La causa de la malaltia poliquística del ronyó

per a més informació:ali.ma@wecistanche.com

La sobreexpressió de PKD1 provoca la malaltia renal poliquística

Caroline Thivierge, Almira Kurbegovic, Martin Couillard, Richard Guillaume, Olivier Coté i Marie Trude

Els mecanismes patogenètics subjacentsautosòmica dominantmalaltia poliquística del ronyó(ADPKD) queden per dilucidar. Tot i que hi ha proves que Pkd1(malaltia poliquística del ronyó 1)L'haploinsuficiència gènica i la pèrdua d'heterozigositat poden provocar la formació de quists en ratolins, nivells paradoxalment alts de Pkd1 (malaltia poliquística del ronyó 1) s'han detectat expressió als ronyons de l'ADPKD (autosòmica dominantmalaltia poliquística del ronyó) pacients. Per determinar si Pkd1(malaltia poliquística del ronyó 1)El guany de funció pot ser un procés patogenètic, es va modificar un cromosoma artificial bacterià Pkd1 (Pkd1-BAC) per recombinació homòloga per orientar únicament una expressió de Pkd1 sostinguda preferentment al ronyó adult. Es van generar diverses línies transgèniques que sobreexpressaven específicament el El transgen Pkdl als ronyons 2- per 15-plegar-se per sobre dels nivells endògens de Pkd1. Tots els ratolins transgènics van desenvolupar de manera reproducible costos tubulars i glomerulars i insuficiència renal i van morir per insuficiència renal. Aquest model demostra que la sobreexpressió de Pkd1 de tipus salvatge només és suficient per desencadenar una cistogènesi semblant a l'ADPKD humana. (autosòmica dominantmalaltia poliquística del ronyó). Els nostres resultats també van descobrir un sorprenent augment de l'expressió renal de c-myc en ratolins de totes les línies transgèniques, cosa que indica que c-myc és un efector crític in vivo aigües avall de Pkd1.(malaltia poliquística del ronyó 1)molecular Dathwavs, aquest estudi no només va produir un primer i inestimable PKD(malaltia poliquística del ronyó)model per avaluar la patogènesi molecular i les teràpies, però també proporciona proves que el guany de funció podria ser un mecanisme patogenètic en l'ADPKD (autosòmica dominantmalaltia poliquística del ronyó).

Feu clic a Cistanche per a malaltia renal

Autosòmica dominantmalaltia poliquística del ronyó(ADPKD) és una de les malalties genètiques més freqüents en humans. Es caracteritza pel desenvolupament progressiu de múltiples quists renals que afecten tots els segments de la nefrona. Altres manifestacions inclouen la formació de quists al fetge i al pàncrees, així com aneurismes intracranials i defectes cardiovasculars. ADPKD (autosòmica dominantmalaltia poliquística del ronyó)generalment condueix a una insuficiència renal amb progressió a la malaltia renal en fase terminal a la tarda edat mitjana.

Aproximadament el 85 per cent de l'ADPKD (autosòmica dominantmalaltia poliquística del ronyó)els casos s'associen a mutacions en el PKD1(malaltia poliquística del ronyó 1)gen. Aquest PKD1(malaltia poliquística del ronyó 1)El gen és gran, abasta 54 kb i consta de 46 exons. Genera una transcripció de 14.2-kb i codifica un 4., una 302-proteïna d'aminoàcid anomenada policistina-1(4, 9-11). L'expressió humana de PKD1 i policistina-1 s'ha analitzat en normal i ADPKD (autosòmica dominantmalaltia poliquística del ronyó)ronyons. Durant el desenvolupament renal, la policistina-1 es detecta fàcilment a les cèl·lules epitelials glomerulars i tubulars (revisada a la referència 37 i les referències que hi ha). En adults normals, nosaltres i altres hem demostrat que PKD1(malaltia poliquística del ronyó 1)L'ARN i la proteïna s'expressen a nivells moderats a baixos als túbuls col·lectors i distals, mentre que els nivells van augmentar (~2-plegament) a l'ADPKD. (autosòmica dominantmalaltia poliquística del ronyó)ronyons (22, 39). Curiosament, l'expressió de policistina-1 persistent o millorada es detecta a la majoria dels quists epitelials renals, tot i que la tinció estava absent en una minoria significativa de quists(29). A més dels ronyons, PKD1(malaltia poliquística del ronyó 1)L'expressió està normalment estesa en altres teixits adults, inclosos els tipus de cèl·lules epitelials i no epitelials (6,14,18,29,30,39).

Més de 200 PKD1 diferents(malaltia poliquística del ronyó 1)s'han descrit mutacions, la majoria de les quals són mutacions de supressió-inserció, canvi de fotograma o mutacions sense sentit. Es preveu que aquests donaran lloc a formes truncades de la proteïna, d'acord amb la inactivació d'un al·lel.

