Espectroscòpia d'alta resolució de terahertz de productes de descomposició tèrmica de gasos de plasma sanguini diabètic i no diabètic i pellets de teixit renal
Mar 28, 2022
Contacte:joanna.jia@wecistanche.com/ WhatsApp: 008618081934791
Resum
Importància:Una de les tendències modernes en el diagnòstic mèdic es basa en la metabolòmica, un enfocament que permet determinar els metabòlits que poden ser les característiques específiques de la malaltia. L'espectroscòpia de gas d'alta resolució permet investigar el contingut de metabòlits gasosos de mostres d'origen biològic. Presentem l'elaboració d'un mètode d'estudi de mostres biològiques diabètics i no diabètics, preparades en forma de pellets, mitjançant espectroscòpia d'alta resolució en terahertz (THz).
Objectiu:La idea principal del treball és estudiar el contingut dels productes gasosos de descomposició tèrmica de secs diabètics i no diabètics.plasma sanguiniiteixits renalsper revelar el conjunt de marcadors de gasos que van caracteritzar la diabetis pel mètode d'espectroscòpia d'alta resolució THz.
Enfocament:Presentem una aproximació per estudiar els diabètics i els no diabèticsplasma sanguini(humans i rates) iteixits renals(rates), utilitzant espectroscòpia d'alta resolució basada en l'efecte no estacionari del rang de freqüències THz. Es van desenvolupar els mètodes de preparació de mostres de sang i teixit renal en forma de pellets i de vaporització de les mostres.
Resultats:Les mesures dels espectres d'absorció rotacional dels vapors en escalfar els pellets preparats a partir de sang iteixit renales van dur a terme en el rang de freqüències de 118 a 178 GHz. Es van detectar i identificar les línies d'absorció que apareixen als espectres dels vapors de la mostra. Els continguts moleculars dels productes de descomposició tèrmica variaven per a mostres no diabètics i diabètics; Per exemple, el marcador principal és l'acetona que apareix a la sang dels diabètics (humans i rates) i a la sang dels diabètics.teixit renal.
Conclusions: El nostre article il·lustra la capacitat potencial per determinar el contingut de metabòlits de mostres biològiques per al diagnòstic i el pronòstic de malalties per a la medicina clínica. © Els Autors. Publicat per SPIE sota una llicència Creative Commons Attribution 4.0 Unported License. La distribució o reproducció total o parcial d'aquesta obra requereix l'atribució completa de la publicació original, inclòs el seu DOI. [DOI: 10.1117/1.JBO.26.4.043008] Paraules clau: espectroscòpia de terahertz d'alta resolució; descomposició tèrmica; teixit;plasma sanguini; diabetis; liofilització.
Paraules clau:espectroscòpia de terahertz d'alta resolució; descomposició tèrmica; plasma sanguini; diabetis; liofilització, teixit renal.
1. Introducció
En l'actualitat, la problemàtica del diagnòstic de malalties d'importància social (diabetis, malalties cancerígenes, etc.), inclosa la fase inicial, atrau la gran atenció dels grups científics del món.Un dels nous enfocaments que obren noves possibilitats en el diagnòstic i el tractament de diverses malalties és la metabolòmica. La metabolòmica és un camp de la ciència que investiga els productes metabòlics finals i intermedis d'un sistema biològic (cèl·lula, òrgans o organisme sencer). La metabolòmica pot revelar els metabòlits que poden ser les característiques específiques de la malaltia i poden tenir un paper important en el diagnòstic i el pronòstic d'una malaltia. Els mitjans, que contenen els productes metabòlics finals i intermedis de l'organisme humà i útils per revelar els metabòlits associats a malalties i patologies, són l'alè exhalat, la sang, l'orina, la saliva, etc.
