Wen-Lan Li, Jing-Xin Ding, Jing Bai, Yang Hu, Hui Song, Xiang-Ming Sun, Yu-Bin Ji

Per a més informació poseu-vos en contacte amb:Joanna.jia@wecistanche.com

Resum

La tecnologia LC és un mètode reconegut que s'utilitza a tot el món per avaluar la qualitat de les medicines tradicionals xineses (TCM). La qualitat de la MTC té un impacte directe en la seva eficàcia. Per tant, per revelar a fons com la TCM exerceix la seva eficàcia, en primer lloc, cal entendre la base material de la seva eficàcia i després controlar la qualitat dels compostos actius. L'aplicació del mètode de relació espectre-efecte és crucial per determinar la base del material farmacològic. L'objectiu d'aquest article era investigar les correlacions subjacents entre els perfils químics i l'activitat estrogènica deCistanche, per revelar els compostos actius. Els perfils químics deCistanchees van registrar mitjançant HPLC/Q-TOF-MS/MS, i l'activitat estrogènica es va determinar mitjançant la prova de creixement de l'úter i l'assaig MTT. A continuació, combinant els resultats de l'anàlisi bivariant, l'anàlisi de components principals i el mètode d'anàlisi de correlació de grisos, es van identificar quinze compostos actius. Són 8-àcid epilogànic, salidroside, siringalida A 3'{- -l-ramnopiranòsid, cistàsid A, equinacòsid, cistàsid F, cistàsid B, cistàsid C, osmantuside B, acteòsid, isoacteòsid, tubulòsid B, 2 '-acetilacteòsid, i dos compostos desconeguts. Aquest estudi posa les bases per a estudis in vivo deCistanche, i per al desenvolupament de la seva aplicació clínica.

Cistanchetubulosa

Paraules clau:Cistanchedeserticola; LC/Q-TOF-MS; activitat estrogènica; anàlisi de components principals (PCA); Prova de creixement de l'úter.

Abreviatures

MTC: Medicina Tradicional Xinesa

HPLC/Q-TOF-MS: cromatografia líquida d'alt rendiment/espectrometria de masses en temps de vol quadrupol

BA: anàlisi bivariada

PCA: anàlisi de components principals

GCAM: mètode d'anàlisi de correlació de grisos

MTT: Tripsina, 3-(4, 5-Dimetiltiazol-2-il)-2, 5-difeniltetrazolibromur

DMSO: sulfòxid de dimetil

RPMI1640 Roswell Park Memorial Institute 1640

1. Introducció

Recentment, la TCM s'ha tornat cada cop més popular als països asiàtics i occidentals a causa dels seus efectes terapèutics estables i la seva baixa toxicitat a la clínica. Com a resultat, és necessari desenvolupar nous tipus de MTC i entendre les composicions efectives utilitzades durant la seva aplicació clínica [1-6].

En primer lloc, s'estudia la relació espectre-efecte per discernir la correlació entre l'empremta cromatogràfica i l'eficàcia de la farmacodinàmica. A continuació, s'utilitza la relació per buscar components efectius en TCM i per formular estàndards de control que reflecteixin la seva qualitat interna. La relació espectre-efecte s'ha aplicat en moltes àrees de la investigació de la MTC, com ara la base material de la MTC única i composta, la compatibilitat de components, el mecanisme de processament, la previsió d'efectes farmacològics i l'optimització de la tecnologia [7-12]. La relació espectre-efecte s'utilitza per presentar noves idees i mètodes per explorar substàncies actives, optimitzar fórmules, millorar els processos de preparació, fer el seguiment i separar els ingredients objectiu i per al desenvolupament de nous fàrmacs de TCM [13-17].

Cistanches'ha utilitzat àmpliament per al tractament de la disfunció sexual, el restrenyiment, la prostatitis i la deficiència renal. Té un ampli espectre de bioactivitats que inclou efectes estrogènics, anti-envelliment, antioxidants i acció immune [18-19]. En general, els glicòsids feniletanoides (com el cistanòsid A, el tubulósid A), els lignans i els glicòsids iridoides es van considerar com a constituents farmacològics i marcadors químics per al control de qualitat de Cistanche i els seus productes [20-21]. Els espectres químics de Cistanche de diferents àrees es van registrar mitjançant cromatografia líquida d'alt rendiment (HPLC) [22-23]. En aquest estudi, seleccionem la prova de creixement de l'úter i l'assaig de proliferació cel·lular MCF7 per avaluar les seves activitats estrogèniques. Es van utilitzar mètodes d'anàlisi de components principals, anàlisi bivariada i anàlisi de correlació grisa per correlacionar l'activitat estrogènica amb els components individuals. Aquest estudi tenia com a objectiu identificar els compostos bioactius de Cistanche responsables dels efectes estrogènics in vivo. L'estudi posa les bases per a estudis en profunditat de Cistanche.

Tots els procediments experimentals van ser revisats i aprovats pel Comitè Ètic Animal de la Universitat de Comerç de Harbin.