Tanmateix, una proporció significativa és un error o mutacions en el marc que es troben a tot el gen i sovint són úniques per a una família determinada (33, 34). Com el seu nom indica, ADPKD (autosòmica dominantmalaltia poliquística del ronyó)és dominant i el PKD1 mutat transmès(malaltia poliquística del ronyó 1)l'al·lel és suficient per produir la malaltia. Tanmateix, la naturalesa focal dels quists renals en ADPKD (autosòmica dominantmalaltia poliquística del ronyó)suggereix que el mecanisme mutacional de PKD1(malaltia poliquística del ronyó 1)podria ser un dos cops o una pèrdua d'heterozigositat. El suport per a aquest mecanisme es va obtenir mitjançant la detecció de PKD1(malaltia poliquística del ronyó 1)mutacions somàtiques clonals en cèl·lules d'una proporció significativa de quists (3, 21, 32). Un mecanisme de pèrdua d'heterozigositat podria explicar el fenotip àmpliament variable que s'observa habitualment en famílies individuals.

Estudis sobre el ratolí Pkd1(malaltia poliquística del ronyó 1)El gen pot proporcionar informació valuosa sobre les funcions PKD1 a causa de l'estreta similitud entre el gen humà i el murí i el producte del gen. En el desenvolupament normal, la Pkd1 murina s'expressa a nivells elevats des de l'etapa de mòrula i es detecta en tots els derivats de les cèl·lules de la cresta neural. incloent el cervell adult, l'arc aòrtic, el cartílag i la condensació mesenquimal (16, 17). S'ha informat que els ratolins mutants homozigots dirigits a la supressió de Pkd1 moren a l'úter i desenvolupen quists renals i pancreàtics (2,19,24-26, 40). Aquests intents anteriors de generar models de ratolí, malauradament, no van proporcionar animals viables postnatalment. No obstant això, l'aparició de quists renals en aquests ratolins mutants Pkd1 homozigots seria coherent amb la hipòtesi d'un mecanisme mutacional de dos cops en humans que implica una mutació de la línia germinal i la inactivació somàtica de l'al·lel normal. Tanmateix, els ratolins heterozigots per a la supressió dirigida a Pkd1 també van mostrar PKD amb quists hepàtics i pancreàtics ocasionals malgrat l'aparició tardana de l'adult, donant suport a un mecanisme d'haploinsuficiència o reducció de la dosi gènica. A més, la pèrdua d'heterozigositat o haploinsuficiència pot no ser l'únic mecanisme per a l'ADPKD (autosòmica dominantmalaltia poliquística del ronyó)patogènesi. De fet, aquests mecanismes discrepen amb l'expressió persistent o millorada de PKD1(malaltia poliquística del ronyó 1)s'observa a la majoria dels quists renals humans tret que es produeixin proteïnes no funcionals. Aquesta troballa d'expressió de PKD1 sostinguda o augmentada planteja la qüestió de si un guany de funció o sobreexpressió pot ser operant. Per investigar el mecanisme patogenètic de guany de funció de Pkd1, hem aïllat i caracteritzat un cromosoma artificial bacterià Pkd1 murí (Pkd1-BAC) que es va modificar posteriorment per recombinació homòloga a Escherichia coli per orientar l'expressió de Pkd1.(malaltia poliquística del ronyó 1)concretament als ronyons. Informem de la producció de tres línies transgèniques que expressaven el transgen Pkd1 a diferents nivells. Tots els ratolins van mostrar de manera reproducible una sèrie de similituds amb l'ADPKD humana i van desenvolupar constantment un inici precoç amb una ràpida progressió d'alteracions morfològiques i funcionals renals i van morir per insuficiència renal a l'edat mitjana. A més, l'estudi actual descriu un mecanisme in vivo pel qual Pkd1 pot mediar aquest fenotip PKD. Aquests ratolins representen el primer model de PKD produït per l'única sobreexpressió renal del PKD1 ortòleg.(malaltia poliquística del ronyó 1)gen.

MATERIALS I MÈTODES

Aïllament de clons de BAC que contenen Pkd1(malaltia poliquística del ronyó 1)locus. Els clons Pkd1-BAC de la soca hoste bacteriana E. coli DH10B (RecA; RecBC) es van aïllar d'una biblioteca pBelo11BAC de ratolí 129Sv (Research Genetics). El cribratge dels súper pools de BAC es va realitzar mitjançant PCR amb els primers següents: 5 regions, 5-CTG ATGAGTTCTGGCCATGGATG-3 (exó 1 Pkd1 cap endavant) i 5-CTGCCA GCCAATGCCATAGTCAC-3 (invers. Pkd1 exó 1); i 3 regions, 5-TCG GCCCTAGCGCTGCAGCC-3 (exó Pkd1 avançat 39) i 5-TCCAGTCC CACCTACAGCCAAC-3 (exó Pkd1 invers 40). Es va identificar i analitzar un clon positiu per a ambdues amplificacions en gel estàndard i electroforesi en gel de camp polsat (PFGE) seguit de Southern blotting. Per a l'anàlisi Southern blot, s'han dissenyat set sondes Pkd1 de ratolí: exó genòmic 1 (516 pb; nucleòtids [nt] 1 a 516; número d'accés NCBI U70209), exó genòmic 2-3 (220 pb), exó genòmic {{ 31}} (8.479 pb), exó d'ADNc 15-20 (1.724 pb; nt 6455 a 8179), exó d'ADNc 25-34 (1.315 pb; nt 9415 a 10730), exó d'ADNc 36-45 ( 1.655 pb; nt 10963 a 12618) i l'exó genòmic 45-46 (1.640 pb) (16). També s'han seqüenciat diverses regions incloses les extremitats d'inserció de BAC d'aquest Pkd1-BAC murí i es va confirmar que eren ortòlogues al gen PKD1 humà i a les regions contigües.

