Estudi sobre l'efecte de l'acteosida (un ingredient actiu a Cistanche deserticola) a NAFLD mitjançant la inducció de l'autofagia

Resum:

 

Objectiu:Per explorar la funció que indueix l’autofagia de l’acteoside d’ingredients actius (ACT) a Cistanche Deserticola i el seu efecte sobre la malaltia hepàtica grassa no alcohòlica (NAFLD).

MètodesPer prendre echinacoside i actuar com a objectes de recerca, 1 0 0 μmol/L Act i Echinacoside (ECH) es van combinar amb un inhibidor de bleomicina A1 de lisosoma autofagia per al tractament de la intervenció. L’immunoblot de proteïnes es va utilitzar per detectar el nivell d’expressió relativa de la proteïna marcadora autofagia associada a la proteïna 1 de la proteïna 1 (LC 3- ii). Les cèl·lules HepG2 es van intervenir amb diferents concentracions Act in vitro, i es va detectar la viabilitat cel·lular mitjançant el mètode de sal de tetrazolium. En la intervenció vitro de cèl·lules HepG2 amb diferents concentracions d’actuació combinades amb la balofloxacina A1 i la detecció de Lc {9}} II d’expressió de proteïna II mitjançant la tecnologia d’immunoblot de proteïna. Es va utilitzar un model NAFLD construït in vitro amb intervenció de fàrmacs per tacar gotetes de lípids mitjançant el mètode de tinció de color vermell O de oli i detectar nivells de triglicèrids intracel·lulars. Observeu la localització de les gotes de proteïnes i lípids LC3 mitjançant la tecnologia d’immunofluorescència. Els resultats ACT poden induir significativament l’autofagia en cèl·lules HepG2, i el nivell d’expressió de LC 3- II s’incrementa significativament en comparació amb el grup de control (tractat només amb ACT) (1,36 ± 0. 11, 0. 28 ± 0. respectivament), amb significació estadística (p0.05). 50 μmol/L Act va induir significativament l’autofagia en cèl·lules HepG2 i el nivell d’expressió de Lc 3- II va augmentar significativament (1,83 ± 0,53, 0,35 ± 0,18, respectivament). El nivell de TG de cèl·lules HepG2 del grup d'intervenció ACT (19,11 ± 1,68) va ser significativament inferior al del grup de model de cèl·lules NAFLD in vitro (34,15 ± 1,90), i les diferències eren estadísticament significatives (p<0.05). The number of positive lipid droplets in HepG2 cells in the ACT intervention group decreased significantly, and the number of autophagosomes inside the cells increased significantly, showing clear co localization with lipid droplets in space. Conclusion Cistanche deserticola ACT has significant autophagy induction ability, and it may have potential preventive and therapeutic effects on NAFLD.

 

Paraules clau:Malalties hepàtiques grasses no alcohòliques;Cishanche Deserticola;Acteosida; Autofagia

 

TCM Herb Cistanche per al tractament de malalties hepàtiques grasses no alcohòliques (NAFLD)

Feu clic a la foto per obtenir més detalls

 

En les últimes dècades, gras no alcohòlicmalaltia hepàtica(NAFLD) s'ha convertit en el més comúmalaltia hepàtica crònica, amb una prevalença global d’aproximadament el 25% de la població adulta i es considera que està estretament relacionada amb la síndrome metabòlica [1]. Tot i que la probabilitat de complicacions relacionades amb el fetge en pacients amb NAFLD és inferior al 10%, el NAFLD és un factor de risc per a malalties relacionades amb el fetge com la cirrosi i el càncer de fetge primari, cosa que imposa una càrrega econòmica enorme als pacients [2-5]. Malgrat la creixent atenció a NAFLD, el NAFLD com a malaltia crònica important no ha rebut atenció suficient. Per tant, una comprensió més detallada de la patogènesi del NAFLD i la cerca d’estratègies de tractament efectives s’han convertit en problemes urgents a resoldre [6-7].

