Com les proteïnes reparadores de la membrana cel·lular regulen la transducció del senyal del factor de transcripció per controlar la fibrosi renal

Contacte: Audrey Hu Whatsapp/hp: 0086 13880143964 Correu electrònic:audrey.hu@wecistanche.com

Haichang Li

RonyóLa fibrosi s'associa amb la progressió de l'agutronyólesió de la malaltia renal crònica. S'ha demostrat que MG53, una proteïna reparadora de la membrana cel·lular, protegeix contra lesions a les cèl·lules epitelials renals i lesions renals agudes. Aquí, vam avaluar el paper de MG53 en la modulació deronyófibrosi en ratolins envellits i en ratolins amb obstrucció ureteral unilateral (UUO) un model conegut de fibrosi renal progressiva. Els ratolins amb ablació de MG53 van desenvolupar més fibrosi intersticial amb l'edat que els ratolins intactes MG53-de la mateixa edat. De la mateixa manera, en absència de MG53,ronyóLa fibrosi es va exagerar en comparació amb els ratolins amb intactMG53 al ronyó obstruït en comparació amb el ronyó no obstruït contralateral o els ronyons dels ratolins operats per simulació. L'ureter obstruïtronyonsde ratolins amb deficiència de MG53 també van mostrar una inflamació significativament més gran que els ronyons obstruïts ureterals de ratolins intactes MG53. Els experiments in vitro van demostrar que MG53 podria entrar als nuclis de les cèl·lules epitelials tubulars proximals i interactuar directament amb el component p65 del factor de transcripció NF-kB, proporcionant una possible explicació de la inflamació millorada en absència de MG53. Per provar-ho, es va donar una expressió millorada de MG53 a través de cèl·lules modificades o el lliurament directe de proteïnes recombinants als ratolins subjectes a UUO. Això va reduir l'activació i la inflamació de NF-kB i va atenuar la fibrosi renal. Així, MG53 pot tenir un paper terapèutic en el tractament de la inflamació renal crònica i, per tant, proporcionar protecció contrafibrosique condueix al fenotip de la malaltia renal crònica.

Cistanche tubulosa prevé la malaltia renal, feu clic aquí per obtenir la mostra

Declaració translacional La inflamació crònica condueix a una remodelació fibròtica que també pot ser la base de la transició de la lesió renal aguda a la malaltia renal crònica. L'activació del factor de transcripció proteïninflamatori factor nuclear-kB (NF-kB) està implicada en la patogènesi de la inflamació renal. Aquí, proporcionem proves que MG53, una proteïna reparadora de la membrana cel·lular prèviament identificada, interacciona directament amb NF-kB i redueix la seva activitat transcripcional. Simultàniament, MG53 administrat de manera exògena pot disminuir la remodelació fibròtica del ronyó inflamat. Aquestes troballes apunten a una interacció protectora entre MG53 i NF-kB per atenuar el desenvolupament de la fibrosi renal mediada per la inflamació. L'administració farmacològica de MG53 podria ser un enfocament prometedor per al tractament de la fibrosi renal progressiva.

La disfunció renal, que es pot classificar com a dany renal agut (IRA) o malaltia renal crònica (ERC), s'ha convertit en una epidèmia en les poblacions més grans. L'any 2017, la prevalença de l'ERC va arribar al 14,5 per cent de les persones de 65 anys o més, la qual cosa va suposar una despesa de Medicare de més de 84.000 milions de dòlars per al tractament.^1,2AKI i CKD són més freqüents en persones grans, principalment a causa de l'augment de la susceptibilitat a lesions i una capacitat disminuïda per reparar el ronyó envellit. Els estudis clínics han demostrat que la CKD és un factor de risc important per a AKI i, per contra, els episodis d'AKI poden accelerar la progressió de la CKD cap a la malaltia renal terminal. Actualment, el tractament de l'IRA és principalment de suport i el tractament de la CKD establerta se centra a frenar la progressió mitjançant la inhibició del sistema renina-angiotensina-aldosterona i ara possiblement mitjançant la inhibició del cotransportador de sodi-glucosa-2.^3,4

