Stx2 indueix l'expressió gènica diferencial i pertorba els gens del ritme circadià al túbul proximal

Resum: Escherichia coli productora de toxina Shiga(STEC) causa defectes tubulars proximals al ronyó. Tanmateix, encara no s'han demostrat factors alterats per la toxina Shiga (Stx) dins dels túbuls proximals. Vam determinar el receptor Stx Gb3 en ronyons murins i humans i vam confirmar l'expressió del receptor als túbuls proximals. Stx2-injectava teixits renals de ratolí iCèl·lules epitelials tubulars proximals renals primàries humanes tractades amb Stx2-es van recollir (RPTEC) i es va realitzar una anàlisi de microarrays. Hem comparat matrius de ronyons murins i RPTEC i hem seleccionat 58 gens comuns que s'expressen de manera diferent en comparació amb el control (0 h, sense tractament amb toxines). Vam trobar que el gen més expressat era el GDF15, que pot estar implicat en la pèrdua de pes induïda per Stx2-. Els gens associats a activitats Stx2 informades anteriorment, com ara la cinasa src Sí, l'activació de la via de fosforilació, la resposta proteica desplegada (UPR) i la resposta a l'estrès ribotòxic (RSR) van mostrar expressions diferencials. A més, els gens del rellotge circadià es van expressar de manera diferent, cosa que suggereix una alteració del ritme circadià renal induït per Stx2-. El transportador de glucosa de Na+ -tubular proximal regulat pel ritme circadià SGLT1 (SLC5A1) estava regulat a la baixa, cosa que indica un deteriorament funcional tubular proximal, i els ratolins van desenvolupar glucosúria confirmant la disfunció tubular proximal. Stx2 altera l'expressió gènica en túbuls proximals murins i humans mitjançant activitats conegudes i alteracions del ritme circadià recentment investigades, que poden provocar disfuncions tubulars proximals.

Paraules clau:Toxina Shiga tipus 2 (Stx2);túbul proximal renal; ratolí; cèl·lula epitelial tubular proximal renal humana (RPTEC); microarray; ritme circadià

Contribució clau:Es van analitzar gens expressats de manera diferent dels ronyons de ratolí tractats amb Stx2-i cèl·lules tubulars proximals primàries humanes. A més dels gens afectats amb Stx2-que es coneixien anteriorment, es va demostrar que els gens associats al ritme circadià alteraven la seva expressió i influïen en la funció tubular proximal.

1. Introducció

Escherichia coli productora de toxina ShigaLa infecció (STEC) causa símptomes greus de la síndrome hemolítica urèmica (SHU), que es defineix per la tríada d'insuficiència renal aguda, trombocitopènia i anèmia hemolítica [1]. Es creu que les toxines Shiga (Stxs) tenen un paper important en danyar les cèl·lules en aquesta malaltia infecciosa. La histopatologia renal característica del HUS inclou danys glomerulars i tubulars, com ara la deposició de fibrina capil·lar dins dels glomèruls i la necrosi tubular, respectivament [1,2]. S'ha informat de l'aparició de disfuncions anteriors als túbuls proximals de pacients infectats per STEC mitjançant l'anàlisi d'orina. Els marcadors urinaris funcionals tubulars proximalsN-acetil glucosaminidasa(NAG) i 2 microglobulines (2MG) de l'orina en fase aguda de pacients amb HUS associats a STEC O157- o O111-es van mesurar molt augmentades, cosa que suggereix una disfunció tubular proximal precoç [3].

Stxs, inclòs Stx2, consisteixen en una única subunitat A i cinc subunitats B (toxina A1B5), en les quals la subunitat A posseeix activitat enzimàtica depurinant l'adenina 4324 de l'ARNr 28S de la subunitat del ribosoma 60S, mentre que les subunitats B són necessàries per unir les cèl·lules hoste mitjançant globotriaosilceramida. (Gb3). Hi ha diverses influències conegudes que els Stx exerceixen sobre les cèl·lules. (I) En unir-se al seu receptor Gb3, la toxina provoca la transducció del senyal mitjançant la cinasa de la família Src Sí [4, 5]. Després d'unir-se al receptor, les Stx s'internalitzen a la cèl·lula per endocitosi i són transportades retrògradament a l'ER. Les Stx travessen l'endosoma i l'aparell de Golgi on la subunitat A és escindida entre els fragments catalítics A1 i A2 C-terminal per furina [6], tot i que els fragments A1 i A2 encara estan connectats amb un enllaç disulfur. La toxina arriba al RE i l'enllaç disulfur es pot reduir; després, s'allibera un fragment A1 de l'holotoxina [7,8]. És quan la influència de l'estrès ER (II) passa amb fragments de toxines que imiten proteïnes desplegades, que indueixen una resposta proteica desplegada (UPR). Tant les subunitats A com B són capaces d'unir Bip, cosa que és indicativa d'induir estrès ER [9, 10]. El fragment A1 escindit es trasllada al citoplasma i depura una adenina de l'ARNr 28S per inhibir (III) la síntesi de proteïnes. La modificació que Stxs provoca a l'ARNr 28S indueix (IV) una resposta d'estrès ribotòxica (RSR), que activa la cascada de senyalització aigües avall [11]. Se sap que les influències (II) i/o (IV) indueixen (V) una transcripció gènica particular que condueix a la secreció de citocines [12]. A més, (II) i (IV) estan implicats en (VI) l'apoptosi induïda per Stxs [13–15].