RESULTATS

Producció de SBPkdl(malaltia poliquística del ronyó 1) rAc-BAC per recombinació homòloga. Per determinar si només el guany de funció Pkd1 és suficient per produir l'ADPKD (autosòmica dominantmalaltia poliquística del ronyó)fenotip, primer vam aïllar un clon genòmic que contenia tot el gen Pkdl en una biblioteca de vectors BAC 129/Sv. Aquesta biblioteca es va examinar per PCR amb dos conjunts d'encebadors per al gen Pkd1 que abastaven l'exó 1 a l'extrem 5' i els exons 39 a 40 cap a l'extrem 3' (Fig.1). Es va identificar un clon BAC positiu per al gen Pkd1 que incloïa tot el cos del gen Tsc2 adjacent. La inserció Pkd1 es va caracteritzar amb detall per garantir que l'estructura genòmica coincideix amb la del Pkd1 endògen(malaltia poliquística del ronyó 1)gen de la soca de ratolí 129/Sv de la qual es va derivar l'inserció i de la soca endogàmica C57BL/6J. Els mapes genòmics del locus Pkd1 al BAC i en aquestes soques endogàmiques mitjançant l'anàlisi Southern blot, amb quatre digestions d'enzims de restricció i set sondes que cobreixen tot el gen Pkdl, semblaven idèntics sense evidència de reordenaments (Fig. 1). Aquest BAC contenia una inserció de ~121-kb que incloïa -37 kb d'aigües amunt i -39 kb d'una seqüència aigües avall del Pkd1(malaltia poliquística del ronyó 1)gen determinat per electroforesi i seqüenciació.

Aquest clon Pkd1-BAC va ser modificat per dos esdeveniments de recombinació homòloga successius a E.coli. El Pkd1(malaltia poliquística del ronyó 1)El gen es va etiquetar a l'exó 10 substituint un nucleòtid (G a A) per crear un nou lloc EcoRI a la posició 2355 del mapa d'ADNc. Aquesta mutació puntual silenciosa es va produir per distingir el Pkd1(malaltia poliquística del ronyó 1)gen i transcripció del BAC del d'origen endogen. A més, hem substituït els elements reguladors 5' del gen Pkd1-BAC aprofitant els elements específics de l'epiteli renal "SB" identificats prèviament de l'SBM (enllaçat a c-Myc) o SBF vinculat a c- fos)construct-trans-gen per restringir l'expressió als ronyons (36,38)(Fig. 2a).

Aquest nou SBPkd1TAc-BAC es va digerir amb Notl, un lloc únic situat immediatament aigües amunt dels elements SB, i ClaI dins del cos del gen Tsc2, truncant els elements reguladors de Tsc2 i la meitat 5' del cos del gen per assegurar la manca d'expressió exògena de Tsc2. en tots els teixits i per eliminar les seqüències BACvector procariotes (Fig.1 i 2). Aquest fragment linealitzat de 70-kb Notl-Clal es va aïllar, purificar i quantificar per a la microinjecció d'oòcits (36).

Producció i anàlisi de ratolins transgènics SBPkd1rAc. Quatre fundadors transgènics que porten diverses còpies del transgen SBPkd1rAc van desenvolupar constantment PKD(malaltia poliquística del ronyó). A partir dels quatre ratolins fundadors SBPkdlrAc determinats per anàlisi Southern, es van establir tres línies transgèniques SBPkd1rAG amb de dos a nou còpies del transgène (Fig. 2b). La caracterització de la integritat del transgen en aquestes línies es va controlar amb sondes 5', internes i 3', tal com es mostra en exemples representatius a la figura 2b. Línies transgèniques revelades amb la sonda 5'"SB" d'una banda de 10,9 kb coherent amb la integració del gen trans SBPkd1rAc en una orientació de cap a cua i revelada amb la sonda 3' una banda de 7.1-kb (Fig. 2b). A més, la sonda interna va detectar la banda Pkd1 endògena de 9,4-kb així com les bandes de 6,9-kb i 2,5-kb del transgène a causa del lloc d'inserció EcoRI a l'exó 10 (Fig. 2b). Aquests ratolins contenien còpies completes del transgen basades en l'anàlisi de l'estructura genòmica superposada.