Depenent de la gravetat de la lesió, les cèl·lules tubulars proximals, el principal objectiu de la lesió aguda, poden patir canvis en la progressió del cicle cel·lular,5,6 metabolisme,7 secreció de citocines proteïninflamatòries i profibròtiques, o transició epitelial-mesenquimal parcial,8 que determinarà si la remodelació/reparació serà exitosa o inadaptada i donarà lloc a fibrosi renal, un segell distintiu de l'ERC.9,10 Aquesta remodelació generalment es produeix en un context d'inflamació renal,

disminució del subministrament vascular i la producció de proteïnes de la matriu extracel·lular (ECM) i inclou la pèrdua de cèl·lules epitelials i l'acumulació de col·lagens, actina del múscul llis i fibronectina; també té una alta correlació amb el deteriorament de la funció renal.

La inflamació crònica condueix a una remodelació fibròtica que també pot ser la base de la transició d'AKI a CKD.11–13 La investigació acumulada suggereix la implicació del factor de transcripció del factor nuclear-kB (NF-kB) en la patogènesi de la inflamació renal causada per infeccions, lesions, o trasplantament.11,12,14 L'activació de la via canònica NF-kB comença amb l'activació de l'inhibidor de la quinasa NF-kB (IkB), que condueix a la fosforilació i degradació d'IkBa i a la translocació nuclear dels heterodímers NF-kB.15. L'activació de la senyalització de NF-kB a les cèl·lules epitelials renals i les cèl·lules immunitàries infiltrades es pot provocar per desencadenants fisiopatològics com l'exposició a lipopolisacàrids (LPS) o lesions per isquèmia-reperfusió.¹⁷A més de les cèl·lules tubulars del ronyó, les cèl·lules immunitàries innates com els macròfags i les cèl·lules dendrítiques també contribueixen a la lesió renal, la inflamació i la remodelació fibròtica.^13,18–20

cistanche és eficaç en el tractament de la disfunció renal

L'evidència creixent suggereix que els factors secretors derivats del múscul (és a dir, les miocines) modulen la fisiologia sistèmica mitjançant la diafonia dels teixits per influir en la progressió de les malalties renals.²¹MG53 (també anomenada TRIM72) és una proteïna de motiu tripartit enriquit en múscul (TRIM) amb una funció crítica en la reparació de la membrana cel·lular.22,23 Les proteïnes de la família TRIM tenen funcions diverses que van des de la regulació de la senyalització immune fins a la reparació dels teixits.²⁴La reparació de membrana mediada per MG53-està implicada en la mitigació de lesions agudes al múscul esquelètic,²⁵ronyons,²⁶cor,²⁷ pulmons, 28 cervells,^29,30i pell.³¹Els nostres estudis anteriors van identificar un nivell baix d'expressió de MG53 al ronyó, que és un component clau en la protecció d'AKI, i els ratolins amb deficiència en MG53 (mg53 / ) eren més susceptibles a l'AKI induïda per l'estrès.²⁶També hem demostrat recentment que l'elevació sostinguda de MG53 a la circulació millora la reparació i la regeneració de lesions tissulars.32 Encara es desconeixen els papers relatius de l'MG53 circulant extrínsec i específic del ronyó en la modulació de la fibrosi renal durant la CKD progressiva.

Recentment, ha evolucionat un paper emergent de MG53 en la modulació de la protecció dels teixits mitjançant la inhibició de la inflamació, especialment mitjançant la modulació de la senyalització NF-kB. Per exemple, MG53 atenua la neurotoxicitat i la neuroinflamació induïdes per LPS mitjançant la inhibició de la via TLR4/NF-kB,33 i el MG53 cardíac regula l'expressió de KChIP2 per controlar la remodelació electrofisiològica durant la hipertròfia cardiovascular.34 A més, vam demostrar una funció dual de MG53 en prevenir una resposta hiperinflamatòria desadaptada durant una infecció subletal pel virus de la grip A, caracteritzada per una producció excessiva d'interferó-b, mitjançant la supressió de l'activació IRF3/NF-kB i la inhibició de la senyalització intracel·lular aberrant de Ca2+ en els macròfags.35 A més, amb una dosi letal de grip A. infecció per virus, es va demostrar que MG53 prevé la mortalitat i el dany pulmonar, no afectant directament els títols virals per si mateixos, sinó mitigant la tempesta de citocines (interferó-b, interleucina-6 i interleucina-1b) mitjançant una regulació negativa. de l'inflamsoma NLRP3 i prevenció de la piroptosi del pulmó.36 A més, el tractament crònic a dosis altes de MG53 exògena es va relacionar amb la supressió de NF-kB. – inflamació mediada al cor envellit.37 Aquests estudis suggereixen que MG53 pot modular la senyalització aberrant de NF-kB durant la inflamació, però no s'ha estudiat si això es produeix en el context de la inflamació renal.

