Estudi sobre l'efecte de l'acteosida (un ingredient actiu a Cistanche deserticola) a NAFLD mitjançant la inducció de l'autofagia
Feb 24, 2025
2 resultats
2.1 Comparació de Lc 3- ⅱ Nivells d’expressió de proteïna en cèl·lules HepG2 tractades ambActuar i ressaltar l'expressió relativa de Lc 3- ⅱ proteïnaA les cèl·lules HepG2 tractades amb BAFA1 (0. 67 ± 0. 0 4) va ser significativament superior al del grup de control en blanc (0. 41 ± 0. {{18} 2). L'expressió relativa de Lc {{1 {{2 0}}}} ⅱ proteïna en cèl·lules HepG2 del grup Rapamycin+BafA1 (0. 28 ± {{4 0}}. 02). The expression of LC3-Ⅱ protein in HepG2 cells in the ECH+BafA1 group and the ACT+BafA1 group [0.43±0.02 and 1.36±0.11, respectively] were significantly higher than those in the ECH group and the ACT group [(0.18±0.01 and 0.28±0.02, respectively]], and the differences were statistically significant (P<0.05).
TCM Herb Cistanche per a la protecció del fetge
2.2 Comparació de Lc 3- ⅱ Nivells d’expressió de proteïna en cèl·lules HepG2 tractades amb diferents concentracions d’ACT
The LC3-Ⅱ protein expression levels of HepG2 cells in the CON group (0.79±0.07) were compared with those in the STA group (0.50±0.04), with no significant difference (P>{{{{{1 0}}}}. 0 5); Els nivells d’expressió de proteïna LC 3- ⅱ de les cèl·lules HepG2 a la BAFA1 combinades amb 25, 5 0, i 1 0 0 μmol/L ACT grups (1.17 ± 0. 3 0, 1,83 ± 0. 53 i 0. 97 ± 0,25, respectivament) van ser significativament superiors als dels grups de 25, 50 i 100 μmol/L ACT<0.05). The LC3-Ⅱ protein expression level of HepG2 cells in the 50 μmol/L ACT group was the highest. See Figure 1.
Nota: A. Immunoblot de proteïnes; B. Resultats de l'anàlisi semi-quantitatius; en comparació amb el grup ACT sense BAFA1, AP<0.05.
Figura 1 Comparació de Lc 3- ⅱ Nivells d’expressió de proteïna en cèl·lules HepG2 tractades amb diferents concentracions d’ACT
2.3 Comparació de la viabilitat de les cèl·lules HepG2 tractades amb diferents concentracions d’acte durant 24 i 48 h
Els valors OD de les cèl·lules HepG2 després de la intervenció amb 0, 2 0, 4 {{1 {0}, 6 0, 8 0, i 1 0 0} μmol/l act for 24 h waw was waw was waw Was waw Was wawn 0. 98 ± 0. 17, 0. 99 ± {{3 {0}}. 0. 94 ± 0. 15, i 0. 94 ± 0. 20, respectivament; i els valors OD de les cèl·lules HepG2 després de la intervenció durant 48 h van ser de 3,06 ± 0,27, 0,96 ± 0,27, 2,88 ± 0,27, 3,08 ± 0,15, 3,01 ± 0,13 i 0,09 ± 0,22, respectivament. No hi va haver cap diferència significativa en els valors OD de les cèl·lules HepG2 després de 24 i 48 h d'intervenció amb diferents concentracions d'ACT (F {=0. 213, 0,213, p =0. 96, 0,36). Vegeu la figura 2.
Nota: A. Les cèl·lules HepG2 es van tractar amb diferents concentracions d’ACT durant 24 h; Les cèl·lules HepG2 B. van ser tractades amb diferents concentracions d’acte durant 48 h.