Els experiments in vitro que utilitzen túbuls proximals humans i models de ratolí in vivo connecten fortament els danys tubulars proximals amb Stxs. Tant els cultius primaris com les línies cel·lulars de túbuls proximals humans són altament susceptibles a Stxs i presenten alliberament de citocines i mort cel·lular, inclosa l'apoptosi [16–20]. Les cèl·lules epitelials tubulars proximals renals primàries humanes (RPTEC) expressen el receptor Gb3, són altament susceptibles a les toxines Shiga i s'han utilitzat en molts articles per analitzar reaccions biològiques com la inhibició de la síntesi de proteïnes, la producció de citocines i la inducció de l'apoptosi [17,20] . Els ratolins injectats amb la toxina Shiga tipus 1 (Stx1) van mostrar glucosúria, que indica una reabsorció reduïda de glucosa pel túbul proximal [21]. Aquests suggereixen la toxicitat de Stxs als túbuls proximals tant in vitro com in vivo. En els models de ratolí infectats per STEC, les troballes freqüents en histopatologia són la necrosi de les cèl·lules epitelials tubulars i les cèl·lules esborrades dins del lumen dels túbuls proximals [22–24]. Els ratolins injectats amb Stx purificats (ja sigui Stx1 o Stx2) també presenten descamació dels túbuls proximals amb nuclis relativament intactes [25–27].

Tot i que s'han descrit funcionalment i histològicament els danys dels túbuls proximals associats amb la injecció de Stx o la infecció per STEC, encara no s'han demostrat els objectius gènics implicats en la lesió dels túbuls proximals.

Aquí es van analitzar les expressions gèniques en ronyons de ratolí injectats amb Stx2-i en cultiu de cèl·lules epitelials tubulars proximals renals primaries humanes (RPTEC) tractats amb Stx2-per mostrar alteracions gèniques associades al túbul proximal induïdes per Stx2.

2. Resultats

2.1. Stx2-Patologia renal del ratolí injectat

Per identificar la patologia renal murina associada a Stx{{0}}, es van tacar seccions de teixit renal de ratolins injectats amb Stx{2- amb Àcid-Schiff periòdic (PAS). Una taca rosa clara i forta a la part luminal de les cèl·lules epitelials tubulars indica glicocàlix de la vora del raspall, que és característica de les cèl·lules tubulars proximals. Vam determinar les cèl·lules/nuclis fora del glicocàlix (dins de l'espai luminal) com a separats de les cèl·lules veïnes i les membranes del soterrani (és a dir, les cèl·lules esborrades). A la figura 1B (8 h després de Stx2), C i D (48 h després de Stx2), es mostren amb fletxes cèl·lules sloughed amb nuclis relativament intactes. També vam observar restes cel·lulars dins del lumen tubular proximal (caps de fletxa de la figura 1). Després de l'administració de Stx2, aquestes lesions van aparèixer amb força claredat, mentre que a les 0 h (figura 1A, sense Stx2), eren insignificants.