Vam postular que MG53 regula la inflamació renal modulant l'activitat transcripcional de NF-kB i, en fer-ho, pot atenuar la fibrosi renal que es produeix com a conseqüència de la inflamació crònica. Aquest estudi es va dur a terme per abordar aquesta hipòtesi.

cistanche és eficaç en el tractament de malalties renals

MÈTODES

Estudis en animals

Tots els experiments amb animals es van adherir a la Guia dels Instituts Nacionals de Salut per a la cura i l'ús d'animals de laboratori i van seguir els protocols aprovats pel Comitè Institucional de Cura i Ús d'Animals de la Universitat Estatal d'Ohio. Tipus salvatge coincident per edat (WT) o mg53^-/-es van utilitzar no littermates de la soca 129S1/SvImJ22 per establir el paper de MG53 en la modulació de la fibrosi renal induïda per l'obstrucció uretèrica unilateral i depenent de l'edat (UUO). Els ratolins C57B6/J (9-10 setmanes) es van comprar a Jackson Labs.

Per als estudis de lesió renal, els ratolins (9-12 setmanes) van ser sotmesos a UUO per induir fibrosi renal. Els ratolins van ser anestesiats mitjançant isoflurà (1,5 per cent -2,0 per cent) per garantir un pla profund d'anestèsia. El procediment UUO es va realitzar lligant l'urèter esquerre amb 5-0 seda quirúrgica dues vegades segons els protocols publicats.38 Els ratolins simulats només tenien una incisió cutània abdominal. Per avaluar l'efecte de rhMG53 sobre la lesió renal obstructiva, 1 grup de ratolins UUO va rebre rhMG53 (2 mg/kg) mitjançant una injecció de la vena de la cua començant immediatament després de la cirurgia UUO (dia 0) i després diàriament durant 7 dies, amb 2 dosis addicionals els dies 9 i 11. Un grup control de ratolins UUO va rebre injeccions de solució salina segons el mateix calendari. Els ratolins van ser assassinats el dia 12 després de la cirurgia UUO, els ronyons es van perfondre in situ amb solució salina tamponada amb fosfat i es van recollir mostres de teixit del ronyó UUO i el ronyó contralateral per a la histologia i l'anàlisi de Western blot.

En estudis separats, WT i mg53^-/-els ratolins es van sotmetre a una cirurgia UUO o simulada i van ser assassinats el dia 7 després de l'operació. Es va donar MG53 als ratolins mitjançant un enfocament de teràpia basada en cèl·lules.39 Els macròfags RAW 264,7 es van infectar amb partícules virals de cirera Ad tPA-MG53-depenent de la doxiciclina (DOX) durant 24 hores. Les cèl·lules infectades (a una concentració de {{10}} /100 ml de solució salina per ratolí) es van injectar en la vena de la cua als ratolins immediatament després de la cirurgia (injecció del dia 0). Els ratolins van rebre 4 injeccions de cèl·lules RAW transduïdes Ad-tPA-MG53 els dies 0, 1, 3 i 6. Immediatament després de la injecció de cèl·lules del dia 0, els ratolins van ser aleatoritzats en un grup que va rebre i un grup que no va rebre DOX (2 mg/ml en solució de sacarosa al 5 per cent) a l'aigua de consum durant 7 dies i després matat. Es van recollir mostres de teixit del ronyó UUO i del ronyó contralateral per a anàlisis d'histologia, ARN i proteïnes.