Cistanchedeserticola (cd-20120227-005) va ser comprat al mercat de drogues i identificat pel professor Zhang Delian (Harbin University of Commerce). El dietilstilbestrol es va comprar a HEFEI JIULIAN PHARMACEUTICAL CO., LTD. RPMI1640 i RPMI1640 sense vermell de fenol es van comprar a HyClone Company (EUA). MTT i DMSO es van comprar a Sigma-Aldrich Co. LLC (St Louis, EUA). La línia cel·lular MCF7 del càncer de mama humà va ser proporcionada pel Centre de Recerca de Ciències de la Vida i Ciències Ambientals (Harbin University of Commerce). Els estàndards utilitzats van ser els següents: acteòsid (111530- 200505), equinacòsid (111670-200503) i salidroside (110736-200628) es van obtenir de l'Institut Nacional de Control de Productes Farmacèutics i Biològics (Beijing). , Xina). L'acetonitril, el metanol i l'àcid fòrmic eren de grau MS, mentre que l'aigua era ultrapura. Altres reactius eren de grau analític i estaven disponibles comercialment.

2 Procediment experimental

2.1 Materials

El sistema HPLC Agilent 1290, el sistema LC/MS (Q-TOF) de temps de vol quadrupol Agilent 6530 i les estacions de treball HPLC-3D químiques es van utilitzar per a experiments de química analítica i processament de dades. Es va utilitzar aigua ultrapura Milli-Q per a la preparació de mostres i estàndards. Els instruments addicionals inclouen la balança analítica electrònica AR1140 (Ohaus International Ltd), el lector de microplaques 680 (Bio-Rad Corporation) i la centrífuga d'alta velocitat 64R (Beckman Coulter Allegra).

Els ratolins Kunming femelles immadurs (uns 21 d de naixement, deslletats) que pesen (12 ± 2) g, es van comprar al Centre d'Animals del Laboratori de la Base Nacional de la Indústria Biològica de Changchun (Changchun, Xina). Els ratolins es van allotjar en una habitació amb temperatura regulada (22 ± 2 graus) amb accés sense restriccions al menjar i l'aigua. L'experimentació amb animals es va iniciar després de cinc dies d'aclimatació. Els ratolins es van dejunar durant la nit amb accés lliure a l'aigua abans d'administrar les solucions de prova. Aquest estudi es va dur a terme d'acord amb les recomanacions de la Guia per a la cura i l'ús d'animals de laboratori dels Instituts Nacionals de Salut.

2.2 Preparació de la solució mostra

Cistanchees van recollir mostres de deu hàbitats diversos, a saber, Neimeng, Xinjiang, Ningxia, Guizhou, Chaidamu, Xizang, Alashan, Qinghai, Sichuan i la província de Hubei.

La solució (1,0 g/mL) de laCistancheLa mostra es va preparar en aigua destil·lada per a l'administració oral. La concentració de dietilstilboestrol era de 20ug/ml i es va utilitzar com a solució de control positiu. La solució (1,0 g/mL) de la mostra de Cistanche es va preparar en un 50 per cent d'acetonitril. Acteòsid, echinacòsid i salidroside (2, 0 mg cadascun) es van dissoldre en 10 ml de solució d'acetonitril al 50%. Tant la mostra com les solucions estàndard es van filtrar amb un filtre de 0,45-μm abans de l'anàlisi.

2.3 Condicions LC-MS

Es va utilitzar un Waters Symmetry Shield RP18 (3,9 mm × 150 mm, 5μm; Waters Corporation, Milford, MA, EUA) per analitzar les mostres. La fase mòbil constava d'acetonitril (A) i una solució aquosa d'àcid fòrmic 0,2 per cent (v/v) (B) i es va bombejar a un cabal de 0,5 ml/min. El volum d'injecció de cada mostra era de 10 μL. El programa d'elució del gradient va ser el següent: la fase mòbil A es va iniciar al 5 per cent i es va augmentar linealment fins al 23 per cent als 35 min. La solució A es va augmentar posteriorment al 25 per cent (35 a 65 min). Aleshores, la fase mòbil A es va reduir al 5 per cent durant els últims 5 min de la carrera (65 a 70 min). La temperatura de la columna es va mantenir a 30 graus. Els cromatogrames es van controlar a 254 nm. La pressió del gas d'atomització era de 30 psi i la tensió capil·lar era de 3,5 kV. El cabal del gas sec es va establir a 8 L/min amb una temperatura de 30 graus. Els espectres de masses es van registrar dins del rang d'exploració de 100- 3,000 Da i estaven en mode d'exploració d'ions negatius.

2.4 Avaluació de l'empremta digital

Les empremtes dactilars LC de les mostres recollides de 10 lots diferents es van establir i emparellar automàticament mitjançant el Sistema d'avaluació de semblança per a l'empremta cromatogràfica de TCM (versió 2012; Comitè de Farmacopea de la Xina, Pequín, Xina). A més, el mapa del cromatograma de referència es va generar mitjançant el mètode de la mitjana. A més, es va aplicar l'anàlisi de clústers per avaluar la qualitat de les mostres de deu hàbitats diversos.