Figura 1. Stx2 indueix el despreniment de cèl·lules tubulars proximals al ronyó muri. Es mostren les taques de Schiff d'àcid periòdic (PAS) de seccions de ronyó murins injectades amb Stx2-. (A) 0 h (naïf), (B) 8 h i (C) 48 h després de la injecció de Stx2. Les fletxes indiquen l'exfoliació de cèl·lules tubulars proximals. Les puntes de fletxa indiquen restes cel·lulars. A (D) es mostra un camp ampliat dins de (C) amb cel·les de descamació apuntades amb fletxes. Les barres entre (A–C) indiquen 50 µm. La barra d'escala a (D) indica 10 µ

2.2. Expressió de Gb3 en ratolí i ronyons humans

2.2.1. Expressió de l'escorça renal Gb3 del ratolí

Com que les cèl·lules tubulars proximals van mostrar danys histològics per l'insult Stx2, vam provar l'expressió del receptor de globotriaosilceramida (Gb3) Stx2 a l'escorça renal murina juntament amb un marcador tubular proximal aquaporina -1 (AQP1). Tal com es mostra a la figura 2, les cèl·lules positives AQP1-exhibeixen positivitat Gb3 principalment al costat luminal de les cel·les (les cel·les estan marcades amb puntes de fletxa tancades, mentre que la llum es marca amb asteriscs). També vam observar que les taques tubulars negatives de Gb3 AQP1 presumiblement recullen cèl·lules del conducte (figura 2 cap de fletxa oberta) tal com es va informar [28]. La intensitat de la taca de Gb3 era més forta a les cèl·lules AQP1 (-), tanmateix, el nombre d'aquest tipus de túbuls era menor en comparació amb els túbuls proximals dobles positius Gb3/AQP1 a l'escorça. Les cèl·lules endotelials CD31-positives són Gb3 negatives al ronyó del ratolí. Com a control negatiu es va utilitzar un control d'anticossos coincidents amb isotip per a Gb3 (IgM de rata). La IgM de rata no va reaccionar amb el teixit renal del ratolí (figura S1)

2.2.2. Expressió Gb3 de l'escorça renal humana

En el teixit renal humà, Gb3 també va ser positiu en túbuls proximals positius AQP1-(figura 3, puntes de fletxa tancades). La localització de Gb3 dins de les cèl·lules tubulars proximals era més forta al costat luminal. També vam observar cèl·lules AQP1 (-) Gb3 (+) (figura 3, puntes de fletxa obertes) tal com vam fer al teixit murí. Les cèl·lules endotelials humanes expressen Gb3 (CD31/Gb3 doble positiu, figura 3, asterisc). Les seccions de control d'isotips amb IgM de rata no van mostrar una reacció positiva en el teixit renal humà (figura S2).

2.3. Anàlisi de microarrays

Com que tant les cèl·lules epitelials tubulars proximals del ratolí com les humanes són positives per a Gb3, suggereix que aquest tipus de cèl·lules es veu afectat directament per Stx2. Per tal de determinar els gens afectats per Stx2-a les cèl·lules tubulars proximals murines i humanes, vam extreure l'ARN total dels ronyons de ratolins injectats amb Stx2-i els RPTECs primaris humans tractats amb Stx{2-i analitzat. expressió gènica per microarrays

2.3.1. Gens expressats de manera diferent tant al ronyó del ratolí com al RPTEC

Es van seleccionar gens expressats de manera diferencial (DEG), que són comuns tant als ronyons del ratolí com als RPTEC. La base de la selecció de DEG comuns és que (1) gens amb un canvi log2-fold (contra 0 h) més d'1 o menys de -1 tant al ronyó del ratolí com al microarray RPTEC almenys en un el punt de temps i (2) la distribució del canvi log2-fold d'un gen s'ajusta a les corbes cúbiques en lloc de les corbes quadràtiques per adaptar-se millor als pics d'expressió gènica a la meitat del temps al microarray renal. Amb els dos criteris anteriors, vam seleccionar 58 gens comuns entre el ronyó de ratolí tractat amb Stx2-i el RPTEC humà (figura 4A). Els patrons d'expressió d'aquests 58 gens al ronyó del ratolí es mostren en un mapa de calor (figura 4B). La majoria dels gens van ser regulats en hores posteriors després de la injecció de Stx2; tanmateix, alguns gens tenien patrons d'expressió anteriors. Els gens que tenien més d'1 canvi en log2-plicació es van enumerar per a cada moment (taula 1).

