l'apoptosi Bcl-2 i els factors inductors de l'apoptosi, com Bax, pertanyen tots a la família Bcl-2 [22]. L'apoptosi cel·lular es pot determinar per la relació relativa de factors inhibidors de l'apoptosi i factors que indueixen l'apoptosi [23]. Els mitocondris tenien la funció de punts de control centrals per a moltes formes d'apoptosi [24]. El present estudi va demostrar que CD-MD i WCD podrien deduir l'expressió de Bax i augmentar Bcl-2 per millorar la deficiència de yang renal. Fas és el principal receptor de mort que indueix l'apoptosi per lligament amb el lligand Fas (FasL) [25]. L'expressió de Fas i FasL al grup MC va augmentar, mentre que aquesta expressió va augmentar significativament al grup WCD-MD (P <0.01) en="" comparació="" amb="" el="" grup="" mc.="" tant="" els="" sistemes="" fas/fasl="" com="" bax/bcl-2="" transdueixen="" els="" senyals="" apoptòtics="" a="" la="" família="" de="" les="" caspases="" [26].="" la="" caspasa-3="" és="" una="" de="" les="" proteïnases="" fonamentals="" que="" inicien="" l'apoptosi="" cel·lular.="" l'activació="" de="" la="" caspasa-3="" indica="" que="" l'apoptosi="" entra="" en="" una="" etapa="" irreversible="" [27].="" l'expressió="" de="" caspasa="" -3="" al="" grup="" mc="" va="" augmentar="" i="" augmentar="" significativament="" en="" els="" grups="" wcd-hd="" i="" wcd-md="" (p=""><0,>

Deficiència defunció immuneés una de les manifestacions importants de la deficiència del ronyó-yang [28]. En aquest estudi, vam trobar que l'índex de la melsa i el tim del grup WCD-MD es va recuperar significativament (P <0.01, p=""><0.{{3{{101} {32}}}}5).="" la="" resposta="" immune="" del="" sistema="" immunitari="" està="" regulada="" principalment="" pels="" subgrups="" [29].="" il-2="" és="" el="" factor="" de="" creixement="" de="" les="" cèl·lules="" t,="" secretada="" per="" cèl·lules="" t="" i="" macròfags,="" participa="" en="" la="" regulació="" inflamatòria,="" regula="" la="" immunitat="" i="" augmenta="" la="" resistència="" a="" la="" infecció="" [30].="" nivell="" d'il-2="" al="" grup="" mc="" va="" disminuir="" (p=""><0, 01)="" i="" després="" del="" tractament="" amb="" cd="" i="" wcd,="" el="" nivell="" d'il-2="" es="" va="" recuperar.="" il-6="" i="" tnf-="" són="" citocines="" proinflamatòries.="" l'augment="" dels="" nivells="" de="" citocines="" il-6="" i="" tnf="" causen="" desequilibris="" de="" citocines="" i="" agreugen="" la="" inflamació.="" els="" nivells="" d'il-6="" i="" tnf-="" van="" augmentar="" al="" grup="" mc,="" mentre="" que="" després="" del="" tractament,="" els="" nivells="" d'il{-6="" i="" tnf-="" van="" disminuir.="" les="" cèl·lules="" t="" es="" divideixen="" en="" cèl·lules="" cd4="" i="" cèl·lules="" cd8,="" i="" la="" relació="" cd4="" plus/cd8="" plus="" es="" pot="" utilitzar="" com="" a="" índex="" important="" de="" regulació="" immune="" [31].="" òbviament,="" cd4="" plus="" cd8="" plus="" en="" el="" grup="" mc="" va="" disminuir="" (p=""><0,01), mentre="" que="" en="" els="" grups="" wcd="" i="" cd="" hd="" van="" augmentar="" (p=""><>

L'eix HPA és el sistema regulador més important perquè regula la secreció de glucocorticoides i el sistema endocrí per mantenir la funció secretora de l'escorça suprarenal [32]. La sobreexpressió de l'ARNm de CaM al teixit de l'hipotàlem es va relacionar amb la deficiència de yang renal. CD i WCD podrien bloquejar els canals de calci, inhibir l'expressió d'ARNm de CaM a l'hipotàlem i disminuir l'afluència de calci, disminuint així l'activitat del complex Ca2 més ·CaM.