2.5 Anàlisi de components principals (PCA)

La PCA és un mètode estadístic multivariant. Pot retenir informació suficient de l'adquisició de dades. En el present estudi, PCA va examinar més els pics característics dels cromatogrames LC i tenia com a objectiu identificar compostos actius basats en la relació espectre-efecte.

2.6 Prova de creixement de l'úter

Els ratolins es van dividir en 12 grups (10 per grup). Les solucions de mostra que es van preparar a partir de Cistanche es van recollir de deu hàbitats diversos i es van administrar dues vegades al dia (matí i vespre) per sonda a una dosi de 30 g/kg de pes corporal durant quatre dies. Els grups de control en blanc i positiu comprenien volums iguals d'aigua destil·lada i solució de dietilstilboestrol i es van administrar dues vegades al dia durant quatre dies. El cinquè dia, les mostres de sang que contenien fàrmacs es van retirar dels ratolins anestesiats. Les mostres es van centrifugar (5, 000 rpm, 10 min) i es van separar els sobrenedants (mostres de sèrum que contenien fàrmacs). Les mostres de sèrum que contenen fàrmacs es van inactivar escalfant-se a 56 graus en un bany maria durant 30 min i es van filtrar a través d'un filtre de 0,22-μm abans de l'assaig MTT. Paral·lelament, els úters dels ratolins es van extirpar immediatament i es van pesar per calcular els índexs de pes uterí. L'experimentació amb animals es va iniciar després de cinc dies d'aclimatació. Els ratolins han dejunat durant la nit amb accés lliure a l'aigua abans de l'administració de les solucions de prova. El present estudi es va realitzar d'acord amb les recomanacions de la Guia per a la cura i l'ús d'animals de laboratori dels Instituts Nacionals de Salut. Tots els procediments experimentals van ser revisats i aprovats pel Comitè Ètic Animal de la Universitat de Comerç de Harbin. Tots els procediments potencialment estressants es van realitzar sota anestèsia de pentobarbital sòdic.

2.7 Assaig MTT

Les cèl·lules MCF7 es van cocultivar amb RPMI 1640 sense vermell de fenol (que contenia un 5 per cent de CDT-FBS) durant quatre dies. Les cèl·lules es van sembrar en plaques de 96-pous a una densitat de 2,000 cèl·lules/pou. Es va aconseguir un cultiu adherent i després de 72 h de cultiu, les cèl·lules es van cocultivar en medi RPMI 1640 que contenia mostres de sèrum de ratolins tractats amb Cistanche. Els experiments es van realitzar en sis rèpliques. Posteriorment, es van afegir 20 μL de solució MTT (5 mg/mL en PBS) a cada pou i les cèl·lules es van incubar durant 4 h. Després de l'eliminació del medi, es van afegir 150 µL de DMSO per produir el producte de formazà i les plaques es van agitar a la foscor per dissoldre's completament. L'absorbància es va mesurar a 570 nm mitjançant un lector de microplaques. La taxa de proliferació es va calcular com el valor d'absorbància mitjà del grup de sèrum que conté fàrmacs dividit pel valor d'absorbància mitjà del grup control en blanc (cèl·lules cocultivades a RPMI 1640 sense sèrum).

2.8 Anàlisi estadística

La prova t de mostres aparellades (de dues cues) es va utilitzar per identificar diferències estadísticament significatives entre els valors dels grups experimentals i de control en blanc. Les diferències es van considerar significatives a un nivell de confiança del 95 per cent (p <>

La PCA es va utilitzar per avaluar les àrees pics característiques en els cromatogrames de les mostres de deu hàbitats diversos. L'anàlisi bivariant i l'anàlisi de correlació de Gray es van utilitzar per avaluar la correlació de les àrees pics i la seva activitat estrogènica. La correlació es va calcular mitjançant les estadístiques del programari d'estadístiques SPSS (SPSS per a Windows 21.0, SPSS Inc., EUA). Les diferències es van considerar significatives a un nivell de confiança del 95 per cent (de dues cues).

Aprovació ètica: la investigació realitzada no està relacionada amb l'ús humà o animal.