Pkd1(malaltia poliquística del ronyó 1)guany de funció en ratolins transgènics SBPkdlrAc adults. Es va investigar l'expressió del transgen SBPkdlrAG i del gen Pkd1 en diversos òrgans. La quantificació dels nivells de transcripció del transgen i/o el gen endogen es va dur a terme mitjançant l'anàlisi Northern blot (Fig. 3a). Com era d'esperar, les transcripcions de gens transgènics i endògens eren de longitud similar (14, 2 kb). A partir de l'expressió de control de GAPDH, els ronyons de totes les línies de ratolí SBPkd1TAG havien augmentat constantment l'expressió de la transcripció en comparació amb els nivells normals de Pkdl en ronyons adults (n=3) d'edat similar. El transgen renal i l'expressió endògena per a les diferents línies transgèniques mostraven un rang de 2- a 15-plegament per sobre dels nivells de control de Pkd1 endògens renals (Fig. 3a). En particular, la línia transgènica 39 (n {{11} }) va mostrar Pkd1 més alt(malaltia poliquística del ronyó 1)nivells que les línies 3(n=3) i 41 (n =4). A més, els nivells d'expressió de Pkd1 mesurats per l'anàlisi Northern blot es correlacionen amb els obtinguts per PCR en temps real mitjançant primers en els exons 1 i 2 (Fig. 3b).

La quantificació dels nivells d'expressió transgènica es va dur a terme específicament mitjançant PCR en temps real i RT-PCR semicuantitativa a les tres línies transgèniques a l'edat adulta mitjançant l'ús de primers a la regió 5' no traduïda (promotor B, -globina) i a l'exó 2 de Pkd1.(malaltia poliquística del ronyó 1)(Fig.3b). L'expressió SBPkdlrAc en ratolins transgènics es va comparar amb el producte del gen de la proteïna ribosòmica S16 com a estàndard intern. Les condicions utilitzades per a l'amplificació semiquantitativa de RT-PCR estaven dins del rang lineal. L'expressió transgènica per PCR en temps real i RT-PCR semicuantitativa va mostrar de manera coherent i específica la més alta expressió al ronyó de totes les línies transgèniques en relació amb altres òrgans (Fig. 3b i c). Els nivells d'expressió renal d'una mostra individual eren reproduïbles amb qualsevol de les tècniques de detecció utilitzades. Els nivells més alts de Pkd1(malaltia poliquística del ronyó 1)es va mesurar l'expressió renal transgènica per a les línies 39 i 41. Per controlar si l'augment de Pkd1(malaltia poliquística del ronyó 1)L'expressió resultant del transgen o del gen endogen, es va comparar el mateix grup de ratolins de les tres línies transgèniques per a l'expressió del transgène Pkd1 renal i per a l'expressió total de Pkd1 renal (transgène i endògena) mitjançant PCR en temps real. Curiosament, les línies 39 i 41 en relació amb la línia 3 van mostrar que l'augment de l'expressió renal del transgen Pkdl era similar o superior a la de l'expressió renal total de Pkd1, assenyalant el transgen com a responsable específicament d'aquesta expressió induïda. En diversos òrgans (inclosos el cor, el pulmó, el cervell, el fetge, el pàncrees i la melsa), el transgen SBPkd1rAg va mostrar una expressió molt feble detectada de tant en tant a la melsa i al pulmó, amb poca expressió o indetectable en altres òrgans (Fig. 3b). La quantificació mitjançant PCR en temps real va demostrar un nivell 10- a 1,000- vegades inferior de l'expressió transgènica als teixits extrarenals en relació amb l'expressió renal (figura 3c). Els elements reguladors "SB" del transgen SBPkdlrA van conferir una expressió renal preferencial; aquesta distribució d'òrgans en particular també es va determinar quan s'utilitzava en transgens vinculats a c-myc (SBM) i c-fos (SBF) (36, 38).

C-myc, un efector aigües avall de Pkd1(malaltia poliquística del ronyó 1)vies de senyalització en ratolins SBPkdlrAc. Per conèixer el mecanisme patogenètic intracel·lular dels ratolins transgènics SBPkdlrAg, a continuació vam intentar controlar el nivell d'expressió renal de c-myc basant-nos en la nostra observació anterior de la desregulació de c-myc en l'ADPKD humana. (autosòmica dominantmalaltia poliquística del ronyó)ronyons (22). L'anàlisi dels ronyons es va dur a terme a partir de les tres línies transgèniques 3 (n =4), 39 (n =7) i 41 (n=4), així com els controls (n=4). Tal com es mostra a la figura 3d, hi ha una expressió substancial de c-myc endògena induïda en ratolins SBPkd1TAG en relació amb ratolins control d'edat similar. Curiosament, el nivell d'expressió de c-myc en alguns ronyons SBPkd1-c. en particular, la línia 39, va assolir nivells comparables als observats en el model de ratolí transgènic PKD SBM produït per l'expressió renal c-myc.