Una de les malalties socialment importants que amenacen la qualitat de vida de les persones és la diabetis. La diabetis mellitus tipus 2 abans era una malaltia d'edat mitjana, però ara es diagnostica en adults, joves i nens. Els resultats de les investigacions metabolòmiques de mostres de sang i orina de pacients amb diabetis a partir de 18 anys així com de nens d'1 a 13 anys es presenten a Human Metabolome Database (HMDB).1 Principalment, sang (21 substàncies químiques incloent isòmers), orina ( Es van investigar 30 substàncies químiques, inclosos els isòmers) i el líquid cefaloraquidi (1 substància química). Per exemple, es va detectar àcid (R)-3-hidroxibutíric en els tres tipus de fluids. Algunes substàncies (àcid acetoacètic, D-fructosa i D-glucosa) es van detectar en ambdós líquids (sang i orina). El tret més característic de la diabetis (acetona, CH3COCH3) només estava present per a l'orina. Les mostres de líquids, els resultats de les investigacions presentades a HMDB, s'han investigat per diversos mètodes: cromatografia de gasos;2 cromatografia de gasos amb espectrometria de masses;3,4 cromatografia gas-líquid amb espectrometria de masses;5 espectroscòpia nuclear d'alta resolució. ressonància magnètica de protons;6 i mètodes que utilitzen els dispositius especials per al control de l'estat del pacient amb diabetis, el sistema de control continu de la glucosa.7
El desenvolupament de la malaltia renal crònica és una de les principals complicacions de la diabetis mellitus. Tot i que la determinació de l'albúmina glicada és l'enfocament habitual del cribratge, el dany renal pot començar molt abans que apareguin canvis clínicament significatius en l'albúmina d'orina. Tenint en compte la patogènesi multifactorial de la malaltia renal crònica, s'han considerat diversos marcadors per a la seva detecció8,9. No obstant això, el seu valor diagnòstic sense biòpsia renal semblava dubtós.
L'enfocament espectroscòpic pot proporcionar informació sobre el contingut de les mostres biològiques que es poden utilitzar per al diagnòstic mèdic. El rang de freqüències de terahertz (THz) és molt important per estudiar els gasos, líquids i teixits dels organismes vius. Hi ha algunes revisions dedicades a les aplicacions dels mètodes del rang de freqüències THz, inclosa l'espectroscòpia en el domini del temps THz, la reflectometria THz i la imatge THz per a la biologia i la medicina.10
L'espectroscòpia en el domini del temps THz permet detectar els espectres, on el coeficient d'absorció o índex de refracció té unes característiques espectrals corresponents a la presència d'algunes biomolècules (proteïnes, sucres, etc.) a les mostres o a les seves diferents concentracions.11
L'espectroscòpia d'absorció molecular i, en particular, l'espectroscòpia de gasos THz és un enfocament molt prometedor per a investigacions de mescles de gasos multicomponents de diversos orígens.12 Les mostres en estat líquid i sòlid es poden investigar per vaporització o descomposició tèrmica. Els metabòlits-marcadors de malalties socialment importants (diabetis, càncer, etc.) es poden revelar per les seves línies espectrals en els espectres d'absorció realitzats en la transmissió de radiació a través de mostres de gas.
El nivell d'acetona en mostres d'alè i orina exhalats preses dels pacients amb diabetis (12 persones) es va mesurar mitjançant un espectròmetre de rang de terahertzs amb canvi de fase de la radiació actuant. Els experiments es van fer en col·laboració amb el Centre Nacional d'Investigació Mèdica d'Almazov. Les mesures es van realitzar a les línies d'absorció d'acetona amb freqüències centrals de 150,537 i 151,647 GHz. Les mesures es van realitzar sense calefacció. L'anàlisi simultània de les mostres d'alè exhalat i d'orina de pacients amb diabetis va revelar que el nivell d'acetona a l'orina era molt més alt que en l'alè espirat, en alguns casos un ordre de magnitud superior.13,14.
Els resultats de les investigacions d'espectroscòpia de gasos d'alta resolució de THzplasma sanguinide pacients i rates (condicionalment sanes i amb diabetis) així com de la ratateixit renal(sana i amb diabetis) es presenten secs i premsats a pellets. Els teixits oplasma sanguinid'organismes vius, sense cap preparació, s'han d'investigar immediatament després del mostreig. La preparació com a pellets permet la investigació després d'un temps suficientment llarg després de la presa de mostres de sang o de la biòpsia renal.
