L'eficàcia sensible a l'edat de la restricció calòrica sobre la biogènesi mitocondrial i el dany de l'ADNmt al fetge de rata 2

Siusplau contactaoscar.xiao@wecistanche.comper a més informació

2.4.Efecte de l'edat i la CR sobre el contingut i el dany de l'ADNmt

Com que la dinàmica mitocondrial està estretament relacionada amb el manteniment de l'ADNmt [16, 18], vam determinar el contingut d'ADNmt a totes les rates mitjançant la reacció en cadena de la polimerasa quantitativa (qPCR) (Figura 8).

Es va trobar una disminució relacionada amb l'edat del contingut d'ADNmt a les rates AL-28(-27 per cent) i AL-32 (-23 per cent ) en comparació amb l'AL{{ 5}} animals, mentre que no hi havia cap diferència estadística entre els grups AL-28 i AL-32. CR va ser molt eficaç per prevenir la disminució relacionada amb l'edat del contingut d'ADNmt només als 28 mesos, donant lloc a un augment del valor (més un 19 per cent) al grup CR-28 en comparació amb el homòleg d'edat alimentat amb AL. A més, no hi va haver cap diferència estadística entre el valor AL-18 i el del grup CR-28. Com s'ha vist per a altres marcadors en el present treball, CR no va ser tan eficaç als 32 mesos, ja que no hi havia cap diferència entre el valor AL-32 i el de la contrapart CR-32. Per tal d'aprofundir l'anàlisi a nivell de dany a l'ADNmt, vam mesurar el contingut relatiu de la "supressió comuna" de 4, 8 Kb mitjançant qPCR (figura 9).

No es van trobar canvis significatius amb l'edat ni amb la CR en el contingut relatiu de la supressió de 4,8 Kb en tots els grups provats.

Finalment, vam examinar tres regions específiques de l'ADNmt per a la incidència de purines oxidades, principalment 8-oxo-desoxiguanosina (8-òxid), utilitzant l'enzim sensible a les purines oxidades formamidopirimidina ADN glicosilasa (Fpg). Les tres regions abastaven, respectivament, el bucle de desplaçament (bucle D), l'origen de la replicació de la cadena de llum (Ori-L) i parts de la subunitat 1 i 2 de la NADH deshidrogenasa (ND) (ND1/ND2) ( Figura 10).

Feu clic aquí per saber-ne més

Com es mostra a la figura 10, el percentatge d'incidència d'òxid 8-va ser significativament diferent entre els grups de rates de cada regió analitzada, tot i que amb un patró similar. La prova post-doc va revelar la importància de la presència reduïda d'{3}}òxid en rates CR-28 en comparació amb els grups AL{-18 i AL{-28 ({{7} } per cent de CR-28 contra AL-18 i-43 per cent de CR{-28 contra AL-28 al bucle D;-48 per cent de CR -28 contra AL-18i-49 per cent CR-28 vs.Extracte de Cistanche Anti RadiacióAL-28 a l'Ori-L;-54 per cent CR-28 contra AL-18 i -56 per cent CR-28 contra AL{{ 7}} a ND1/ND2).CR va demostrar ser eficaç per prevenir el dany oxidatiu de l'ADNmt fins a 28 mesos, mentre que la incidència del mateix dany no va ser diferent entre AL-32 i CR-32 rates. Les purines oxidades ja es van detectar en rates AL-18 sense mostrar un augment relacionat amb l'edat en els animals AL-28. La comparació entre el grup AL-32 i el grup CR-32 no va mostrar una diferència significativa. Tenint en compte els valors de la regió específica, és interessant destacar que la incidència del bucle D va ser la més alta entre els valors de les regions provades a cada grup, donant suport a les troballes anteriors que indiquen aquesta regió com un punt calent per al dany oxidatiu [17,{{ 20}}].