Estudis recents han demostrat que l’autofàgia cel·lular té un paper important en la fisiologia i la patologia del fetge [8]. La disfunció o la desregulació autofagia està associada a diverses malalties hepàtiques com aramalaltia hepàtica relacionada amb l'alcohol[9], NAFLD [10], steatohepatitis no alcohòlica [11], i carcinoma hepatocel·lular [12]. Les característiques patològiques del NAFLD són una deposició excessiva de triglicèrids (TG) i altres gotes de lípids neutres (LD) en hepatòcits sota estimulació no alcohòlica. Per al fetge, les dues vies principals que regulen el catabolisme d’aquests LD són la lipòlisi i l’autofagia.
La via de lipòlisi està regulada per lipases neutres citoplasmàtiques, com la lipasa sensible a l’hormona i la lipasa TG adiposa. A la via de lipoautofagia corresponent, els LD es poden agafar selectivament reclutant proteïnes relacionades amb l’autofagia per formar autofagosomes, i després els LD encapsulats pels autofagosomes es lliuren a lisosomes i es descomponen per la lipasa àcida en lisosomes. Per tant, l’activació de lipoautofagia en hepatòcits s’ha convertit en una estratègia eficaç per a la prevenció i el tractament del NAFLD.
Cishanche Deserticola és una preciosa medicina d’herbes xineses que s’ha utilitzat àmpliament en la pràctica clínica en fórmules de medicina tradicional xinesa. Al mateix temps, fa temps que s’utilitza com a suplement d’aliments sanitaris. Cishanche Deserticola conté una gran varietat d’ingredients bioactius, el més important dels quals és Cistanche Deserticola feniletanol glicòsids. Com a representants de glicòsids feniletanoides, s'ha informat que l'equinacòsid (ECH) i el verbascòsid (ACT) tenen moltes activitats biològiques importants, com ara antioxidant, neuroprotector, immunomodulador i protecció hepàtica [13]. En termes de protecció del fetge, els estudis han trobat que ECH pot protegir el fetge reduint els mediadors inflamatoris, inhibint el factor de creixement transformador i reduint el nivell d’expressió dels gens relacionats amb la fibrosi hepàtica. L’ACT té un efecte protector significatiu sobre els danys hepàtics induïts per les drogues i les drogues, com l’alcohol, el tetraclorur de carboni i el lipopolisacàrid. L’ACT redueix l’estrès oxidatiu causat per productes químics tòxics, elimina l’oxigen reactiu acumulat al fetge i redueix la concentració de malondialdehid. Al mateix temps, augmenta significativament l’activitat de la dismutasa del superòxid hepàtic i redueix el contingut de glutatió i millora significativament els danys histopatològics i l’apopatosi hepàtic. No obstant això, no hi ha cap informe de literatura rellevant sobre si els glicòsids feniletanoides de Cistanche Deserticola estan implicats en el procés d'autofagia en l'exercici de la protecció del fetge. A partir d’això, aquest estudi va utilitzar mètodes convencionals de biologia cel·lular i un model de cèl·lules in vitro per explorar preliminarment l’efecte inductor de l’autofàgia dels glicòsids feniletanoides de Cistanche Desert Deserticola i van explorar les seves possibles funcions farmacològiques, amb l’objectiu de proporcionar una base científica per al futur desenvolupament de medicaments.

 

1 Materials i mètodes

1.1 Materials

1.1.1 Els subjectes de recerca ECH i ACT es van utilitzar com a subjectes de recerca.

1.1.2 Materials Les cèl·lules HepG2 es van comprar a Wuhan Punosai Life Science Co., Ltd., ECH (número de lot: B21209) i ACT (número de lot: B20715, HPLC Purity superior o igual al 98%) es van comprar a la companyia biològica de Xanghai Yuanye, DMEM High Glucose Medd (número de lig. and trypsin were purchased from HyClone Company, USA, fetal bovine serum (batch number: 04-002-1A) was purchased from BI Company, Israel, penicillin/streptomycin (batch number: SV30010.01) was purchased from Hyclone Company, USA, MTT (batch number: M8180) powder was purchased from Solebao Company, Beijing, Xina, TG (número de lot: BC0625) El kit de detecció es va comprar a la companyia solebao, Beijing, Xina, Red Oil (Número de lot: O 0625-100 G), Dimethyl Sulfoxide (nombre de lot: BCBZ1685) es van comprar a Sigma-Aldrich, EUA; L’inhibidor de l’autofagia-lisosoma Bafilomicina A1 (BAFA1, número de lot: TLRL-BAF1) es va comprar a Invitrogen, EUA; L’activador autofagia Rapamycin (Número de lot: S17098) es va comprar a Shanghai Yuanye Biotechnology Co., Ltd., Xina; Proteïna associada a microtúbul 1 cadena lleugera 3 (LC3, número de lot: L7543, espècie: conill, proporció de dilució: 1: {1 000) i -actina (lot: zrb1312, espècie: conill, proporció de dilució: 1: 5 000) es van comprar a sigma-aldric, usa; L’anticòs secundari marcat amb la peroxidasa de cavall (número lot: 4010-05, espècie: es va comprar a la companyia de cabra anti-conill, dilució: 1: 1 000) es va comprar a Southern Biotech, EUA Companyia, Alexa Fluor Fluor Fluorescent Anticorpe Secundari (Lot: Number: 43328, Wavel Longon Comprat a Sigma-Aldrich Company, EUA i Bodipy 493/501 (número de lot: D3922) es va comprar a Invitrogen Company, EUA.