Anomalies renals en ratolins SBPkd1raG similars a PKD(malaltia poliquística del ronyó). To characterize the phenotype caused by the transgene expression, gross and histologic examinations were undertaken on transgenic kidneys. Adult kidneys from all transgenic lines were affected bilaterally. Kidneys contained numerous cortical cysts that varied from microscopic to macroscopic in size(Fig.4a and b). SBPkdl-AG kidneys were pale, a typical finding in PKD. On histologic examination, all transgenic founder mice and progenies (n =25;n>6 per a cada línia) van desenvolupar múltiples quists tubulars (T) i glomerulars (G) (Fig. 4d, f i g). Es van observar quists en túbuls de les regions corticals i medul·lars, així com recollir túbuls de la papil·la (Fig. 4d i e). Els ratolins transgènics mostraven una hiperplàsia epitelial tubular (punta de fletxa) que implicava tant túbuls quístics com no quístics i hipertròfia freqüent (Fig. 4g i h), però la gravetat variava entre els ratolins individuals. Amb freqüència es van observar fibrosi intersticial (F), infiltrats limfoides perivasculars i motlles proteïnes (P) (Fig. 4d i e).

Per definir amb més precisió el lloc de localització de Pkd1 augmentat(malaltia poliquística del ronyó 1)expressió als ronyons, vam realitzar una hibridació in situ mitjançant la sonda d'exó 36-45 utilitzada anteriorment (16). El senyal d'hibridació es va localitzar específicament a les cèl·lules epitelials que recobreixen el quist i els túbuls hiperplàstics, així com els quists glomerulars. A més, es va veure algun senyal sobre l'epiteli de túbuls no quístics o lleugerament dilatats, probablement identificant túbuls predestinats a patir futurs canvis quístics (Fig. 4i i j).

L'anàlisi histològica renal també es va dur a terme en ratolins transgènics en néixer (n =8), el dia postnatal 10 (P10) (n =3), P20 (n =5), P35 (n {{ {7}}), i P45(n=3) en comparació amb els companys negatius del mateix grup d'edat (n 2 a 4). Curiosament, tots els ratolins transgènics acabats de néixer van mostrar una dilatació tubular i glomerular en relació amb els companys negatius de control (Fig. 4k i l), cosa que indica que les anomalies renals van iniciar-se a l'úter tal com s'observa en ratolins SBM i en ADPKD. (autosòmica dominantmalaltia poliquística del ronyó)pacients. La dilatació tubular i glomerular augmentava en grandària i nombre amb l'edat progressiva. Pel P35, els ratolins transgènics mostraven una hiperplàsia més severa i evidència de glomeruloesclerosi. Funcions fisiològiques renals alterades en ratolins SBPkd1TAG. Les funcions fisiològiques renals de tots els ratolins transgènics mostraven característiques similars a la PKD(malaltia poliquística del ronyó), mentre que els companys no transgènics mai van desenvolupar la malaltia. Pocs mesos després del naixement, els animals afectats van desenvolupar una insuficiència renal crònica. Aquests animals es van controlar per als paràmetres funcionals renals mitjançant la mesura dels nivells sèrics i urinaris, nitrogen ureic sanguini (BUN) i creatinina, osmolalitat de l'orina, proteïna de l'orina i excreció d'ions (taula 1). Tots els ratolins de les tres línies en comparació amb els controls van mostrar defectes de concentració, una troballa comuna en l'ADPKD i, en conseqüència, van mostrar una disminució de les concentracions de BUN, creatinina, proteïnes i ferro urinàries. Els fundadors i descendents transgènics de SBPkd1TAG (n 6) de cada línia es van controlar qualitativament per a la proteinúria en mostres d'orina mitjançant SDS-PAGE (Fig. 5). Els ratolins de més de 2 mesos van mostrar una proteinúria no selectiva que va progressar amb l'edat. A més, es van augmentar els nivells de BUN sèric i creatinina sèrica, revelant insuficiència renal (taula 2). Com que la insuficiència renal crònica condueix habitualment a alteracions en els paràmetres hematològics, aquests es van examinar en ratolins transgènics SBPkd1TAG de 3 a 14 mesos d'edat (taula 2). Aquests ratolins transgènics eren anèmics, com ho demostra el recompte de glòbuls vermells significativament disminuït, amb l'hemoglobina i l'hematocrit que arribaven a la meitat dels nivells normals. Altres paràmetres de glòbuls vermells, com el percentatge de reticulòcits, no es van veure afectats, com s'esperava quan es van induir per un defecte renal. Aquests animals van morir constantment d'insuficiència renal als 5,9  2,8 mesos d'edat (n 42) per a la línia 39 transgènica i a edats posteriors, 14,6 3,1 mesos (n 20) i 11. .7 6.5 mesos (n 7), per a les línies 3 i 41, respectivament.