Figura 10. Incidència del dany de les purines oxidades a les regions d'ADNmt del bucle D, Ori-L i ND1/ND2 al fetge de AL-18, AL-28, CR-28, AL -32 i rates CR-32-d'un mes. (A). Les barres representaven les dades obtingudes de dos experiments independents realitzats per triplicat i analitzats mitjançant la prova ANOVA unidireccional i la prova de comparació múltiple de Tukey. A la representació gràfica, les dades s'han normalitzat amb el valor de les rates AL-18, fixat com a 1 i mostrat com a valor mitjà i SD.*p<0.05 versus=""><0.05versus al-28="" rats.n:="" number="" of="" analyzed="" animals.="" (a)d-loop;(b)ori-l;(c)="" nd1/nd2.(b).representative="" gel="" of="" formamidopyrimidine="" dna="" glycosylase="" (fpg)-treated="" and="" untreated="" total="" dna="" from="" one="" cr-28="" and="" one="" al-28="" rat;="" 5="" ng="" total="" dna="" were="" amplified="" using="" the="" d-loop="" primers.="">cistanche herbaEs va carregar una alíquota de cada amplificació per PCR al gel tenyit amb bromur d'agarosa etidio i es va analitzar per a les intensitats de la banda.

Totes les troballes informades sobre l'eficàcia de la CR en els grups d'edat es van resumir a la taula 1.

3. Discussió

En la recerca de llarga durada d'enfocaments capaços de contrarestar el progressiu declivi de l'envelliment, la CR ha adquirit una rellevància primordial a causa dels seus efectes positius, reportats en una àmplia sèrie d'organismes que van des del llevat fins a l'home [22]. S'ha demostrat que la CR afecta un gran nombre de vies moleculars. Entre aquests, alguns són especialment eficaços en la modulació de la biogènesi i l'activitat mitocondrial, com els que detecten nutrients i/o nivells d'energia com la cinasa dependent de l'AMP (AMPK) i les sirtuïnes, en què totes cooperen amb la reprogramació mitocondrial induïda per CR. metabolisme [23]. En millorar el metabolisme oxidatiu, la CR redueix la producció mitocondrial de ROS i els danys moleculars induïts per l'augment relacionat amb l'edat d'aquestes espècies reactives [8-10]. Tot i que diversos estudis van investigar els efectes de la CR a nivell mitocondrial [3,13-15,24], encara falta un treball exhaustiu sobre els efectes d'aquesta intervenció nutricional sobre els orgànuls. Per tant, aquest estudi va intentar provar l'existència de límits per a l'eficàcia de CR en un gran conjunt de marcadors mitocondrials. En particular, ens vam centrar en la comparació entre els efectes induïts per aquest règim dietètic en rates grans (28-mes) i extremadament (32-mes) per verificar si existeix una interacció entre CR. i la progressió de l'envelliment. L'anàlisi dels resultats va revelar una imatge complexa de l'eficàcia de la CR sobre la biogènesi mitocondrial i el dany de l'ADNmt, que s'ha resumit a la taula 1.