Figura 2 Valors OD a 570 nm després de 24 i 48 h de tractament amb diferents concentracions d’actes
2,4 Comparació dels nivells de TG i la tinció vermella O oli en el model de cèl·lules in vitro de NAFLD després de la intervenció ACT
El nivell de TG de cèl·lules HepG2 del grup model (34,15 ± 1,90) va ser significativament superior al del grup de control en blanc (14,17 ± 2,74) i el grup d'intervenció ACT (19,11 ± 1,68), i les diferències van ser estadísticament significatives (P (p<0.05). The number of stained lipid droplets in HepG2 cells in the ACT intervention group was significantly reduced (see Figure 3).
Nota: A. Nivell TG; B. Tinció vermella O oli (20 ×); en comparació amb el grup del model, AP<0.05.
Figura 3 Comparació del nivell de TG i la tinció de l'oli vermell O en el model de cèl·lules in vitro NAFLD després del tractament ACT
2.5 Comparació d’autofagosomes i gotetes de lípids després del tractament ACT en comparació amb el grup de control en blanc, les gotes de lípids de cèl·lules HepG2 del grup de tractament de la rapamicina i el grup d’intervenció ACT van augmentar significativament, i els autofagosomes LC3 de les cèl·lules HepG2 del grup d’intervenció Act van augmentar significativament i es van co -localitzar amb els drogues de lípids a l’espai. Vegeu la figura 4.
3 discussió
NAFLD és la malaltia hepàtica crònica més comuna del món, que representa aproximadament 1/4 de la població total del món i s’ha convertit en un problema global de salut pública. La sobrenutrició és el principal factor que condueix NAFLD. La ingesta excessiva de nutrients per part de les cèl·lules hepàtiques provoca una deposició excessiva de greix a les cèl·lules, provocant reaccions lipotòxiques com l’estrès cel·lular (estrès oxidatiu i l’estrès del reticle endoplàsmic), l’activació del inflammasoma i l’apoptosi cel·lular i, posteriorment, causant una sèrie de canvis en els fenotips del teixit hepàtic com ara l’estimulació inflamatòria, la regeneració del teixit i la fibrosi [{{{{{{{{{{{{{{{{{{{{{{{{{{{{{{{{{{{{{{{{{{{{{{{{{{{2}. En els darrers anys, els estudis han demostrat que l’autofagia té un paper important en la prevenció del desenvolupament del NAFLD humà. Els resultats de la detecció d’índexs relacionats amb l’autofagia en els fetges de pacients amb NAFLD i malalties hepàtiques grasses no alcohòliques i els fetges de ratolins obesos i de dieta rics en greixos van demostrar que el procés d’autofagia en hepatòcits es va bloquejar, cosa que va provocar l’acumulació massiva de TG intracel·lular i altres gotes de lípids [16]. Altres estudis han demostrat que després que el gen clau 7 de l’autofagia d’hepatòcits es va eliminar específicament en ratolins alimentats amb una dieta rica en greixos, el nivell de TG en els hepatòcits del ratolí va augmentar significativament [17]. No obstant això, després de la sobreexpressió del gen ATG7 o de la intervenció amb inductors autofàgics com la rapamicina i la carbamazepina, es va reduir significativament la degeneració grassa al fetge del ratolí [18-20].
Això suggereix que la degeneració grassa hepàtica es pot reduir significativament mitjançant la millora de l’activitat d’autofagia hepàtica, proporcionant una estratègia eficaç per al tractament del NAFLD. Els productes naturals, com a principal font de desenvolupament de nous medicaments, s’utilitzen àmpliament en la prevenció i el tractament de diverses malalties hepàtiques. Com a producte excel·lent que s’utilitza habitualment en la medicina tradicional xinesa, Cistanche Deserticola ha cridat l’atenció generalitzada pels seus efectes farmacològics com la neuroprotecció, la immunomodulació, l’antioxidant, l’anticoritzador i la protecció del fetge. Fins al moment, més de 120 compostos s’han aïllat de Cistanche Deserticola, incloent glicòsids feniletanoides, terpenoides i els seus glicòsids, lignans i els seus glicòsids, oligosacàrids, poliolls i polisacàrids [21]. Entre ells, els glicòsids feniletanoides són la classe de compostos més estudiats en els ingredients actius de Cistanche Deserticola. ECH i ACT són compostos representatius dels glicòsids de feniletanoides de Cistanche Deserticola, que tenen efectes positius en els antioxidants, protegint el fetge, el miocardi, les cèl·lules nervioses i la millora de la memòria [{2 {2}}]. No obstant això, no hi ha cap informe de literatura rellevant sobre si els glicòsids de feniletanoides de Cistanche Deserticola estan implicats en el procés d'autofagia per protegir el fetge.