3 Resultats i discussió

3.1 Anàlisi de clústers i avaluació de la similitud

La desviació estàndard relativa del temps de retenció i l'àrea del pic dels pics característics va ser de {{0}},58 i 0,34% per a la precisió, 0,52 i {{8} },31 per cent per a la reproductibilitat, i {{10}},19 i 0,13 per cent per a l'estabilitat, respectivament. Aquestes troballes van indicar que el nostre mètode LC d'establiment d'empremtes digitals era raonable i fiable. Les similituds dels cromatogrames de deu mostres eren superiors a 0,9. Els pics comuns per a totes les mostres no podrien representar completament els components característics de Cistanche, ja que el pic es podria haver perdut. Per tant, el nombre de concordança de la mostra es va ajustar de 26 a 20 per obtenir un mapa de cromatograma més precís. Es van obtenir un total de 26 pics, i la suma de les seves àrees va ser superior a 0,8 en comparació amb les de l'àrea de pic global de la mostra. Per tant, vam concloure que aquests pics cromatogràfics podrien reflectir eficaçment els principals constituents químics de Cistanche. Els resultats de l'anàlisi de clústers es mostren a la figura 1. Un total de deu hàbitats diversos es van dividir en tres categories de la següent manera: (A) 2, Guizhou; 3, Qinghai; 4, Chaidamu; 10, Neimeng; 7, Xinjiang i 6, Sichuan. (B) 1, Xizang; 8, Ningxia i 5, Alashan. (C) 9, Hubei. La tendència de l'anàlisi de clústers va mostrar que els hàbitats de les herbes medicinals són similars quan es troben a la part inferior del llindar. Però amb l'augment del llindar, les condicions climàtiques i de creixement dels hàbitats són properes. Mostra que l'anàlisi de clúster no només pot distingir bé els diversos hàbitats, sinó que també reflecteix les afinitats entre ells.

3.2 Identificació de components químics

Based on the synergy between components, TCM exerted pharmacological effects. Certain studies have been conducted to identify the chemical compositions of C. deserticola [24-26]. The correlation of inherent constituents with their activities indicated that they could be identified based on the combination of LC with the corresponding indices of pharmacological activity. Q-TOF-MS is suitable for multi-constituent identification of TCM since it can provide the exact molecular mass because of its high resolution. A total of 26 compounds were identified by analyzing the primary and secondary MS data. PCA was used to assess whether these compounds concerning their oestrogenic activity. A contribution of the activity is indicated by an eigenvalue higher than 1 (> 1) and a cumulative contribution rate of variables higher than 0.8 (>0.8). Com més alt sigui el valor absolut de la càrrega pròpia, més gran serà la influència dels compostos sobre els índexs estrogènics.

Es van comparar els cromatogrames de Cistanche i les mostres estàndard per identificar components individuals en les mateixes condicions LC-MS. Tal com es mostra a la taula 1, es van identificar un total de 26 components basats en el temps de retenció i les dades de MS [24-26]. Els ingredients actius s'administren per via oral en forma de mescles en lloc de monòmers, ja que la medicina tradicional xinesa es presenta en forma de barreja per tenir un paper terapèutic. No es va trobar que un sol compost després de separar-se individualment tingués cap paper. El nostre objectiu és revelar compostos que tenen activitat estrogènica en els components coneguts de Cistanche [23-30] i, per tant, no vam seleccionar RMN ni altres mitjans tècnics per validar la seva identitat. El pic 1 va indicar un ió desprotonat predominant amb una relació m/z de 373 (C16H22O10), que era idèntica a la composició elemental de l'àcid genipòdic. Això va ser recolzat per la pèrdua d'un fragment de glucosa que va produir un ió fragment amb una relació m/z de 211. El pic 2 indicava un ió desprotonat predominant amb una relació m/z de 461 (C20H30O12), que era idèntica a la composició elemental. de decafeoilacteòsid, i va ser recolzat per la pèrdua d'un fragment ramnosil, formant una fragmentació amb una relació m/z de 315. El pic 4 indicava un ió desprotonat predominant amb una relació m/z de 375 (C16H24O10), que era idèntic al composició elemental de 8-àcid epilogànic. La pèrdua d'un fragment de glucosa, va formar una fragmentació amb una relació m/z de 213, va donar suport encara més a la inferència. El pic 6 va indicar un ió desprotonat predominant amb una relació m/z de 607 (C29H36O14), que era idèntica a la composició elemental de la siringalida A3'- - l-ramnopiranòsid.

La pèrdua d'un fragment caff, va formar un ió fragment amb una relació m/z de 445, va donar suport a la inferència. El pic 8 va indicar un ió desprotonat predominant amb una relació m/z de 799 (C36H48O20), que era idèntica a la composició elemental del cistanòsid A. La pèrdua d'un fragment caff, va formar un ió fragment amb una relació m/z de 637, va recolzar encara més la inferència. El pic 11 va indicar un ió desprotonat predominant amb una relació m/z de 487 (C21H28O13 ), que era idèntica a la composició elemental del cistanòsid F. Això va ser recolzat per la pèrdua d'un fragment ramnosil que va produir un ió fragment amb un m/z. una proporció de 341 i la pèrdua d'una altra part caff va formar un ió fragment amb una relació m/z de 179, va donar suport a la inferència. El pic 12 va indicar un ió desprotonat predominant amb una relació m/z de 813 (C37H50O20), que era idèntica a la composició elemental del cistanòsid B. La pèrdua d'un fragment de glucosa, va formar un ió fragment amb una relació m/z de 651, va recolzar encara més la inferència. El pic 13 va indicar un ió desprotonat predominant amb una relació m/z de 827 (C37H48O21), que era idèntica a la composició elemental del tubulòsid A. La pèrdua d'un fragment ramnosil, va formar una fragmentació amb una relació m/z de 681, a més. recolzat la inferència. El pic 14 va indicar un ió desprotonat predominant amb una relació m/z de 637 (C30H38O15), que era idèntica a la composició elemental del cistanòsid C. La pèrdua d'un fragment ramnosil, va formar un ió fragment amb una relació m/z de 491, va recolzar encara més la inferència.