Cistanche pot anti-envelliment

3.1.Marcadors mitocondrials en rates de 28-mes d'edat

Un gran nombre de marcadors mitocondrials es va veure afectat positivament per la CR en rates de 28-mesos. És a dir, es van informar de disminucions relacionades amb l'edat en l'activitat de la citrat sintasa, en les quantitats de proteïnes de TFAM, MFN2 i DRP1 i en el contingut d'ADNmt comparant el grup control AL-18 amb el AL-28. . Tots aquests canvis es van evitar per CR en rates de 28-mes d'edat (CR-28). Aquests resultats donen suport a l'efecte anti-envelliment de CR fins a aquesta edat en el fetge de rata. De la mateixa manera, la disminució de la incidència de purines oxidades a les tres regions d'ADNmt analitzades, induïda per CR, reforça encara més aquesta visió. Cal destacar que aquest dany oxidatiu ja estava present en els animals AL-18 sense cap augment relacionat amb l'edat de les rates AL-28, cosa que suggereix que la seva aparició es pot identificar com un marcador primerenc de l'envelliment. Cal prestar una atenció especial als cinc marcadors mitocondrials que no es van veure afectats per CR en rates de 28-mesos, és a dir, les quantitats de proteïnes de LonP1. Cvt c, OGGl i APE1 i el contingut d'eliminació de 4,8 Kb. De fet, pel que fa a LonP1 i Cyt c, CR no va evitar la disminució relacionada amb l'edat que es trobava en els animals AL-28, mentre que les quantitats de proteïnes d'OGG1 i APE1, així com el contingut de supressió de 4,8 Kb, no eren. afectat per l'edat ni per CR. LonP1 és responsable de la degradació del TFAM esgotat [25-27] i s'ha informat que disminueix amb l'envelliment [28] al fetge de rata [29] fins als 27 mesos d'edat. Abans vam suggerir que aquesta expressió disminuïda per l'envelliment de LonP1 [16] podria estar relacionada amb la seva activitat en l'eliminació de TFAM no unit a l'ADNmt [26]. Com a possible explicació de la ineficàcia de la CR per prevenir la disminució relacionada amb l'edat de l'expressió LonP1, malgrat l'expressió de TFAM restaurada i la unió de TFAM a regions específiques de l'ADNmt (dades actuals i Picca et al. [15]), és la CR. activació mediada de Sirt3 [30] que podria haver influït també en la quantitat de proteïnes de LonP1 mitjançant la desacetilació induïda. Es pot proposar una hipòtesi diferent per explicar la ineficàcia de la CR per prevenir la disminució relacionada amb l'edat de la quantitat de Cyt c. Aquesta proteïna és el desencadenant principal de la via apoptòtica mitocondrial a través del seu alliberament al citosol, per tant, la seva disminució de la quantitat intramitocondrial a les rates AL-28 respecte al valor AL-18 va indicar un augment de la procés apoptòtic intrínsec amb l'envelliment [16,31]. A més, com per a LonP1, la quantitat de Cyt c a les rates CR-28 encara era significativament inferior al valor dels animals AL{-18, cosa que indica que CR no va afectar substancialment la regulació final de l'expressió de Cyt c. /alliberament al citosol i, presumiblement, ni l'augment relacionat amb l'edat de la via apoptòtica mitocondrial. Això està d'acord amb la promoció de l'apoptosi mediada per CR [23].creixement del penis de cistancheCom que la via apoptòtica també es pot desencadenar per l'acumulació de danys a l'ADN [32, 33], vam determinar l'expressió de proteïnes de dos enzims BER mitocondrials principals, a saber, OGG1 i APE1. Les quantitats de proteïnes d'ambdós no es van veure afectades per l'envelliment i la CR que passava dels 18 als 28 mesos d'edat. Una possible explicació és que l'expressió dels dos enzims BER ja estava augmentada i suficient a les rates AL-18 per contrarestar l'augment del dany a l'ADNmt relacionat amb l'edat. De fet, s'ha informat d'un augment relacionat amb l'edat de l'activitat de l'OGG1 mitocondrial [34,35] i de l'APE1 mitocondrial[36] al fetge de rosegadors que passen d'animals de 3-6-mes a 20-23-mes. -antics, probablement induïts per contrarestar de manera eficient l'augment relacionat amb l'edat del dany de l'ADNmt. Tot això recolza encara més la nostra hipòtesi que els danys de l'ADNmt, reparats per OGG1 i APE1, van aparèixer molt aviat en la vida dels rosegadors (ja estaven presents a les rates AL-18) i van induir, mitjançant una comunicació retrògrada mitocondri-nucli, un augment precoç de l'expressió dels enzims BER. Pel que fa a l'absència d'un efecte CR sobre OGG1 i APE1, suggerim que la presència reduïda de CR de ROS i els danys oxidatius relacionats es va contrarestar eficaçment per una expressió d'ambdós enzims no diferent de la dels animals AL coincidents per edat. Pel que fa al contingut d'eliminació de 4,8 Kb, no hi va haver cap augment relacionat amb l'edat passant dels animals AL-18 als AL{-28 com si també aquest dany a l'ADNmt hagués aparegut bastant aviat en la vida de les rates i la seva edat. L'augment relacionat amb - només es podria haver verificat en comparació amb animals joves, tal com es va informar en altres estudis [19,37-39]. La ineficàcia de CR per disminuir significativament el contingut de supressió de 4,8 Kb