Anàlisis estadístiques Les dades s'expressen com a mitjanes -SD. Es va realitzar una comparació entre grups mitjançant la prova t de Student en comparar 2 investigacions bàsiques experimentals H Li et al.: MG53 modula NF-kB en fibrosi renal 2 grups Kidney International (2021) -, --- i 1-anàlisi de la variància per a més de 2 grups (Graphpad Prism 8.2; GraphPad) seguida de la prova de comparació múltiple de Bonferroni o Holm-Sidak ad hoc. Un valor de P <0, 05="" es="" va="" considerar="" estadísticament="">

Mètodes suplementaris Mètodes complets que inclouen avaluació histològica, mesures de creatinina sèrica, construccions de plasmidis, cultiu cel·lular i aïllament de cèl·lules epitelials tubulars primàries, preparació d'adenovirus i infecció cel·lular, assaig de translocació nuclear NF kB p65, immunohistoquímica i imatges confocals, assaig de reporter de luciferasa NF-kB, L'assaig immunoabsorbent lligat a enzims, el fraccionament de teixits, la immunoblotting, la coimmunoprecipitació, la reacció quantitativa en cadena de la polimerasa en temps real (taula suplementària S1) i la producció de rhMG53 es troben als mètodes suplementaris.

extracte de cistanche tubulosa: tractament de la malaltia renal

RESULTATS

Els ratolins amb ablació de MG53 desenvolupen fibrosi renal depenent de l'edat

Hem comparat l'efecte de l'envelliment sobre la funció renal i la fibrosi en mg53^-/-i ratolins WT. Vam confirmar la nostra observació anterior que, tot i que els nivells de creatinina sèrica de ratolins joves (2 mesos) amb i sense MG53 no eren significativament diferents, els més grans (16-20 mesos) mg53-/-els ratolins van mostrar una creatinina sèrica significativament més alta que els controls WT coincidents amb l'edat (figura 1a). A partir de la tinció de tricrom, vam trobar que mg53-/-els ratolins tenien més fibrosi renal en comparació amb els ratolins WT, començant als 5 mesos i continuant fins als 20 mesos (figura 1b i c). La tinció immunohistoquímica es va utilitzar per avaluar l'impacte de l'ablació de MG53 en la infiltració de leucòcits, monòcits i macròfags en ronyons de ratolí de 2-mesos i 5-mes d'edat (figura 1d i e). Els ronyons de ratolins joves WT i mg53-/- tenien nivells similars de leucòcits intrarenals, però es van trobar significativament més cèl·lules inflamatòries en mg53/ronyons que ronyons WT en ratolins de 5-mes d'edat.

A més, la immunohistoquímica de l'actina i la fibronectina del múscul llis, 2 proteïnes de la matriu extracel·lular que es troben habitualment a les zones de fibrosi renal, van mostrar una tinció millorada (3- a 8-plegament) als glomèruls i tubulointerstici dels ronyons de 3- a 8-. {4}}ratolins mg53-/- d'un mes en comparació amb 10-ratolins WT d'un mes (figura suplementària S1).

UUO indueix una inflamació i fibrosi renal agreujada en mg53-/- ratolins. Els nivells de ronyó MG53 detectats per immunoblot van augmentar significativament 7 dies després de l'UUO (figura 2a). Els ronyons mg53- /- UUO mostraven una fibrosi exagerada, amb un 30 per cent addicional d'àrea tenyida de tricrom, que els ronyons WT UUO (figura 2b).

MG53 modula l'activació de NF-kB i la localització nuclear de p65

L'activitat de NF-kB (p65) es va avaluar en el model UUO. El nombre de p65 total (t-p65) va augmentar significativament als ronyons UUO de WT i mg53 / ratolins, però l'activació de NF-kB, avaluada com a fosforilació de p65, va ser més gran (16- vegades) en el mg53 / UUO ronyó que el ronyó WT UUO (2-plec) en comparació amb els animals operats per simulació (figura 3a). Hem analitzat els nivells relatius d'ARN del factor de creixement transformant b1 (TGF-b1), l'inhibidor de l'activador del plasminogen-1 (PAI{-1) i el col·lagen tipus I alfa 1 (Col1a1) al ronyó obstruït.40 van detectar nivells baixos d'expressió gènica en animals simulats i inducció similar (TGF-b1, w10 vegades; PAI -1, w40 vegades; Col1a1, w40 vegades) al ronyó UUO de WT i mg53 / (Figura 3b). Per examinar la distribució espacial de MG53 a l'escorça renal en condicions normals, es van analitzar les fraccions de teixit renal. Periòdicament obteníem 10- vegades més proteïna total del citosol que la proteïna nuclear total extreta. Els nivells de t-p65 eren comparables a la fracció citosòlica entre els ratolins WT i mg53-/-, però eren més grans a la fracció nuclear de ratolins mg{53-/- (figura 3c). Es va detectar MG53 a la fracció del citosol (amb tubulina com a marcador del citosol). Inesperadament, es va detectar una quantitat significativa de MG53 a la fracció nuclear (amb la histona H3 com a marcador de fracció nuclear).