2 Experiments i metodologia
2.1 Mètode per a la preparació de pellets de plasma sanguini i pellets de ronyó
La sang venosa de pacients amb diabetis mellitus tipus 2 i participants condicionalment sans es va recollir al departament d'endocrinologia del Centre Nacional d'Investigació Mèdica d'Almazov; el centre ofereix atenció mèdica a pacients diabètics. Tres pacients i dos participants eren homes, de la mateixa edat (de 39 a 43 anys). Tots els protocols experimentals utilitzats en aquesta investigació van ser revisats i aprovats pels pacients i participants i la Comissió d'Ús del Centre Mèdic. La sang venosa es va recollir al matí després de 8 a 12 hores de dejuni en un tub amb l'anticoagulant K3EDTA (Vacutest Kima, Itàlia). Es va obtenir plasma per a l'anàlisi de paràmetres bioquímics mitjançant la centrifugació de sang sencera a 3000 rpm durant 15 min en una centrífuga de laboratori (Eppendorf 5702R, Alemanya) a una temperatura de +4 graus. Valors dels paràmetres bioquímics deplasma sanguiniles mostres i els intervals de referència es presenten a la taula 1 (el nivell d'hemoglobina glicada es va obtenir a la sang sencera). La taula 1 mostra que la concentració de glucosa, triglicèrids i hemoglobina glicada en les mostres d'un pacient amb diabetis augmenta 1,5, 2 i 2,3 vegades, respectivament.
L'estudi també es va dur a terme amb rates mascles Wistar a l'edat de 8 setmanes i amb un pes de 180 a 200 g, segons el protocol d'estudis experimentals aprovat per la Comissió de Cura i Ús d'Animals de l'Institut de Medicina Experimental del Centre Nacional d'Investigació Mèdica Almazov. El nivell de glucosa en animals del grup experimental va ser de 21 mmol ∕ l després de 120 min després de la càrrega de glucosa. Es van utilitzar rates intactes com a grup control. Es va recollir sang venosa de la vena cava inferior abans que els animals fossin sacrificats. També s'ha recollit el ronyó. Es van recollir mostres de sang en tubs que contenien un anticoagulant.
Les mostres de prova es van congelar a una temperatura de -80 graus (refrigerador de baixa temperatura DW-86L388A, Haier, Xina). Després es va liofilitzar mitjançant la liofilització Vaco 2 (ZirBus, Alemanya) a una temperatura de -50 graus i una pressió de 3 Pa. La congelació es realitza abans de la liofilització, ja que, durant la liofilització sota la influència d'una pressió interna elevada, els components biològics poden ser destruït. Les mostres seques eren una esponja formada per cristalls biològics. L'esponja va ser destruïda per una espàtula metàl·lica i es va triturar en cristalls amb una mida de diverses desenes de micròmetres. L'ús d'un morter i una mà de morter era impossible, ja que la trituració de les proteïnes en la composició de les mostres provocaria la seva adhesió no desitjada i la formació de grànuls rodons.
La pols de mostres liofilitzades es va pesar (balança analítica OHAUS Discovery, Suïssa) i després es va col·locar en un motlle de premsa d'acer. Utilitzant premses de laboratori (Angkor, Rússia i Specac, Regne Unit) a una determinada pressió d'emmotllament, elplasma sanguinies van obtenir pellets i pellets de ronyó. Cada cristall de pellets conté un percentatge determinat de greixos (triglicèrids), proteïnes (albúmina) i fibrinogen, tots ells normals o glicats (en el cas diabètic). Els pellets de mostres del grup control d'ara endavant s'anomenen "pellets no diabètics" i els pellets de mostres delEl grup diabètic d'ara endavant s'anomena "pellet diabètic".