El pic 15 va indicar un ió desprotonat predominant amb una relació m/z de 591 (C29H36O13), que era idèntica a la composició elemental de l'osmantuside B. La pèrdua d'un fragment ramnosil, va formar un ió fragment amb una relació m/z de 445, va recolzar encara més la inferència. El pic 16 va indicar un ió desprotonat predominant amb una relació m/z de 623 (C29H36O15), que era idèntica a la composició elemental de l'acteòsid. La pèrdua d'un fragment caff, va formar un ió fragment amb una relació m/z de 461, va donar suport a la inferència. El pic 18 va indicar un ió desprotonat predominant amb una relació m/z de 623 (C29H36O15), que era idèntica a la composició elemental de l'isoacteòsid. La pèrdua d'un fragment caff, el pic anterior 15, va indicar un ió desprotonat predominant amb una relació m/z de 591 (C29H36O13), que era idèntica a la composició elemental de l'osmantuside B. La pèrdua d'un fragment ramnosil, va formar un ió fragment amb un La relació m/z de 445 va donar suport encara més a la inferència. El pic 16 va indicar un ió desprotonat predominant amb una relació m/z de 623 (C29H36O15), que era idèntica a la composició elemental de l'acteòsid. La pèrdua d'un fragment caff, va formar un ió fragment amb una relació m/z de 461, va donar suport a la inferència. El pic 17 va indicar un ió desprotonat predominant amb una relació m/z de 623 (C29H36O15), que era idèntica a la composició elemental del cis-acteòsid. La pèrdua d'un fragment caff, va formar un fragment i un ió de fragment amb una relació m/z de 461, va donar suport a la inferència. El pic 21 va indicar un ió desprotonat predominant amb una relació m/z de 653 (C30H38O16), que era idèntica a la composició elemental del campneòsid Ⅰ.

La pèrdua d'un fragment caff va formar un ió fragment amb una relació m/z de 491, i la pèrdua d'un altre fragment ramnosil va formar un ió fragment amb una relació m/z de 345, donant suport encara més a la inferència. El pic 22 va indicar un ió desprotonat predominant amb una relació m/z de 665 (C31H38O16), que era idèntica a la composició elemental del tubulòsid B. La pèrdua d'un fragment de CH3 CO va formar un ió fragment amb una relació m/z de 623, i la pèrdua d'un altre fragment caff va formar un ió fragment amb una relació m/z de 461, donant suport encara més a la inferència. El pic 23 va indicar un ió desprotonat predominant amb una relació m/z de 639 (C29H36O16), que era idèntica a la composició elemental del campneòsid. La pèrdua d'un fragment de ramnosil, va formar un ió fragment amb una relació m/z de 493, va donar suport encara més a la inferència. El pic 24 va indicar un ió desprotonat predominant amb una relació m/z de 665 (C31H38O16), que era idèntica a la composició elemental del 2'-acetilacteòsid. La pèrdua d'un fragment Ac va formar un ió fragment amb una relació m/z de 623, i la pèrdua d'un altre fragment caff va formar un ió fragment amb una relació m/z de 461, donant suport encara més a la inferència. El pic 25 va indicar un ió desprotonat predominant amb una relació m/z de 445 (C20H30O11), que era idèntica a la composició elemental del cistanòsid G. La pèrdua d'un fragment ramnosil, va formar un ió fragment amb una relació m/z de 299, va recolzar encara més la inferència. Les estructures dels compostos es mostren a la figura 2.

3.3 PCA

As shown in Table 2, the eigenvalues of the first eight principal components were higher than 1(> 1), and the cumulative contribution rate of the first six principal components was 93.417%. Therefore, the first six principal components were evaluated further. Table 2 indicates their eigenvalues and factor loadings. The first principal component exhibited a higher load based on the eigenvalues of the eight peaks (>0.9). Aquests pics van ser els següents: 9, 12, 14 i 15. En conseqüència, es van seleccionar com a variables representatives de l'activitat estrogènica l'equinacòsid, el cistàsid B, l'osmanthuside B i l'acteòsid, corresponents a un total de 4 pics (figura 3).

.

3.4 Determinació de l'activitat estrogènica

Es va calcular la relació entre el pes humit uterí i el pes corporal de cada ratolí (figura 4). Els animals exposats a Cistanche de nou hàbitats van mostrar activitats estrogèniques importants augmentant el seu pes uterí en comparació amb els ratolins del grup control en blanc. La figura 4 mostra a més la taxa de proliferació de cèl·lules MCF7 tractades amb sèrum de ratolins tractats amb Cistanche. Les cèl·lules tractades amb sèrums de ratolins als quals se'ls va administrar Cistanche de deu hàbitats van mostrar un creixement significativament superior en comparació amb les cèl·lules sense tractament.