Per confirmar aquesta troballa, també vam examinar la localització de MG53 a les fraccions del múscul esquelètic (figura suplementària S2). Vam reproduir els nostres estudis anteriors en què MG53 es va localitzar al citosol i la membrana sarcolemmal (adenosina trifosfatasa sodi-potàsica com a marcador de fracció de membrana)22,23,25, però també vam detectar MG53 nuclear enriquit del múscul esquelètic.

MG53 interacciona amb p65 per controlar l'activitat transcripcional induïda pel factor de necrosi tumoral a Per confirmar els nostres resultats de fraccionament de teixits, vam realitzar els següents estudis immunohistoquímics. A les cèl·lules epitelials tubulars proximals WT cultivades, p65 es va trobar principalment al citosol, però es va localitzar als nuclis en absència de MG53 (figura 4a). Quan aquestes cèl·lules es van tractar amb LPS (5 mg) durant 8 hores, la secreció de citocines proinflamatòries va ser significativament més gran en mg53 / cèl·lules que les cèl·lules WT (figura 4b).

Com que aquestes dades suggereixen que MG53 pot interactuar amb p65 per regular l'expressió de citocines inflamatòries, es va avaluar una interacció directa entre p65 i MG53 mitjançant assajos de coimmunoprecipitació mitjançant cèl·lules HEK293 cotransfectades amb Flag-p65 i HA-MG53. Hem demostrat una interacció feble (figura 4c). La cotransfecció dels plasmidis GFP-p65 i RFP-MG53 i l'anàlisi confocal van confirmar la colocalització de p65 i MG53 (figura 4d). A continuació, es va quantificar si MG53 afecta l'activitat transcripcional de NF-kB (p65) després de l'estimulació del TNF mesurant l'activitat de la luciferasa a partir d'una línia de cèl·lules informadores transcripcionals estables NF-kB/293-GFP-Luc que es va transfectar de manera transitòria amb qualsevol vector pHM6. o HA-MG53. Les cèl·lules informadores contenen un reporter de luciferasa de lucierca d'expressió de lentivirus transduït impulsat per un promotor mínim de citomegalovirus juntament amb 4 còpies d'elements de resposta transcripcional de consens NF-kB (lloc kB) aigües amunt. En absència de TNF-a, es va detectar una activitat de luciferasa intrínseca molt baixa a les cèl·lules informadores que expressaven proteïnes MG53. MG53 va suprimir l'activitat transcripcional de NF-kB (p65) provocada per TNF-a en un 40 per cent (figura 4e).

La sobreexpressió de MG53 va impedir la translocació nuclear de NF-kB p65 després del tractament amb TNF-a NF-kB p65 es va traslladar al nucli després del tractament amb TNF-a a l'epiteli del túbul proximal del ronyó. després de l'estimulació del TNF-a, vam sobreexpressar MG53 a les cèl·lules HKC-8 mitjançant la transducció viral Ad-tPA-MG53 depenent de DOX o mitjançant el tractament amb MG53 humà recombinant (rhMG53). Mitjançant un anticòs monoclonal específic de MG53-, després de la inducció depenent de DOX, es va detectar MG53 mitjançant immunoblot. MG53 estava present a un nivell molt alt a les cèl·lules HKC-8 transduïdes Ad-tPA-MG53,

equivalent a 1 ng de rhMG53/mg de lisat cel·lular. En canvi, HKC -8 va ocupar i expressar una quantitat molt menor de rhMG53 (figura 5a). La captació de rhMG53 marcat amb fluorescent FL per part de HKC -8 es va confirmar mitjançant microscòpia confocal (figura suplementària S3). Després del tractament amb TNF-a, el temps per a l'activació màxima de p65 va ser de 15 a 30 minuts (figura 5b). En condicions basals, NF-kB p65 residia principalment al citosol i la sobreexpressió de MG53 no ho va canviar (figura 5c i d). Tanmateix, després de l'estimulació del TNF-a, p65 es va traslladar als nuclis de les cèl·lules HKC-8 que no sobreexpressen MG53. En comparació, la translocació nuclear de p65 va disminuir un 33 per cent (cèl·lules que es van rebre rhMG53) fins al 50 per cent (cèl·lules transduïdes donades DOX) a les cèl·lules que sobreexpressaven MG53 (figura 5c i d).