a les rates CR-28 en comparació amb els animals AL{-28 i AL-18 indica a més que la CR a llarg termini va induir una disminució marcada de la presència de ROS al fetge. Això podria haver conduït a una mena de nivell d'estat estacionari de la supressió de 4,8 Kb, no diferent del de la contrapart AL-18 i compatible amb el contingut d'ADNmt respectiu. Tot i que la reparació de l'ADNmt no es va reduir amb l'envelliment, la disminució relacionada amb l'edat del contingut d'ADNmt encara estava present en passar de les rates AL-18 a les AL-28, tal com es va descriure anteriorment en diferents teixits de rosegadors envellits [3,15,19,39-42]. Això es pot explicar per l'augment de la unió de TFAM relacionada amb l'edat a regions específiques d'ADNmt que també estaven danyades en punts calents [19]. Aquesta hipòtesi conciliaria així la pèrdua d'ADNmt relacionada amb l'edat amb l'expressió i l'activitat sense canvis dels enzims reparadors. En suport addicional d'aquesta hipòtesi hi ha l'absència de pèrdua d'ADNmt a les rates CR-28. De fet, anteriorment vam demostrar que la CR va prevenir l'augment relacionat amb l'edat de la unió de TFAM a regions específiques d'ADNmt [15]. Per tant, segons les dades actuals i les nostres anteriors, la modulació de la unió a TFAM pot estar entre els mecanismes moleculars implicats en la regulació de la biogènesi mitocondrial mediada per l'envelliment i la CR. També s'ha demostrat que aquesta regulació per envelliment i CR es persegueix mitjançant l'equilibri de la dinàmica mitocondrial que es veu afectada per l'envelliment [43] i condueix a la prevalença de la fusió sobre la fissió [44,45]. Per tant, vam calcular l'índex de fusió (FI) en tots els animals analitzats (figura 6) i vam trobar valors que van confirmar i ampliar els nostres resultats anteriors [16].Beneficis de salsa cistancheEl present estudi pot recollir algunes indicacions noves, és a dir, a les rates AL-18, els valors de FI cobrien un rang reduït, mentre que a les AL-28 el rang FI era molt més gran, amb un marcat augment dels valors individuals relacionat amb l'edat, a les rates CR-28 el petit rang de valors va indicar un efecte positiu de CR en la inducció de la fissió, amb un augment generalitzat de les quantitats individuals de DRP1 en comparació amb les del grup AL-28. Tot i que la fissió eficient podria eliminar els orgànuls danyats, una fusió d'entitats similar podria assegurar la difusió de macromolècules danyades a la xarxa mitocondrial, diluint així els seus efectes negatius [46]. Per tant, la restauració mediada per CR de l'equilibri finament afinat de la dinàmica mitocondrial podria induir conseqüències positives sobre la modulació de la biogènesi mitocondrial, actuant de manera sinèrgica amb la comunicació retrògrada del dany de l'ADNmt. Això està en línia amb la literatura existent que informa que l'estat dels nutrients i les alteracions metabòliques poden modular l'equilibri de la dinàmica mitocondrial [47] i, per tant, afectar també la biogènesi dels orgànuls. En particular, la regulació sensible a ROS de la biogènesi mitocondrial només pot enfrontar-se a augments limitats de ROS a través de l'augment del nombre d'orgànuls [48] i la presència de ROS reduïda per CR [15] podria evitar la superació d'un nivell semblant a un llindar que podria provocar a la pèrdua mitocondrial. L'eficàcia de CR per disminuir la presència de ROS es va demostrar en el present estudi mitjançant la reducció de l'acumulació de purines oxidades a les regions analitzades d'ADNmt a les rates CR-28 que donen suport a una millora global del metabolisme mitocondrial, capaç de contrarestar l'edat. - Disminució relacionada. De fet, la presència de ROS reduïda per CR s'ha demostrat àmpliament també a nivell de proteïnes i lípids mitocondrials. En particular, s'ha demostrat que la CR disminueix les modificacions oxidatives de les proteïnes mitocondrials en cors de rates [49] i modifica l'índex de saturació/insaturació de les membranes mitocondrials evitant el dany oxidatiu i mantenint la fluïdesa de la membrana [8]. A més, s'ha demostrat que la CR disminueix la producció de ROS per complexos respiratoris mitocondrials tant al múscul esquelètic murí com al fetge [8]. Els efectes beneficiosos de CR a nivell de ROS també inclouen una millora de la neutralització de les ROS i una major reparació de les molècules danyades per ROS [10]. A més d'aquest efecte, els canvis en la funcionalitat mitocondrial estan modulats per l'activació d'AMPK i sirtuïnes sensibles a CR que regulen l'activitat dels factors de transcripció, coactivador gamma 1-alfa (PGC-1) del receptor activat pel proliferador de peroxisomes. ), i la caixa de forkhead (FoxO), amb aquesta última implicada en la biogènesi, el metabolisme oxidatiu i la rotació dels mitocondris [23]. Així, la influència positiva mediada per CR en el metabolisme mitocondrial hauria d'interaccionar amb altres vies per modular el desencadenant final de la biogènesi mitocondrial, segons un model de comunicació retrògrada al nucli [50].