 

1.2 Mètodes

1.2.1 Cultiu cel·lular

Les cèl·lules HepG2 es van cultivar en el medi de glucosa d’àguila modificat de Dulbecco, que contenia un sèrum boví fetal del 10%, 100 U/ml de penicil·lina i 100 ug/ml d’estreptomicina en una incubadora de diòxid de carboni de 37 graus. Quan la confluència cel·lular va assolir el 85%, es va realitzar subcultura, xapa, intervenció i altres operacions.

 

1.2.2 Detecció d’immunoblot de proteïnes

1.2.2.1 Act i ECH Tractament

LC 3- ⅱ Nivell d’expressió de proteïnes en cèl·lules HepG2 BAFA1, com a inhibidor de la bomba de protons, pot provocar que la proteïna Lc 3- ⅱ s’agregui en grans quantitats en cèl·lules, amplificant així la capacitat d’inducció d’autofagia. Per tant, l'ús combinat de BAFA1 es pot utilitzar com a sistema de control d'autofàgia per avaluar la capacitat d'inducció d'autofagia. Les cèl·lules HepG2 de la fase de creixement logarítmica es van transferir a plats de cultiu cel·lular de 3,5 cm per al cultiu durant la nit. Es van utilitzar 100 μmol/L ACT, ECH i BAFA1 per a la intervenció durant 12 h. Les cèl·lules es van rentar amb solució de tampó fosfat pre-refrigerat (PBS) i es van lisar immediatament en tampó de lisi de proteïna RIPA durant 10 min. El sobrenedant es va centrifugar i es va determinar la concentració total de proteïnes mitjançant un kit d'assaig de concentració de proteïnes d'àcid bicinchoninic. Després de la quantificació amb tampó de sulfat de dodecil de sodi, la mostra es va escalfar a 95 graus durant 10 min per desnonar la proteïna. A continuació, es van prendre 30 µl de la mostra amb una micropipeta i es va electroforesar en un gel de poliacrilamida.
Després de l’electroforesi, la proteïna es va transferir del gel a una membrana de nitrocel·lulosa, bloquejada amb 1 0% de llet durant la nit, incubada amb un anticòs primari específic a temperatura ambient durant 1 h, es va rentar amb tampó fosfat que conté 0,5% de tritó i es va incubar amb un anticòs secundari específic a temperatura de la sala durant 1 h. El mètode ECL es va utilitzar per al desenvolupament del color. Es van establir com a grup de control en blanc, grup de rapamicina, grup ECH, grup ACT, Rapamycin+BAFA1 Group, ECH+BAFA1 Group i ACT+BAFA1 Group.

 

1.2.

La fase de creixement logarítmic Les cèl·lules HepG2 es van transferir a plats de cultiu cel·lular de 3,5 cm per al cultiu durant la nit, i 25, 50 i 100 μmol/L Act combinats amb BAFA1 es van utilitzar per al tractament de la intervenció durant 12 h i el nivell d’expressió de LC 3- ⅱ es va detectar la proteïna mitjançant immunoblot proteïna. El grup de control (grup Con, control en blanc), el grup de fam (grup STA, el tractament amb inanició de cèl·lules HepG2), 25, 50 i 100 μmol/L ACT Group i BAFA1 combinats amb 25, 50 i 100 μmol/L ACT Group.

1.2.3 Mètode MTT per detectar la taxa de supervivència de les cèl·lules HepG2 tractades amb diferents concentracions Act durant 24 i 48 h
Les cèl·lules HepG2 de la fase de creixement logarítmica es van inocular en una placa de pou 96- amb una densitat d'inoculació moderada i es va cultivar en una incubadora durant 12 h. Es van afegir 2 {{10}, 40, 60, 80 i 100 μmol/L ACT durant 24 i 48 h. La solució MTT de 0,5 mg/ml es va afegir en un entorn fosc i es va incubar en una incubadora. Després de 4 h, es va descartar el sobrenedant, es van afegir 100 µl de sulfoxid de dimetil a cada pou i es van agitar les cèl·lules en un agitador de temperatura constant a 37 graus durant 10 min. El valor de densitat òptica (OD) a una longitud d’ona de 490 nm es va detectar mitjançant un marcador enzimàtic i es va calcular la taxa de supervivència cel·lular.