La transferència adoptiva de cèl·lules RAW dissenyades al model UUOmouse es va realitzar amb cèl·lules 1 - 106 administrades mitjançant la injecció de la vena de la cua immediatament després de la cirurgia UUO. Els ratolins es van dividir aleatòriament en un grup que va rebre aigua potable normal (-DOX) i un grup que va rebre DOX (2 mg/ml) en aigua potable. Els ratolins UUO van rebre RAW cada dia per un total de 4 injeccions. Els ronyons es van recol·lectar 7 dies després de la cirurgia.

Els ratolins infusionats amb RAW dissenyat seguit de la inducció de DOX van mostrar una fibrosi renal significativament reduïda (en un 30 per cent) en comparació amb els que no van rebre cèl·lules o aquells amb infusió de cèl·lules RAW dissenyades però sense inducció Dox (66 per cent d'àrea fibròtica; Figura 6a i b).

Només una petita població RAW/Ad-tPA-MG53 va sobreviure a la vigilància del sistema reticuloendotelial al final dels experiments. La tinció d'immunohistoquímica va confirmar que l'expressió de MG53 mediada per RAW induïda pel tractament amb DOX al ronyó (figura 6c). Curiosament, els ronyons UUO de ratolins amb infusió de RAW i MG53 induït per DOX van mostrar una proporció p-65/t-p65 més baixa (al voltant d'un 40 per cent) que els que no van rebre RAW o els que van rebre RAW sense DOX (figura 6d i e). El nivell reduït de p-p65 es va confirmar amb la tinció d'immunohistoquímica de p-p65 (S536) dels ronyons UUO (figura 6f). Creiem que el MG53 circulant lliurat per Raw/Ad-tPA-MG53/þDOX i l'absorció per les cèl·lules del túbul proximal del ronyó podria participar en la reducció de p-p65 (S536) i disminuir la inflamació del ronyó UUO. En comparació amb els ronyons només UUO, l'expressió de TGF-b1, PAI- 1 i Col1a1 va augmentar significativament en ronyons UUO de ratolins infusionats amb RAW sense DOX (sense inducció de MG53). L'elevació d'aquests gens profibròtics es podria atribuir a la inducció d'una forta reacció d'al·lograft de cèl·lules infusionades en ratolins immunocompetents. Tanmateix, els ronyons UUO de ratolins infusionats amb RAW i donats DOX (inducció MG53) van expressar un PAI significativament inferior (reducció del 60% al 72%) i nivells relativament més baixos de TGF-b1 i Col1a1 que els ratolins sense tractament amb DOX (figura). 6g).

L'administració sistèmica de rhMG53 mitiga l'activació de NF-kB i el desenvolupament de fibrosi en ratolins sotmesos a UUO

Vam provar si rhMG53 mostrava un efecte antifibròtic similar al de la teràpia cel·lular RAW dissenyada descrita anteriorment. Les nostres dades farmacocinètiques anteriors van indicar la vida mitjana circulant curta (uns 90 minuts en rosegadors) de rhMG53.42 Els ratolins toleraven l'administració crònica de 2 a 6 mg/kg.