3.2.Marcadors mitocondrials en rates de 32-mes d'edat

Pel que fa a la comparació entre rates AL-32 i CR{-32, les nostres dades mostren una absència generalitzada de diferències significatives. Això pot suggerir una limitació d'edat a l'eficàcia de la CR per contrarestar la disminució relacionada amb l'edat quan es passa dels 28 als 32 mesos. Pel que fa a l'efecte de l'edat, però, es poden treure conclusions diferents segons el marcador analitzat. De fet, en els dos grups de 32-mesos d'edat, la disminució relacionada amb l'edat de l'activitat de la citrat sintasa, les quantitats de TFAM, LonP1, OGG1, APE1, continguts d'ADNmt i la supressió de 4,8 Kb es va mantenir a un nivell. que era similar a l'observat a les rates AL-28 o es va prevenir parcialment/completament com en quantitats de Cyt c, MFN2, DRP1 i la incidència de purines oxidades en regions específiques d'ADNmt. Aquests diferents comportaments poden ser deguts probablement a la interacció de les diferents vies que impliquen els marcadors analitzats. Es pot destacar una altra conclusió comparant els dos grups de 32-mesos d'antiguitat amb els AL-18 i els AL-28 per als imports MFN2 i DRP1. De fet, la disminució relacionada amb l'edat no va ser present passant del grup AL-18 als grups AL-32 i CR{-32 per a les dues proteïnes dinàmiques. Tenint en compte que en la comparació entre el grup AL-18 i tant els de 32-mes com per a la resta de marcadors hi va haver una disminució relacionada amb l'edat similar o menor en grandària que la del AL{{ 30}} i AL-28, podem provocar algunes conseqüències. Això pot indicar que les alteracions dels marcadors relacionades amb l'edat poden haver començat o ja estaven presents als 18 mesos, i després van assolir el seu valor més baix/alt en els animals d'28-mes d'edat amb un "ritme" que és típic del procés d'envelliment. Per contra, en els animals extremadament vells (32-d'un mes), el "ritme" del procés semblava disminuir, ja que els valors són inferiors o iguals als dels homòlegs AL-18, però no inferiors. /més alt que els de les AL-28, malgrat el període de temps més llarg transcorregut. La hipòtesi de dos ritmes diferents en el procés d'envelliment [16] implica que els danys, deguts a diferents causes, comencen a afectar les activitats físiques i metabòliques durant l'edat adulta en cada rata. Aquests danys es contraresten eficaçment mitjançant mecanismes compensatoris i els danys no apareixen obertament, coincidint amb una edat "mitjana" estable caracteritzada per una homeòstasi reeixida. En aquest estudi, hem identificat com a rates que envelleixen "ràpidament" aquelles en què l'equilibri entre els danys intervinguts i els mecanismes compensatoris comença a esvair-se més tard a la vida.dosificació de cistanche tubulosa redditEn aquests animals, que constitueixen la fracció més gran del grup AL-28, els danys superen el llindar compatible amb les activitats normals i apareix una condició alterada. Per contra, la part més petita restant de la població envellida examinada manté l'equilibri homeostàtic entre els danys i la reparació durant més temps i constitueix el grup d'animals que envelleixen "lentament", incloent tant AL-32 com CR{{2}. } rates. Recentment s'ha proposat una hipòtesi similar sobre els diferents ritmes d'envelliment també per als humans [51]. En conjunt, aquests resultats indiquen que els animals extremadament envellits poden haver arribat a la longevitat sense estar afectats significativament per la CR i probablement a causa d'una predisposició genètica per fer front millor a la disfunció mitocondrial relacionada amb l'edat, però aquesta hipòtesi justifica investigacions futures. Aquestes noves troballes poden donar resposta a la pregunta original i crucial sobre l'existència de límits a l'eficàcia de la CR, plantejada per Ingram i de Cabo en el seu estudi molt profund sobre aquesta qüestió l52l, permetent identificar aquests límits amb l'edat dels anys. 28 mesos per al fetge de rata. No obstant això, la conclusió que la CR o qualsevol dieta no va provocar conseqüències beneficioses en aquelles rates naturalment predisposades a la longevitat no hauria d'afectar la confiança general en l'eficàcia d'aquesta intervenció nutricional. De fet, la CR encara va poder transmetre efectes beneficiosos, ja que va ser capaç de prevenir la majoria de les alteracions relacionades amb l'edat de la biogènesi mitocondrial i el dany de l'ADNmt al fetge de rates de 28-mes d'edat. Això confirma encara més la CR com una estratègia ben fonamentada per contrarestar de manera eficient el descens de l'envelliment de la població general.