3.5 Anàlisi bivariada

En el present estudi, vam observar que els pesos uterins de les femelles de ratolins Kunming immadures van augmentar i es va promoure la proliferació de cèl·lules de càncer de mama humà MCF7. Aquestes troballes van verificar l'activitat estrogènica de Cistanche. La figura 5 va indicar els índexs uterins i les taxes de proliferació de cèl·lules MCF7 d'aquests components. Es va utilitzar el coeficient de correlació de Pearson per calcular les àrees pics relatives, que corresponien a l'activitat estrogènica de les mostres. Els coeficients de correlació superiors a 0,3 es van considerar significatius (p < 0.05),="" mentre="" que="" els="" coeficients="" de="" correlació="" superiors="" a="" 0,5="" es="" van="" considerar="" molt="" significatius="" (p=""><0,01). segons="" els="" resultats,="" es="" va="" demostrar="" que="" cistanche="" posseïa="" activitat="">

Un total de nou compostos es van correlacionar significativament amb l'augment del pes uterí (p <{{0}},05), mentre="" que="" deu="" compostos="" es="" van="" correlacionar="" significativament="" amb="" la="" proliferació="" cel·lular="" de="" mcf7="" (p=""><0,05). els="" compostos="" que="" es="" van="" correlacionar="" significativament="" amb="" el="" pes="" uterí="" i="" la="" proliferació="" cel·lular="" van="" ser="" 8-àcid="" epilogànic,="" salidroside,="" siringalida="" a3'{-="" -="" l-ramnopiranosida,="" cistànosida="" a,="" cistànosida="" b,="" cistànosida="" c,="" osmantusid="" b,="" acteòsid,="" isoacteòsid,="" tubulòsid="" b,="" 2'-acetilacteòsid="" i="" dos="" compostos="" desconeguts="" (figura="" 5).="" aquests="" tretze="" compostos="" exercien="" activitats="">

3.6 Mètode d'anàlisi de correlació de grisos

La figura 6 mostra la correlació relativa dels pics característics de 26 compostos amb els índexs uterins, i la figura 7 mostra la correlació relativa dels pics característics dels 26 compostos amb les seves taxes de proliferació cel·lular. Un total de tres compostos van mostrar la correlació més alta amb els índexs uterins, és a dir, 8-àcid epilogànic, cistanòsid F i acteòsid (figura 6, en ordre descendent); mentre que els sis compostos que van mostrar la correlació més alta amb la proliferació de cèl·lules MCF7 eren equinacòsid, cistàsid F, cistàsid B, osmanthuside B, isoacteòside i tubulòsid B (figura 7, en ordre descendent). Les correlacions relatives de l'equinacòsid, l'osmantuside B, l'acteòsid i l'isoacteòsid eren superiors a 0.5.

3.7 Optimització de les condicions LC-MS

Per obtenir un millor mapa del cromatograma, es van comparar metanol i acetonitril. Finalment, la combinació d'àcid fòrmic aquós (0,2 per cent, v/v) - acetonitril va ser la millor fase mòbil per a la separació. En el rang d'exploració de longitud d'ona completa de 200-400nm, es va seleccionar 254 nm com a òptim. A més, també es van millorar els paràmetres de MS. Es va seleccionar el mode d'exploració d'ions negatius perquè millorava els valors de resposta de la majoria dels ingredients de Cistanche.

4 Conclusió

La tecnologia LC-Q-TOF-MS es va utilitzar per identificar els components actius estrogènics de Cistanche. El present estudi va il·lustrar que 8-àcid epilogànic, salidroside, syringalideA3'- -l-ramnopiranòsid, cistàsid A, equinacòsid, cistàsid F, cistàsid B, cistàsid C, osmanthuside B, acteòside, isoacteòside, tubulósida B, El 2'-acetilacteòsid i dos compostos desconeguts van ser els principals constituents actius de Cistanche. Tanmateix, aquestes troballes requereixen estudis addicionals per explorar els efectes in vivo i el mecanisme d'acció dels constituents.

Agraïments:

Aquest projecte va comptar amb el suport de la Fundació Nacional de Ciències Naturals de la Xina (núm. 81073015), la Fundació Científica de la Naturalesa de la província de Heilongjiang (ZD2017014) i el pla de formació per a joves talents innovadors del Col·legi de la província de Heilongjiang (UNPYSCT-2017209). . Els autors declaren que no hi ha conflicte d'interessos pel que fa a la publicació d'aquest article.

Referències

[1] Wang Z., Xia Q., Liu X., Liu W., Huang W., Mei X., Luo J., Shan M., Lin R., Zou D., Ma Z., Fitoquímica, farmacologia , control de qualitat i investigació futura de Forsythia suspensa (Thunb.) Vahl: A review, J. Ethnopharmacol., 2018, 210, 318- 339.