 

1.2.4 Construcció in vitro del model de cèl·lules NAFLD

Es va pesar i es va dissoldre un cert pes de l’àcid palmític (PA) en un cert volum d’isopropanol per preparar una solució d’estoc de 100 mmol/L PA, que després es va dividir i es va emmagatzemar en un refrigerador {{1} grau per a un ús posterior. La solució d’estoc de PA es va diluir a 100 μmol/L mitjançant un medi de cultiu complet i es va afegir 1% d’albúmina sèrica bovina sense àcids grassos. Les cèl·lules es van incubar a 37 graus durant 3 h per preparar la solució d’inducció. Les cèl·lules HepG2 de la fase de creixement logarítmica es van transferir a un plat de cultiu cel·lular de 3,5 cm a una densitat adequada per al cultiu durant la nit, i després es va utilitzar la solució d’inducció preparada per a la intervenció.

 

1.2.5 Act Intervenció NAFLD Model de cèl·lules in vitro Detecció TG i tinció vermella O oli

 

1.2.5.1 Detecció de Tg

Les cèl·lules HepG2 de la fase de creixement logarítmica es van transferir a un plat de cultiu cel·lular de 3,5 cm per al cultiu segons el grup de control en blanc, el grup de models i el grup d'intervenció ACT. El grup model es va induir amb una solució d’inducció de 100 μmol/L PA i es va induir el grup d’intervenció ACT amb una solució d’inducció de 100 μmol/L PA i es va afegir 50 μmol/L ACT alhora. El temps d’intervenció va ser de 24 h. Retireu suaument l’antic medi de cultiu, renteu lentament la superfície de la cèl·lula amb PBS pre-refrigerada una vegada, afegiu-hi 100 µl/plat de solució de lisi RIPA pre-cool, plenament lise sobre gel durant 15 min, centrífuga a 4 graus i 12 000 r/min durant 10 min a les instruccions del kit TG i, finalment, corregiu el nivell de TG per mg de proteïna.

1.2.5.2 Oli Red O Tinking

Les cèl·lules HEPG2 de la fase de creixement logarítmica es van transferir a un plat de cultiu de 3,5 cm cobert amb una cobertura estèril per al cultiu durant la nit. 100 μmol/L PA va induir les cèl·lules per formar gotetes de lípids. Al mateix temps, es van afegir 50 μmol/L ACT per a la intervenció durant 24 hores.
Les diapositives cel·lulars es van recollir, es van rentar 3 vegades amb PBS pre-refrigerades, fixades amb un 4% de formaldehid a temperatura ambient durant 10 min, es va rentar la superfície de la cèl·lula amb PBS, va afegir la solució de treball de color vermell O oli preparada, tacada a temperatura ambient a la foscor durant 15 mines, aspirada a la solució de color vermell de petroli, va rentar la solució de sintonització amb un excés de tinció amb aigua doble, arrimada amb un 60% isopropanol, rent Aigua destil·lada i segellada i fotografiada al microscopi.

 

1.2.6 Observació d’immunofluorescència d’autofagosomes i gotes de lípids després del tractament ACT

Les cèl·lules HEPG2 de la fase de creixement logarítmica es van transferir a un plat de cultiu de 3,5 cm cobert amb una cobertura estèril per al cultiu durant la nit. Es va utilitzar 1 0 0 μmol/L PA per induir la formació de gotetes de lípids a les cèl·lules. Al mateix temps, es va afegir ACT per al tractament de la intervenció durant 24 hores. Les diapositives cel·lulars es van recollir, es van rentar 3 vegades amb PBS pre-refrigerat, es van fixar a temperatura ambient durant 10 min amb un 4% de formaldehid, permeabilitzats a temperatura ambient durant 15 min amb un buffer permeabilitzant que conté 0,1% de saponina, bloquejat a temperatura ambient durant 1 h amb sèrum de cabra, incubat a temperatura ambient durant 1 h amb LC 3-} anticodia específica, rentada 3 vegades amb un rent 3 de vegades amb un rent. PBS, i afegit amb un anticòs secundari específic marcat amb fluorescent, incubat a temperatura ambient i allunyat de la llum durant 1 h. Després de la incubació d’anticossos, les diapositives es van rentar 3 vegades amb PBS, es van contrarestar amb la sonda de la sonda específica de la gota de lípids 493/503 a temperatura ambient durant 10 min, es van rentar amb PBS i es van segellar amb medi de segellat anti-fading, es Es va establir el grup de control en blanc, el grup de tractament de la rapamicina i el grup d'intervenció ACT.

 

1.3 Anàlisi estadística

SPSS25. 0 Es va utilitzar el programari estadístic per a l'anàlisi de dades. Les dades quantitatives es van expressar com a x ± s. Es va utilitzar una anàlisi unidireccional de la variància i la prova LSD-T. P<0.05 was considered statistically significant.