L’autofagia és un procés d’autodegradació que és omnipresent al cos. És un procés catabòlic en què els autofagosomes degraden els residus metabòlics cel·lulars. El procés d’autofàgia inclou generalment tres processos: l’inici de l’autofàgia, l’extensió autofàgica de la membrana i la formació autofàgica de lisosomes, que es regulen principalment per les proteïnes diana de la rapamicina i la fosfatidilinositol -3 de les vies de senyalització de la cinasa. Els autofagosomes són marcadors de l’autofagia cel·lular. En el procés de formació d’autofagosomes, una sèrie de proteïnes relacionades amb l’autofagia com ATG5 ~ 12 i LC3 tenen un paper important. Per tant, aquest estudi va construir un sistema d’avaluació d’autofàgia, va detectar el nivell d’expressió de proteïna marcadora autofagia LC3 a nivell molecular i va avaluar la capacitat d’inducció d’autofagia de dos glicòsids feniletanoides de cistanche desert de les cèl·lules HepG2. Els resultats van mostrar que després de l’addició del tractament amb BAFA1 sobre la base de la intervenció de l’inductor autofagia rapamicina, el LC intracel·lular LC {{9} ⅱ de les cèl·lules HepG2 va augmentar significativament, indicant que el sistema d’avaluació d’autofagia pot avaluar amb precisió l’activitat d’inducció de l’autofagia dels fàrmacs; Després que ECH i ACT es tractessin amb BAFA1, l'expressió de la proteïna LC 3- ⅱ en cèl·lules HepG2 del grup ECH+BAFA1 i el grup ACT+BAFA1 va ser significativament superior a la del grup ECH i al grup ACT, i les diferències eren estadísticament significatives (p (p<0.05). However, since the autophagy process is very complex, it is easily changed by external environmental stimuli. Therefore, this study used BafA1 to block the autophagic flow, thereby more accurately evaluating the autophagy inducing ability of ECH and ACT. The results showed that after using BafA1 to block the autophagic flow, the intracellular autophagosomes could not be degraded in the autophagolysosomes, resulting in a significant increase in the overall autophagy level of the cells. After the intervention of rapamycin, Ech, and ACT in HepG2 cells, the LC3-Ⅱ protein expression levels of HepG2 cells in the rapamycin+BafA1 group and the ACT+BafA1 group were higher than those in the BafA1 group alone. Although the expression levels of HepG2 cells in the ECH+BafA1 group were significantly higher than those in the ECH group alone, the differences were statistically significant (P<0.05), the expression levels of LC3-Ⅱ protein in HepG2 cells were lower than those in the BafA1 group alone, indicating that ACT has a significant ability to induce autophagy in HepG2 cells. Therefore, this study took ACT as the research object and further studied its pharmacological activity in inducing autophagy and Exercir la protecció del fetgei altres funcions biològiques. En segon lloc, la seguretat és una consideració principal en el desenvolupament de drogues. Per tal d’avaluar la seguretat de l’acte, aquest estudi va provar encara més l’efecte de l’acte sobre la viabilitat de les cèl·lules HepG2. Els resultats van mostrar que la viabilitat de les cèl·lules HepG2 no es va veure gairebé afectada per la intervenció amb diferents concentracions d’ACT, cosa que indica que l’acte es pot utilitzar com a medicament candidat per estudiar encara més els seus efectes farmacològics i els seus mecanismes moleculars.