FIG. 1. Representació esquemàtica i anàlisi detallada del mapa de restricció d'un Pkd1-BAC murí.

Patrons de digestió de l'ADN genòmic de la Pkd1(malaltia poliquística del ronyó 1)-BAC es van comparar amb la del Pkd1(malaltia poliquística del ronyó 1)locus a les soques de ratolí endogàmics 129Sv i C57Bl/6J. Es van produir set sondes que abasten la major part del gen Pkd1 murí:

(a) exó 1, (b) exó 2-3, (c) exó 7-15, (d) exó 15-20, (e) exó 25-34, (f) exó 36-45 i (g) l'exó 45-46, etiquetats de a a g en el genòmic Pkd1(malaltia poliquística del ronyó 1)representació i sobre taques individuals.

Anàlisi de Southern blot després de les digestions de restricció (BamHI, EcoRI, HindIII i KpnI) d'ADN genòmic del Pkd1-BAC i Pkd1 murí(malaltia poliquística del ronyó 1)loci mostraven patrons idèntics amb les set sondes. M, marcador HindIII; 129, 129/Sv; C57, C57Bl/6J.

DISCUSSIÓ

A continuació, informem de l'aïllament i la caracterització d'un Pkd1-BAC murí. Aquest Pkd1(malaltia poliquística del ronyó 1)es va etiquetar el gen i es van substituir els elements reguladors per dirigir l'expressió específicament als ronyons mitjançant dos esdeveniments de recombinació homòloga successius. Els ratolins transgènics produïts amb aquest nou gen SBPkd1TAG van mostrar un augment de 2- a 15- vegades en l'expressió de Pkd1 i van desenvolupar de manera reproducible alteracions morfològiques renals típiques de la PKD. La insuficiència renal és evident a l'edat mitjana i els ratolins moren prematurament per insuficiència renal. Els nostres resultats també indiquen que el mecanisme de sobreexpressió de Pkd1 responsable d'aquest fenotip està mediat per l'activació de senyalització de c-myc in vivo. Aquest estudi demostra que el guany de funció murí Pkd1 als ronyons és suficient per produir un fenotip renal PKD. Com que el gen Pkd1 murí no es duplica com en els humans (27), hem identificat i aïllat directament un clon BAC que contenia tot el gen Pkd1. La caracterització completa del Pkd1-BAC murí 129/Sv, la comparació indirecta amb altres dues soques de ratolí endogàmics, va confirmar la integritat del locus Pkd1. La inserció Pkd1-BAC contenia de 37 a 39 kb de seqüències aigües amunt i aigües avall del gen Pkd1. La nostra anàlisi va demostrar que el gen Pkd1 en aquest BAC era un locus de tipus salvatge muri de bona fe que podria servir per a estudis posteriors. Tot i que hi ha evidències sòlides que la formació de quists en ADPKD (autosòmica dominantmalaltia poliquística del ronyó)pot resultar de la pèrdua de l'heterozigositat després de la inactivació somàtica de la PKD1 normal(malaltia poliquística del ronyó 1)al·lel (3, 21, 32), també hi ha proves suggeridores d'una expressió sostinguda o fins i tot augmentada de policistina-1 a l'epiteli tubular quístic (22, 29). Aquesta darrera observació planteja la qüestió de si la sobreexpressió de Pkd1 per se és una causa proxima suficient de cistogènesi. En ratolins transgènics que porten el PKD1 humà(malaltia poliquística del ronyó 1), TSC2, RAB 26, NTHL1 i SLC9A3R2, només una minoria de ratolins van desenvolupar quists i cap tenia una expressió transgènica detectable a l'edat adulta malgrat les 30 còpies del transgène (31). En aquests ratolins transgènics, era difícil establir un paper clar per a la sobreexpressió de Pkd1 en la cistogènesi. El nostre model difereix, ja que de dues a nou còpies de tipus salvatge només de Pkd1, sense gens contigus, es van integrar en ratolins transgènics. Com que el gen Pkd1 té funcions essencials en diversos òrgans o teixits, tal com es descriu per a nombrosos ratolins amb ablació del gen Pkd1, la sobreexpressió sistèmica de Pkd1 podria provocar efectes de confusió addicionals. En conseqüència, hem abordat el paper del guany de funció de Pkd1 mitjançant un enfocament que s'adreça específicament a Pkd1 als ronyons. Mitjançant la recombinació homòloga, primer hem substituït la regió reguladora aigües amunt de Pkd1 amb els elements reguladors restringits renals "SB", evitant així la disminució de l'expressió gènica que normalment s'observa per a Pkd1 a l'edat adulta, així com una possible regulació del bucle de retroalimentació secundària (36, 38). En segon lloc, hem marcat el transgen Pkd1 murí (Pkd1TAG) amb una mutació puntual silenciosa a l'exó 10, però no hem inserit una etiqueta d'epítop per garantir que es produiria una proteïna "de tipus salvatge" totalment funcional amb estructura i integritat conservades. A partir d'aquest BAC modificat, es va purificar un fragment SBPkd1TAG lluny del gen Tsc2 i del vector BAC per evitar la interferència del gen Tsc2, que també pot induir un fenotip quístic (8, 20, 28), així com per evitar l'efecte inhibidor de seqüències procariotes (5).