La formació de la deficiència del ronyó-yang té un procés de desenvolupament de malalties cròniques. El ronyó ja no és un concepte purament anatòmic, i és un terme general per a la immunitat neuroendocrina i el sistema genitourinari. La xarxa neuroendocrina-immune (NEI) és un important sistema regulador integrat [33]. CD i WCD poden regular la funció de l'eix HPAT i millorar la recuperació de la deficiència de ronyó-yang. Aquest resultat proporciona la base experimental per a la prevenció clínica i el tractament de la deficiència renal-yang.

Referències

[1] Y. Zhang, H. Wu i SN Wang, "Comparació sobre les funcions d'enfortiment del ronyó i el yang de tres espècies diferents d'Herba Cistanches", Xina J Chin Mater Med, vol. 19, núm. 3, pàgines 169–171, 1994.

[2] Comissió de Farmacopea Xinesa, Pharmacopoeia of People's Republic of China: One Edition, China Medical Science Press, Beijing, Xina, 2015.

[3] M. Zhu, C. Lu i W. Li, "L'exposició transitòria a l'echinacòsid és suficient per activar la senyalització TrK i protegir les cèl·lules neuronals de la rotenona", Journal of Neurochemistry, vol. 124, núm. 4, pàgines 571–580, 2013.

[4] LL Li, XW Wang, XF Wang, et al., "Glucòsids de Cistanche anti-peroxidació lipídica i efecte anti-radiació", Medicina tradicional xinesa, vol. 22, núm. 6, pàgs. 364–367, 1997.

[5] E. Preutthipan, CF Ng, CM Koon, ECW Wong, B. Tomlinson i CBS Lau, "/e efecte protector de Herba Cistanches sobre la miotoxicitat induïda per estatines in vitro", Journal of Ethnopharmacology, vol. 190, pàgs. 68–73, 2016.

[6] HS Wong, J. Chen, PK Leong, HY Leung, WM Chan i KM Ko, "Herba redueix l'augment de pes en ratolins obesos induïts per dieta alta en greixos possiblement a través del desacoblament mitocondrial", Journal of Functional Foods, vol. 10, pàgines 292–304, 2014.

[7] Y. Jia, Q. Guan, Y. Jiang, et al., "Millora de la colitis induïda per sulfat de dextrano en ratolins per extracte enriquit amb equinacòsid de Cistanche tubulosa", Phytotherapy Research, vol. 28, núm. 1, pàgines 110–119, 2014.

[8] Y. Leung, L. Li, T. Wen i Y.-Q. Li, "Efectes protectors de l'equinacòsid sobre l'hepatotoxicitat induïda per tetraclorur de carboni en rates", Toxicologia, vol. 232, núm. 1-2, pàgines 50–56, 2007.

[9] JH Yang, JP Hu i NS Du, "Relacions estructura-activitat dels glucòsids feniletanoides en plantes de salsa Cistanche sobre activitat antioxidant", Journal of Chinese Medicine, vol. 32, núm. 7, pàgines 1067–1069, 2009.

[10] XQ Han i YP Zhu, "Procés d'extracció de polisacàrids de Cistanche i investigació d'acció bacteriostàtica", J Anhui Agric Sci, vol. 37, núm. 32, pàg. 15855-15856, 2009.

[11] PF Tu, ZG Zhang i ZQ Lou, "Anàlisi de glicòsids feniletanoides de Cistanche per RP-HPLC", Acta Pharm Sin, vol. 32, núm. 4, pàgines 294–300, 1997.