[2] Shu Y., Liu Z., Zhao S., Song Z., He D., Wang M., Zeng H., Lu C., Lu A., Liu Y., Estratègia metabolòmica pseudoorientada integrada i global aplicada a la detecció de marcadors de control de qualitat de Citrus TCM, Anal. Bioanal. Chem., 2017, 409(20), 4849-4865.

[3] Yang B., Wang Y., Shan L., Zou J., Wu Y., Yang F., Zhang Y., Li Y., Zhang Y., A Novel and Practical Chromatographic "Fingerprint-ROC-SVM "Estratègia aplicada a l'anàlisi de qualitat de les injeccions de medicina tradicional xinesa: ús de la injecció de KuDieZi com a estudi de cas, Molècules., 2017, 22

(7). PII: E1237.[4] Zhuo L., Peng J., Zhao Y., Li D., Xie X., Tong L., Yu Z., Detecció de marcadors de control de qualitat bioactius de les píndoles degoteig QiShenYiQi basades en la relació entre l'empremta digital de cromatografia líquida d'alt rendiment i activitat protectora vascular, J. Sep. Sci., 2017, 40(20), 4076-4084.

[5] Liu N., Li J., Li BG, Aplicació de l'anàlisi i el pensament estadístics multivariants en el control de qualitat de la medicina xinesa, Zhongguo. Zhong. Yao. Za. Zhi., 2014, 39

(21), 4268-4271.

[6] Wang DD, Liang J., Yang WZ, Hou JJ, Yang M., Da J., Wang Y., Jiang BH, Liu X., Wu WY, Guo DA, dades de components característics orientats a HPLC/qTOF-MS conjunt i anàlisi quimiomètrica per al control de qualitat holístic de preparats complexos de TCM: píndola Niuhuang Shangqing com a exemple, J. Pharm. Biomed. Anal., 2014, 89, 130-141. [7] Hernaez R., Thrift AP, High Negative Predictive Value, Low Prevalence, and Spectrum Effect: Caution in the Interpretation, Clin. Gastroenterol. Hepatol., 2017, 15(9), 1355-1358.

[8] Liang J., Chen Y., Ren G., Dong W., Shi M., Xiong L., Li J., Dong J., Li F., Yuan J., Screening Hepatotoxic Components in Euodia rutaecarpa per UHPLC-QTOF/MS basat en la relació espectre-toxicitat, molècules., 2017, 22(8). PII: E1264.

[9] Li W., Sun X., Liu B., Zhang L., Fan Z., Ji Y., Cribratge i identificació del component hepatotòxic a Evodia rutaecarpa basat en la relació espectre-efecte i UPLC-Q-TOFMS, Biomed . Chromatogr., 2016, 30(12), 1975-1983.

[10] Chopard G., Puyraveau M., Binetruy M., Meyer A., ​​Vandel P., Magnin E., Berger E., Galmiche J., Mauny F., Spectrum Effect i Spectrum Bias en el rendiment de la prova de cribratge per a Deteriorament cognitiu lleu amnèstic: quines són les implicacions clíniques?, J. Alzheimers. Dis., 2015, 48(2), 385-393.

[11] Xu GL, Xie M., Yang XY, Song Y., Yan C., Yang Y., Zhang X., Liu ZZ, Tian YX, Wang Y., Jiang R., Liu WR, Wang XH, She GM, Relacions espectre-efecte com a enfocament sistemàtic a la investigació de la medicina tradicional xinesa: estat actual i perspectives futures, Molecules., 2014, 19(11), 17897-17925.

[12] Zheng Q., Zhao Y., Wang J., Liu T., Zhang B., Gong M., Li J., Liu H., Han B., Zhang Y., Song X., Li Y. , Xiao X., Relacions d'efecte espectre entre empremtes dactilars UPLC i bioactivitats de les arrels secundàries brutes d'Aconitum carmichaelii Debeaux (Fuzi) i els seus tres productes processats sobre el creixement mitocondrial juntament amb l'anàlisi de correlació canònica, J. Ethnopharmacol., 2014,153(3) , 615-623.

[13] Shi Z., Liu Z., Liu C., Wu M., Su H., Ma X., Zang Y., Wang J., Zhao Y., Xiao X., Relacions espectre-efecte entre empremtes dactilars químiques i Efectes antibacterians de Lonicerae Japonicae Flos i Lonicerae Flos Base sobre UPLC i Microcalorimetria, Front. Pharmacol., 2016, 7, 12.

[14] Usher-Smith JA, Sharp SJ, Griffin SJ, The spectrum effect in tests for risk prediction, screening, and diagnosis, BMJ, 2016, 353, i3139.

[15] Chen Y., Yu H., Wu H., Pan Y., Wang K., Liu L., Jin Y., Zhang C., Traçant nous compostos hemostàtics a partir de productes d'escalfament de flavonoides totals a Flos Sophorae per espectre -relacions d'efectes i cromatografia en columna, J. Sep. Sci., 2015, 38(10), 1691-1699.