Es van produir quatre ratolins fundadors transgènics SBPkd1TAG diferents i tres línies independents amb Pkd1 renal específic.(malaltia poliquística del ronyó 1)-Expressió millorada. És especialment sorprenent la penetració completa del fenotip en aquests ratolins transgènics. El fundador de SBPkd1TAG i les línies de ratolí compartien diverses característiques fisiopatològiques en comú amb ADPKD (autosòmica dominantmalaltia poliquística del ronyó). Aquests inclouen el desenvolupament de quists a l'escorça, la medul·la i els glomèruls juntament amb la hiperplàsia epitelial, la fibrosi intersticial i la inflamació intersticial focal.

Perquè el PKD(malaltia poliquística del ronyó)El fenotip es va observar constantment en tots els diferents ratolins fundadors transgènics i la integració del transgen en el genoma del ratolí és un fenomen aleatori, el fenotip no pot resultar de l'efecte de la posició cromosòmica sinó només de l'augment de l'expressió de Pkd1. De fet, es va demostrar que l'expressió del transgen Pkd1 en totes les línies estava restringida als òrgans renals, com s'ha observat anteriorment per a altres transgens regulats pels elements "SB" (36, 38). A més, aquesta expressió augmentada de Pkd1 va ser causada pel transgen i no per una activació indirecta de Pkd1 endògena. Per tant, els nostres resultats proporcionen una evidència clara que el guany de funció d'un Pkd1 funcional de tipus salvatge pot produir múltiples quists renals. És important destacar que aquests ratolins SBPkd1TAG constitueixen el primer model de ratolí generat per l'única sobreexpressió de l'ortòleg del ratolí del gen PKD1 humà.

Els ratolins SBPkd1TAG demostren que Pkd1(malaltia poliquística del ronyó 1)La sobreexpressió és un mecanisme patogenètic primari de la cistogènesi renal. És important destacar que els nivells d'expressió transgènics més alts als ronyons semblaven correlacionar-se amb la progressió i la gravetat del fenotip. També vam trobar que la sobreexpressió de Pkd1 en el desenvolupament del fenotip SBPkd1TAG és probable que senyali l'activació de c-myc in vivo. És concebible que aquesta activació podria ser fins i tot directa a través de la policistina-1 cua C-terminal que pateix una escissió proteolítica i una translocació nuclear (7). Com que es va demostrar que l'expressió renal millorada de c-myc en ratolins adults indueix PKD, seria molt coherent donar suport a c-myc com a principal efector aigües avall de les vies de senyalització de Pkd1. Aquest resultat també es va correlacionar amb les nostres troballes anteriors d'augment de l'expressió de c-myc als ronyons de tota l'ADPKD humana. (autosòmica dominantmalaltia poliquística del ronyó)analitzat (22). En conjunt, aquests resultats indiquen que c-myc és un mediador principal de Pkd1(malaltia poliquística del ronyó 1)cistogènesi. Els nostres resultats del model de guany de funció Pkd1, juntament amb l'haploinsuficiència i la pèrdua de funció murines de Pkd1, indiquen que qualsevol desregulació de Pkd1 podria conduir a la cistogènesi (2, 19, 23-26, 31, 40).

Pkd1 greu(malaltia poliquística del ronyó 1)desequilibri en ratolins induït per Pkd1(malaltia poliquística del ronyó 1)l'ablació o la sobreexpressió transgènica van provocar l'aparició primerenca i la progressió ràpida dels quists renals i van afectar una gran proporció de túbuls. Per contra, un desequilibri més lleu de Pkd1, com l'haploinsuficiència, va provocar una progressió més lenta de la PKD amb quists més focals. L'aparent desenvolupament paradoxal d'un fenotip similar mitjançant la desregulació oposada de la policistina-1 podria explicar-se pel resultat comú, és a dir, un desequilibri relatiu de concentració de proteïnes que podria alterar la formació o la funció d'un complex multiproteic de policistina actiu. En conjunt, els nostres resultats i els d'altres investigadors argumenten que el mecanisme de formació de quists en ADPKD (autosòmica dominantmalaltia poliquística del ronyó)És probable que sorgeixi de tres mecanismes patogenètics: guany de funció, pèrdua de funció i efectes de dosificació gènica. Els nous ratolins SBPkd1TAG constitueixen un model potent de cistogènesi renal que pot proporcionar informació important sobre la fisiopatologia de la PKD(malaltia poliquística del ronyó), Pkd1(malaltia poliquística del ronyó 1)vies de transducció de senyals i socis que interactuen. L'estudi d'aquest model també pot conduir al desenvolupament de noves estratègies terapèutiques per restablir l'equilibri normal de proteïnes dins del complex multimèric Pkd1.