Figura 4. Anàlisi de microarrays. (A) Entre els gens analitzats per microarrays, 147 gens (encerclats verds) i 4013 gens (encerclats vermells) del ronyó de ratolí tractat amb Stx2-i RPTEC, respectivament, es van detectar com a log{{ {4}}canvi de vegades inferior a -1 o més d'1. Els gens que van ser alterats pel tractament Stx2 contra 0 h en ambdós microarrays (gens/DEG comuns expressats de manera diferencial) van totalitzar 58 (àrea superposada vermella i verda). (B) El mapa de calor dels 58 gens comuns es mostra a la línia de temps de mostreig de ronyó del ratolí. Z és igual a 0 denota una mitjana dels valors de canvi de logaritme2-fold d'un gen i reflecteix una tendència d'expressió gènica. Així, un color verdós representa un valor inferior a la mitjana d'un gen concret seguit, mentre que un color vermellós representa un canvi per sobre de la mitjana. Les dades de registre2-fold dels 58 gens del conjunt de dades de 72 h injectat amb PBS en comparació amb 0 h es presenten com a taula S3 com a referència. (C) Es mostra el gràfic de barres d'enriquiment de Metascape GO. L'eix X mostra valors de -log10 p de termes GO enriquits a través de 58 DEG comuns que un nombre més elevat del terme GO enriquit és més rellevant per al sistema. Es mostren els 20 termes GO enriquits més importants. (D) L'anàlisi de STRING de 58 DEG comuns es mostra als sis clústers més connectats/relacionats. Els colors esfèrics denoten gens que pertanyen al mateix clúster. Les relacions d'accions entre gens es mostren de manera codificada per color i forma final. ENSG00000279576 s'ha codificat ara com ENSP00000485396, que denota l'ID humà del gen MALAT1.

Per analitzar la funcionalitat dels DEG comuns, hem utilitzat la plataforma Metascape. Assigna termes d'ontologia gènica (GO), que consisteixen en funció molecular, component cel·lular i procés biològic, als gens seleccionats. Vam dipositar els 58 DEG comuns a Metascape i vam obtenir els 20 termes GO principals als quals pertanyen aquests DEG (figura 4C). Els termes GO es llisten amb els gens corresponents a la taula S1. Per veure una llista de gens dins de cada terme GO que es mostra a la figura 4C, consulteu l'enriquiment de Metascape de la taula S2. Els termes GO associats a la mort cel·lular, la inflamació i les cascades de senyalització es van classificar entre els 20 primers com s'esperava; tanmateix, el ritme circadià va cridar l'atenció com a terme GO nou. Es van mostrar connexions conegudes de gens comuns amb l'anàlisi STRING (figura 4D). En aquesta anàlisi, els gens es van agrupar en sis grups diferents que es van tenir en compte amb una forta associació d'unió, influències (catàlisi, activació o inhibició), així com la coexpressió de gens.

2.3.2. Tendència de l'expressió gènica

Els rastres de diverses expressions gèniques es mostren als gràfics amb l'eix x durant el temps (h) després de la injecció de Stx2 i l'eix y per al canvi de vegades logarítmica 2- contra 0 h (figura 5). Per tant, el valor de l'eix y és igual a 1 significa un canvi de 2-plegament en funció de l'expressió 0 h.

Figura 5. Gens expressats de manera diferencial amb línia de temps de mostreig de ratolí. (A) Es mostren els patrons d'expressió d'ARNm de PDK4 i CEBPB. (B) gens immediats primerencs. (C) Expressions de proteïnes matricel·lulars CYR61 (CCN1) i CTGF (CCN2). (D) Es mostren els gens relacionats amb UPR DDIT3 (CHOP, GADD153), el soci d'unió DDIT3 CEBPB i el factor de retroalimentació negativa PPP1R15A (GADD34). (E) Es mostren els factors de transcripció DDIT3 (CHOP, GADD153) i ATF3 i GDF15, que estan regulats transcripcionalment per aquests factors. (F) Es mostren els gens associats a UPR i RSR. (G) Es dibuixen EDN1 en relació amb els gens UPR. (H) Es mostren els primers pics d'EDN1 i EGR1 i el següent pic de PER1 amb un augment gradual posterior dels tres gens. (I) Els gens del cúmul morat de la figura 4D són gens relacionats amb el ritme circadià. (J) Es mostren els gens centrals circadians PER1, Arntl (BMAL1), Cry1 i Clock. (K) Es mostren els gens renals regulats pel rellotge circadià i PER1. (L) Es mostren gens inflamatoris amb gens relacionats amb la via NF-kB. Per veure els punts de dades log2 individuals, consulteu la figura suplementària S4. La figura S5, que mostra el log2 mitjà amb barres de desviació estàndard, es presenta com a referència.

Servei de suport de Wecistanche: el major exportador de cistanche a la Xina:

Correu electrònic:wallence.suen@wecistanche.com

WhatsApp/Tel:+86 15292862950}

Compreu per obtenir més detalls de les especificacions:

https://www.xjcistanche.com/cistanche-shop

ACONSEGUIR EXTRACTE DE CISTANCHE ORGANIC NATURAL AMB 25% ECHINACOSIDE I 9% ACTEOSIDE PER A LA INFECCIÓ RENOLÓ