[16] Liu X., Wang XL, Wu L., Li H., Qin KM, Cai H., Pei K., Liu T., Cai BC, Investigació sobre les relacions espectre-efecte de Da-Huang-Fu- Zi-Tang en rates pel mètode UHPLC-ESI-Q-TOF-MS, J. Ethnopharmacol., 2014, 154(3), 606-612.

[17] Xie RF, Zhou X., Shi ZN, Li YM, Li ZC, Estudi sobre la relació d'efectes d'espectre del rizoma Rhei, còrtex Magnoliae Officinalis, Fructus Aurantii Immaturus i la seva fórmula, J. Chromatogr. Sci., 2013, 51(6), 524-532. [18] Li F., Yang X., Yang Y., Guo C., Zhang C., Yang Z., Li P., Antiosteoporotic activity of echinacoside in ovariectomized rates, Phytomedicine., 2013, 20(6), { {9}}.

[19] Xiong WT, Gu L., Wang C., Sun HX, Liu X., Efectes antihiperglucèmics i hipolipidèmics de Cistanche tubulosa en ratolins DB/DB diabètics tipus 2, J. Ethnopharmacol., 2013, 150(3) , 935- 945.

[20] Morikawa T., Ninomiya K., Imamura M., Akaki J., Fujikura S., Pan Y., Yuan D., Yoshikawa M., Jia X., Li Z., Muraoka O., glucòsids feniletanoides acilats , equinacòsid i acteòsid de Cistanche tubulosa, milloren la tolerància a la glucosa en ratolins, J. Nat. Med., 2014, 68(3), 561-566.

[21] Nan ZD, Zeng KW, Shi SP, Zhao MB, Jiang Y., Tu PF, glucòsids feniletanoides amb activitats antiinflamatòries de les tiges de Cistanche deserticola cultivades al desert de Tarim, Fitoterapia., 2013, 89, {{4 }}.

[22] Lu D., Zhang J., Yang Z., Liu H., Li S., Wu B., Ma Z., Anàlisi quantitativa de Cistanches Herba mitjançant cromatografia líquida d'alt rendiment juntament amb detecció de matrius de díodes i d'alt rendiment. espectrometria de masses de resolució combinada amb mètodes quimiomètrics, J. Sep. Sci., 2013, 36(12), 1945-1952.

[23] Han L., Boakye-Yiadom M., Liu E., Zhang Y., Li W., Song X., Fu F., Gao X., Caracterització estructural i identificació de glucòsids feniletanoides de Cistanches deserticola YC Ma per UHPLC/ESI-QTOF-MS/MS, Phytochem. Anal., 2012, 23(6), 668-676.

[24] Xiang Y., Jing Z., Haixia W., Ruitao Y., Huaixiu W., Zenggen L., Lijuan M., Yiping W., Yanduo T., Activitat antiproliferativa dels fenilpropanoides aïllats de Lagotis brevituba Maxim, Phytother . Res., 2017, 31(10), 1509-1520.

[25] Yan Y., Song Q., Chen X., Li J., Li P., Wang Y., Liu T., Song Y., Tu P., Determinació simultània de components amb amplis intervals de polaritat i contingut en Cistanche tubulosa utilitzant cromatografia d'interacció hidròfila-fase inversa acoblada en sèrie-espectrometria de masses en tàndem, J. Chromatogr. A., 2017, 1501, 39-50.

[26] Zou P., Song Y., Lei W., Li J., Tu P., Jiang Y., Aplicació de metabolòmica basada en 1H RMN per a la discriminació de diferents parts i desenvolupament d'un nou flux de treball de processament per a Cistanche deserticola, Acta. Farmàcia. Sin. B., 2017, 7(6), 647-656.

[27] Pan YN, Estudis sobre els constituents i la bioactivitat de Cistanche tubulosa fresca, Ph.D. tesi, Shenyang Pharmaceutical University, Shenyang, Xina, 2011.

[28] Cui Q., ​​Pan Y., Xu X., Zhang W., Wu X., Qu S., Liu X., El perfil metabòlic de l'acteòsid produït per bacteris intestinals humans o de rata o enzim intestinal in vitro emprat UPLC Q-TOF–MS, Fitoterapia., 2016, 109, 67-74.

[29] Cui Q., ​​Pan Y., Bai X., Zhang W., Chen L., Liu X., Caracterització sistemàtica dels metabòlits d'echinacòsid i acteòside de Cistanche tubulosa en plasma de rata, bilis, orina i femta a partir de UPLC-ESI-Q-TOF-MS, Biomed. Chromatogr., 2016(9), 1406-1415.

[30] Cui Q., ​​Pan Y., Yan X., Qu B., Liu X., Xiao W., Una forma metabòlica d'investigar els obstacles relacionats que causen una mala biodisponibilitat en el lliurament oral d'isoacteòsid en rates que utilitzen cromatografia líquida d'alt rendiment / Espectrometria de masses en tàndem de temps de vol quadripol, Rapid. Commun. Mass. Spectrom., 2017(4), 371-380.