REFERÈNCIES

1. Blouin, MJ, H.Beauchemin, A.Wright, MEDe Paepe, M.Sorette, A.-M. Bleau.B. Nakamoto. C.-N, Ou, G. Stamatovannopoulos i M. Trudel 2000. Correcció genètica de la malaltia de cèl·lules falciformes: coneixements mitjançant models de ratolí transgènic. Nat. Med. 6:177-182.

2. Boulter, C., S.Mulroy, S.Webb, S. Fleming, K. Brindle i R. Sandford. 2001. Defectes cardiovasculars, esquelètics i renals en ratolins amb una interrupció dirigida de la Pkd1(malaltia poliquística del ronyó 1)gen.Proc. Natl. Acad. Ciència. EUA 98:12174-12179.

3. Brasier, JL i EPHenske.1997.Loss of themalaltia poliquística del ronyóLa regió (PKD1) del cromosoma 16p13 a les cèl·lules del quist renal admet un model de pèrdua de funció per a la patogènesi del quist. J. Clin. Investig.99:194-199.

4. Burn, TC, TD Connors, WRDackowski, LRPetry, TJVan Raay, JM Millholland, M. Venet, G.Miller, RM Hakim, GMLandes, KW Klinger, F. Qian, LF Onuchic, T.Watnick, GG Germino i NA Doggett.1995.Anàlisi de la seqüència genòmica per alautosòmica dominant malaltia poliquística del ronyóEl gen (PKD1) prediu la presència d'una repetició rica en leucina. Brunzit. Mol. Genet.4:575-582.

5.Chada,K, J.Magram, K. Raphael,G.Radice, E.Lacy i F.Costantini.1985. Expressió específica d'un gen de globina estranya en cèl·lules eritroides de ratolins transgènics. Natura 314:377-380.

6. Chauvet, V, F. Qian, N. Boute, Y. Cai, B.Phakdeekitacharoen, LF Onuchic, T.Attie-Bitach, L.Guicharnaud, O.Devuyst,GG Germino i M.-C. Gubler.2002. Expressió de PKD1(malaltia poliquística del ronyó 1)i PKD2(malaltia poliquística del ronyó 2)transcripcions i proteïnes a l'embrió humà i durant el desenvolupament normal del ronyó. Am. J. Pathol 160:973-983.

7.Chauvet, V., X. Tian, ​​H.Husson, DHGrimm, T.Wang, T.Hiesberger, P. Igarashi, AM Bennett, O. Ibraghimov-Beskrovnava, S. Somlo i MJ Caplan.2004. Els estímuls mecànics indueixen la divisió i la translocació nuclear de l'extrem C terminal de la policistina-1. J. Clin. Investig. 114:1433-1443.

8. Cheadle, JPMP Reeve, JR Sampson i DJ Kwiatkowski.2000. Avenços genètics moleculars en l'esclerosi tuberosa. Brunzit. Genet.107:97-114. 9. Consorci, EPKD1993.Identificació i caracterització del gen de l'esclerosi tuberosa al cromosoma 16. Cèl·lula 75:1305-1315.

10. Consorci, EPKD1994. El gen 1 de la malaltia poliquística renal codifica una transcripció de 14 kb i es troba dins d'una regió duplicada del cromosoma 16. Cèl·lula 77:881-894.

11. Consorci, IPKD1995. Malaltia poliquística renal: l'estructura completa de la PKD1(malaltia poliquística del ronyó 1)gen i la seva proteïna. Cel·la 81:289-298.

12.Couillard, M., R. Guillaume,N. Tanji, V. DAgati i M. Trudel.2002. L'apoptosi induïda per c-myc en la malaltia renal poliquística és independent de la interacció FasL Fas. Càncer Res. 62:2210-2214.

13. De Paepe, ME i M. Trudel.1994. El ratolí transgènic SAD: un model de glomerulopatia de cèl·lules falciformes humanes. Ronyó Int. 46:1337-1345.

14. Geng, L., Y. Segal, B.Peissel, N.Deng, Y. Pei,F. Carone, HGRennke, AM Glücksmann-Kuis, MC Schneider, M. Ericsson, STReeders i J.Zhou. 1996.Identificació i localització de la policistina, la PKD1(malaltia poliquística del ronyó 1)producte genètic. J. Clin. Investig. 98:2674-2682.

15. Gong, S., XWYang, C. Li i N.Heintz.2002. Modificació altament eficient de cromosomes artificials bacterians (BAC) mitjançant nous vectors llançadora que contenen l'origen de replicació R6Ky. Res del genoma 12;1992-1998.