Configuració experimental d'espectroscòpia d'alta resolució de 2,2 THz
L'espectroscòpia THz d'alta resolució basada en efectes no estacionaris permet analitzar la composició dels components de les mescles de gasos multicomponent de gas i vapor. Els espectròmetres proporcionen una sensibilitat propera al límit teòric amb una resolució limitada només per l'efecte Doppler i poden registrar processos ràpids. La sensibilitat es conserva fins i tot amb una disminució substancial de la pressió del gas i és d'aproximadament 0,2 ppb en el mode d'exploració per a alguns gasos (per exemple, amoníac a les mesures de la línia d'absorció prop de la freqüència de 572 GHz). A més, permet determinar la composició dels components d'una mescla de gas amb alta fiabilitat.12 S'ha realitzat un estudi dels productes de descomposició tèrmica dels pellets mitjançant el mètode de l'espectroscòpia de gas no estacionari THz del rang de 118 a 178 GHz. L'espectròmetre utilitza un bucle bloquejat en fase per al control automàtic de la freqüència de la llum d'ona endarrera i el canvi de fase, el registre en el domini del temps, la mitjana i el processament del senyal de transició espectroscòpica. El dispositiu registra un senyal en el domini temporal. El vapor de les mostres es va analitzar mitjançant el procediment següent. Els pellets es van col·locar en un tub d'assaig, amb bomba de buit, es van escalfar gradualment un tub d'assaig (fins a 240 graus) i la barreja resultant de productes de descomposició tèrmica de la mostra es va deixar a la cèl·lula de mesura. Un fitxer de dades sol incloure enregistraments d'un rang de funcionament seleccionat o total de l'espectròmetre. Per tant, les substàncies es poden identificar mitjançant línies d'absorció que apareixen a l'espectre total de la mostra i la dinàmica de les concentracions en una mescla es pot rastrejar comparant diversos fitxers de dades. Les substàncies es van identificar cercant-les a bases de dades de codi obert MW, mmw i THz.15,16.
3 Anàlisi de vapors de plasma sanguini i vapors renals amb espectròmetre de terahertz d'alta resolució
Amb els nostres sistemes THz-TDS, hem mesurat la transmissió de pellets en el rang espectral de 0,2 a 1,4 THz,17, però sabem que les biomolècules i en particular els seus productes de descomposició en estat gasós tenen una resposta informativa (absorció rotacional). espectres) a aquestes freqüències i també més baixes, per la qual cosa vam realitzar un estudi addicional sobre l'espectròmetre de gasos d'alta resolució THz. Les línies d'absorció detectades de substàncies en humans diabèticsplasma sanguinicoincideixen amb substàncies de humans no diabèticsplasma sanguini, excepte l'acetona. Hi ha moltes línies d'absorció d'acetona que es troben en el rang de freqüència de treball de l'espectròmetre (118 a 178 GHz). En general, és més que suficient detectar alguna línia d'absorció d'una substància per a la determinació inequívoca de la presència de la substància a la mescla de gasos multicomponent. A la figura 1 es mostra un exemple d'enregistrament de parts dels espectres d'absorció amb la línia d'absorció de l'acetona. L'acetona pot aparèixer a la sang quan es produeix un trastorn del metabolisme dels carbohidrats. Com s'apunta a la literatura, la sang dels pacients amb diabetis contenia -OH-butirat i acetoacetat, però més tard aquestes substàncies es van descompondre en acetona i diòxid de carboni.18 El diòxid de carboni no té moment dipolar; per tant, no té transicions de rotació. El seu contingut augmentat només es pot detectar estudiant l'espectre vibracional de la mostra en el rang IR.
Es van detectar substàncies de vapor de plasma, com el sulfur de carbonil (OCS), el diòxid de sofre (SO2), l'àcid fòrmic (HCOOH), l'àcid isociànic (HNCO) i l'amoníac (NH3), tant en mostres humanes amb diabetis com en humans no diabètics. En alguns casos, hi ha una línia experimental detectada als espectres de la mostra corresponent a més línies d'una per a una substància (p. ex., àcid isociànic) a les dades del catàleg (vegeu la taula 2).15,16.