L’autofagia és un procés biològic molt conservat a les cèl·lules i lleugers canvis en les concentracions de fàrmacs afectaran el nivell d’autofagosomes cel·lulars. Per determinar encara més la concentració òptima d’ACT per induir la formació d’autofagosomes en cèl·lules HepG2, aquest estudi va utilitzar diferents concentracions d’ACT combinades amb BAFA1 per tractar cèl·lules HepG2 i va detectar el nivell d’expressió de Lc 3- ⅱ proteïna a les cèl·lules. Els resultats van mostrar que 50 μmol/L ACT podrien augmentar significativament el nivell d’autofagosomes a les cèl·lules HepG2. Per tant, aquest estudi va utilitzar 50 μmol/L ACT per intervenir en el model de cèl·lules NAFLD construït in vitro i va explorar de forma preliminar la relació entre la sevaprotecció hepàticafunció i autofagia.
Estudis relacionats sobre models de cèl·lules NAFLD han demostrat que després de la intervenció in vitro amb àcids grassos lliures, el nivell de TG de cèl·lules HepG2 va augmentar significativament i que l’agregació de gotetes lípides olioses es podria observar clarament a les cèl·lules [24-25]. En aquest estudi, es va utilitzar 100 μmol/L PA per intervenir en cèl·lules HepG2 in vitro durant 24 hores. El nivell de TG de cèl·lules HepG2 del grup model va ser significativament superior al del grup de control en blanc. Al mateix temps, es podia observar clarament l’agregació de gotetes de lípids a les cèl·lules, cosa que indica que el model de cèl·lules NAFLD es va construir amb èxit. Per tal d’observar encara més l’efecte de l’ACT sobre el model de cèl·lules NAFLD, es va utilitzar 50 μmol/L ACT per intervenir en el model de cèl·lules NAFLD in vitro i es va avaluar l’efecte de l’ACT sobre el NAFLD mitjançant la detecció de nivell de TG i la tinció vermella d’oli. Els resultats van mostrar que després de la intervenció ACT, el nivell de TG i el nombre de gotes lípids olioses a les cèl·lules HepG2 van ser significativament inferiors a les del grup model, cosa que indica que l’acte té l’activitat de reduir TG en el model de cèl·lules NAFLD induïda per PA. Per tal d’estudiar encara més la relació entre l’activitat de baixada de lípids d’ACT i l’autofagia cel·lular, aquest estudi va utilitzar LC 3- ⅱ Anticossos proteics específics i sondes fluorescents de bodipy per co-talar autofagosomes i gotetes lípids. Es va observar que el nombre d’autofagosomes a les cèl·lules HepG2 després de la intervenció ACT es va incrementar significativament en comparació amb el grup de control, que va ser coherent amb els resultats de la immunoblot de proteïnes en aquest estudi, confirmant encara més que l’acte té activitat que indueix autofàgia en cèl·lules HepG2. A més, després de la intervenció de fàrmacs, els autofagosomes intracel·lulars i les gotes de lípids es van co-localitzar, cosa que indica que l’efecte d’ACT en la millora de la degeneració gras NAFLD induïda per PA pot implicar la implicació de l’autofagia cel·lular. No obstant això, en el model de cèl·lules NAFLD, si ACT exerceix la seva activitat farmacològica de reduir els nivells de TG intracel·lular a través de la via lipofàgica encara cal explicar -ne encara més bloquejant el procés d’autofagia intracel·lular.
En resum, entre els dos compostos de glicòsids de feniletanol de Cistanche Deserticola, Act té una capacitat significativa d’induir l’autofagia a les cèl·lules HepG2. Al mateix temps, en el model de cèl·lules de steatosi hepàtica induïda per PA, la CT va reduir significativament el nivell de TG a les cèl·lules HepG2. Després de la intervenció ACT, els autofagosomes i les gotes de lípids a les cèl·lules HepG2 tenien una certa relació de co-localització, cosa que indica que l’autofagia pot ser una nova via implicada en el procés farmacològic d’ACT en termes de protecció del fetge. Vegeu la figura 5. En estudis posteriors, el mecanisme d’acció d’acte en la baixada dels lípids s’estudiarà detalladament amb detalls mitjançant bloquejadors d’autofagia per establir les bases per al futur desenvolupament de fàrmacs nous.