4. Materials i Mètodes

4.1.Animals

L'estudi va ser aprovat pel Comitè Institucional de Cura i Ús d'Animals de la Universitat de Florida. Tots els procediments es van realitzar d'acord amb les directrius de l'Institut Nacional de Salut (NIH) per a la cura i l'ús d'animals de laboratori. Les mostres de fetge eren de rates mascles Fischer 344× Brown Norway (F344BNF1) obtingudes de la colònia de l'Institut Nacional de l'Envelliment (Indianapolis, IN, EUA) i allotjades individualment a una temperatura (20 més /-2 graus) i llum. entorn controlat (12-cicle de llum/foscor h) amb menjar per a rates regular i aigua disponible ad libitum al Departament d'Envelliment i Recerca Geriàtrica, Divisió de Biologia de l'Envelliment, Facultat de Medicina, Universitat de Florida, Gainesville, FL ( EUA). La restricció de calories s'havia iniciat als 3,5 mesos d'edat (restricció del 10 per cent), augmentada a la restricció del 25 per cent als 3,75 mesos i es va mantenir en una restricció del 40 per cent des dels 4 mesos fins al final de la vida de cada animal, que és als 28 mesos (CR{{ {17}}) o 32 mesos (CR-32) d'edat. Els animals restringits en calories van rebre la dieta enriquida NIH31-NIA per assegurar-se que no estaven desnodrits, mentre que els animals alimentats ad libitum van rebre la dieta de rates NIH31. Els animals estaven formats pels grups següents: 18-mes d'edat alimentats ad libitum (AL-18, n=6),28-mes d'edat alimentats ad libitum (AL-18 -28, n=6),28-anunci restringit en calories d'un mes (CR-28, n=6), 32-anunci d'un mes rates alimentades amb libitum (AL-32, n=6) i 32-mesos d'edat (CR-32, n =6). Els animals van ser anestesiats abans del sacrifici i les mostres de fetge es van retirar immediatament, es van congelar instantàniament en isopentà refrigerat amb nitrogen líquid i es van emmagatzemar en nitrogen líquid fins a una anàlisi posterior.

4.2. Determinació de l'activitat de la citrat sintasa

La determinació de l'activitat de la citrat sintasa es va realitzar com a [17]. Breument, 80 ug de proteïnes totals purificades a partir de mostres de fetge es van incubar al tampó de reacció (0,31 mM acetil-CoA, 100 mM tampó Tris ( pH 8,1), 0,25 per cent de Tritó X-100, 550-ditiol-bis-2-àcid nitrobenzoic 0,1 mM i oxalacetat 0,5 mM (1 mL) a 30 graus .

L'activitat de la citrat sintasa (umol × min-I × g teixit-) es va determinar espectrofotomètricament mesurant la velocitat de producció d'àcid tionitrobenzoic (TNB) a 412 nm.

4.3. Immunoblotting occidental

Els mitocondris hepàtics es van aïllar en un medi que contenia manitol 220 mM, sacarosa 70 mM, Tris-HCl 20 mM, EDTA 1 mM i EGTA 5 mM, pH 7,4, a 4 graus segons 【16】. A més, es van utilitzar 10 ug de proteïnes mitocondrials per a l'anàlisi d'immunoblotting occidental. Anti-TFAM (1:50,000), anti-VDAC (1:50,000, Abcam, Cambridge, Regne Unit), anti-OGG1 (1:2500, Abcam, Cambridge, Regne Unit) , anti-APE1 (1:5000, Abcam, Cambridge, Regne Unit), anti-MFN2 (1:5000, Abnova, Taipei, Taiwan), anti-DRP1 (1:2500, Abnova, Taipei, Taiwan) , anti-Cyt c (1:500, Pharmingen, San Diego, CA, EUA) i anti-Lon proteasa (1:10.000) es van utilitzar com a anticossos primaris. Els anticossos contra TFAM i Lon van ser fets a mida i donats amablement, respectivament, pel Dr. H. Hinagaki (Departament de Química, Institut Nacional d'Investigació Industrial de Nagoya, Nagoya-shi, Aichi, Japó) i el Dr. C. Suzuki (Departament). de Bioquímica i Biologia Molecular, New Jersey Medical School, Universitat de Medicina i Odontologia de Nova Jersey, Newark, NJ, EUA). Les proteïnes es van detectar per quimioluminescència i les bandes immunoreactives es van quantificar mitjançant el programari Image Lab (BioRad Laboratories Inc., Hercules, CA, EUA) i es van normalitzar contra l'expressió VDAC.