Això s'explica pel fet que els catàlegs contenen dades sobre les estructures hiperfines de les substàncies que no es resolen en aquest experiment ja que les línies tenen una amplada finita de l'ordre de diversos centenars de kHz. Les línies d'absorció obtingudes de les substàncies estudiades coincideixen amb els espectres d'absorció de vapors de sang capil·lar iplasma sanguinide pacients amb diabetis i participants condicionalment sans que es van publicar en el nostre treball anterior.19 Les substàncies gasoses detectades podrien haver-se format durant la preparació de la mostra com a productes de la transformació química dels aminoàcids. La qüestió de si aquests compostos tenen valor diagnòstic requereix investigació. En la pràctica clínica en diabetologia, encara no s'utilitza l'anàlisi del contingut d'aquestes substàncies.
Els vapors de laplasma sanguinide rates sanes contenien sulfur de carbonil (OCS), metanetiol (CH3SH), butironitril (C3H7CN), acetaldehid (CH3CHO) i àcid fòrmic (HCOOH). La mostra deplasma sanguinide rates diabètiques es va diferenciar per la presència d'acetona. A més de les línies d'absorció de propionitril (C2H5CN), es va detectar formiat de metil (CH3OCHO).
Les mostres de vapors de pellets secs de rates sanes i diabétiques.teixits renalsvan ser estudiats. Els vapors deteixit renalde rates sanes contenen sulfur de carbonil (OCS), diòxid de sofre (SO2), àcid fòrmic (HCOOH), àcid isociànic (HNCO), formiat d'etil (C2H5OCHO) i propilenglicol (CH2ðOHÞCHðOHÞCH3). El contingut de vapor de la rata diabèticateixit renales va diferenciar de la rata sana per la presència no només de sulfur de carbonil (OCS), sinó també del seu isotopòleg OCS-34. També es van detectar acetaldehid (CH3CHO), metanetiol (CH3SH), sulfur d'etilè (C2H4S), metanol (CH3OH) i glicolaldehid (CH2ðOHÞCHO) en els vapors d'un pellet de rata diabètica.teixit renal(vegeu Fig. 2 i Fig. 3).
La presència de compostos de sofre, com el metanetiol, es pot especificar per la descomposició tèrmica dels aminoàcids de sofre (metionina, cisteïna i cistina) a la composició de proteïnes de la sang. La metionina és un aminoàcid essencial que no es sintetitza en els organismes humans. S'obté dels aliments i és una font de sofre per a la biosíntesi de cisteïna. Quan els aminoàcids de sofre es van escalfar a temperatures d'uns 240 graus, es van detectar metanetiol i sulfur d'etilè (descomposició de metionina) en l'espectre de masses d'aquestes substàncies.20
4 Conclusió
El contingut molecular d'humà i rataplasma sanguinii ratateixit renaldurant la descomposició tèrmica de les mostres es va estudiar mitjançant l'espectròmetre d'alta resolució THz. Es va presentar el mètode de preparació de les mostres biològiques com a pellets. Aquest mètode ofereix la possibilitat d'emmagatzemar i transportar mostres. L'espectroscòpia de gasos d'alta resolució permet determinar el contingut de mescles de gasos multicomponent de qualsevol origen, inclosa la biològica amb concentracions de traces de components gasosos. Es va detectar acetona en diabèticsplasma sanguinimostres. Informació sobre la diferència de contingut entre diabètics i sansplasma sanguinid'homes i rates i rata diabètica i sanateixits renalses va obtenir a partir d'espectres de rotació d'absorció de vapors. L'ús de l'espectroscòpia d'alta resolució THz proporciona una anàlisi qualitativa del contingut de components de mostres de vapors de sang iteixits renalspellets. La possibilitat de realitzar l'estimació quantitativa de concentracions d'importants marcadors de gas de diabetis en funció de l'estat dels pacientss'hauria d'estudiar en investigacions posteriors.