4.4.Determinació de l'ADNmt i l'ADNmt 4,8 Kb "Contingut d'eliminació comuna"

La reacció en cadena de la polimerasa en temps real quantitativa (qPCR) es va utilitzar per determinar els continguts relatius d'ADNmt i ADNmt 4,8 Kb "supressió comuna". Les reaccions es van realitzar mitjançant la química SYBR Green utilitzant 3 ng d'ADN total com a plantilla i els primers següents: ADNmt per a 5-GGTTCTTACTTCAGGGCCCATCA-3'(nt 15.785-15.806), mtDNA rev. 5'-TGATTAGACCCGTTACCATCGA-3'(nt 15,868-15,847); -actina per a 5'-CCCAGCCATGTACGTAGCCA-3'(nt 2181-2200), -actinrev5'-CGCTCCGGAGTCCATC AC-3'(nt 2266-2248);4,8 del per {{26} }AAGGACGAACCTGAGCCCTAATA-3'(nt8109-8131), 4.8 del rev 5'-CGAAGTAGATGATGCGTATACTGTA-3'(nt 13,020-12,996). El contingut d'ADNmt relatiu al nuclear Es va determinar el contingut d'ADN i 4,8 Kb de "supressió comuna" en relació amb l'ADNmt, tal com es va informar a [19].

4.5. Anàlisi de purines oxidades

La formamidopirimidina DNA glicosilasa (Fpg) (New England Biolabs, Beverly, MA, EUA) es va utilitzar la digestió de l'ADN total per detectar purines oxidades [53].

L'amplificació per PCR de les regions D-loop, Ori-L i ND1/ND2 de l'ADNmt es va dur a terme mitjançant el parell d'encebadors respectius:

Bucle D For5'-TCTGGTCTTGTAAACCAAAAATGA-3'(nt 15,302-15,325),bucle D Rev 5'-TGGAATTTTCTGAGGGTAGGC-3'(nt 16,302-16, 282); Ori-L per a 5'-AACCAGACCCAA ACACGAAA-3' (nt 4414-4433), Ori-L Rev 5'-CTATTCCTGCTCAGGCTCCA-3'(nt 5407-5388);ND1 per a 5 '-AGGACCATTCGCCCTATTCT-3'(nt3390-3409),ND1 Rey 5'-CGCCAAC AAAGACTGATGAA3'(nt 4399-4380) en 5 ng d'ADN total tractat i no tractat amb Fpg. Les condicions de ciclisme eren: Preincubació de 10 min a 95 graus, seguida de 18 cicles de 15s95 graus, 15s 58 graus C i 1 min 72 graus. Es va carregar una alíquota de cada amplificació de PCR en gel d'agarosa a l'1,3 per cent. El programari Image Lab (BioRad Laboratories Inc., CA, EUA) va analitzar les intensitats de les bandes tacades de bromur d'etidi. Per millorar la visualització gràfica, la relació entre les intensitats de la banda tractada amb Fpg i no tractada es va expressar com a percentatge del complement a 100.

4.6. estadístiques

Les dades s'expressen com a mitjana i desviació estàndard (DE). Es va utilitzar l'ANOVA unidireccional amb la prova de comparació múltiple de Tukey. Per a totes les proves, la significació estadística es va establir en un nivell del 5%. Les anàlisis es van realitzar mitjançant un paquet estadístic específic (Stata Corp. 2005. Stata Statistical Software: Release. College Station, TX, EUA).

Aquest article està extret de Int. J. Mol. Ciència. 2021, 22, 1665. https://doi.org/10.3390/ijms22041665 https://www.mdpi.com/journal/ijms