rhMG5326,37 bé, de manera que es va utilitzar l'estratègia d'administració que es mostra a la figura 7a. Els ratolins UUO van rebre aleatòriament vehicle (solució salina) o rhMG53 (2 mg/kg) diaris durant els primers 7 dies després de la cirurgia i després cada dos dies fins que van ser assassinats el dia 12. Els ronyons simulats i contralaterals mostraven aproximadament un t-p65 equivalent. i els nivells d'expressió de fibronectina, amb els nivells de p-p65 lleugerament augmentats als ronyons contralaterals en comparació amb els ronyons simulats. Després de l'UUO, el ronyó t-p65 va augmentar. En comparació amb els animals tractats amb solució salina, la proporció p-65/t-p65 als ronyons UUO dels animals tractats amb rhMG53- es va reduir al voltant d'un 37 per cent, mentre que IkBa va augmentar al voltant d'un 27 per cent (figura 7b i c). A més, la fibronectina va disminuir aproximadament un 33 per cent (figura 7b i c). La immunohistoquímica va confirmar que rhMG53 estava present als ronyons UUO després del tractament (figura 7d). La fibrosi total es va reduir als ronyons UUO tractats amb rhMG53- (figura 7e). Tanmateix, l'expressió d'ARN de TGF-b1, PAI-1 i Col1a1 va ser similar en ratolins tractats amb solució salina o rhMG53 (figura 7f).

cistanche és eficaç en el tractament de la disfunció renal

DISCUSSIÓ

MG53 és una proteïna TRIM enriquida amb músculs identificada inicialment com un component destacat de la maquinària de reparació de la membrana plasmàtica.22,26,42,43 No obstant això, les accions de MG53 no es limiten al múscul esquelètic i MG53 es pot alliberar a la circulació com a myokine.32 Anteriorment hem demostrat que MG53 pot controlar la inflamació durant el dany tissular en òrgans remots.27,29,33,35–37. La present investigació amplia l'abast de la protecció dels òrgans mediada per MG53-al ronyó. Arribem a la conclusió que MG53 pot atenuar la inflamació intrarenal i la fibrosi renal bloquejant l'activació induïda per citocines del factor de transcripció proinflamatori i profibròtic NF-kB. Aquesta conclusió es basa en les observacions següents: (i) supressió genètica de MG53 en ratolins normals.

va provocar una disminució de la funció renal a mesura que els ratolins envelleixen, que va anar acompanyada d'un augment de la fibrosi renal i la infiltració del ronyó per part de leucòcits i macròfags; (ii) en un model de lesió renal UUO murí, els ronyons obstruïts dels ratolins amb deficiència de MG53-exhibeixen més fibrosi i inflamació que els ratolins plens de MG53-; (iii) La producció de TNF-a i interleucina-6 per cèl·lules epitelials tubulars proximals tractades amb LPS es va atenuar en presència de MG53; (iv) el tractament amb o la sobreexpressió de MG53 en una línia cel·lular epitelial tubular proximal va disminuir l'activació de NF-kB induïda per TNFa bloquejant la translocació nuclear del component p65 de-kB (es va trobar que MG53 s'uneix directament a p65, encara que feble); i (v) la fosforilació de p65, un pas necessari en l'activació de NF-kB, es va reduir en els ronyons obstruïts de ratolins UUO tractats amb MG53 recombinant induït per sobreexpressar MG53 en macròfags. A més, l'inhibidor de l'activació de NF-kB, IkBa, va augmentar als ronyons obstruïts dels ratolins UUO injectats amb MG53 recombinant.

La supressió genètica de MG53 en ratolins normals va ser permissiva per als efectes adversos de l'envelliment sobre els ronyons. Això suggereix que la presència de MG53 endògena proporciona un nivell bàsic de protecció durant l'envelliment. De la mateixa manera, la pèrdua de MG53 endògena va empitjorar l'AKI a causa de l'obstrucció. El ronyó UUO va acumular MG53, possiblement reflectint l'activitat de miocina remota del múscul esquelètic. Encara no està clar com es pot reclutar el múscul MG53 al ronyó durant la lesió; tanmateix, un ronyó danyat sovint desenvolupa hipòxia i pateix estrès oxidatiu,^44,45senyals que podrien servir per reclutar MG53. Si és així, aquest eix "múscul-ronyó-cèl·lula immune" es podria aprofitar per atenuar el dany renal.46 Alternativament, les cèl·lules renals expressen nivells baixos de MG53 a la línia de base,²⁶i, durant lesions agudes o cròniques, la producció de MG53 es podria regular.

NF-kB és un important motor transcripcional de la inflamació i la fibrosi en la lesió renal i l'envelliment.^14,17,47,48Se'ns va demanar que investiguéssim si els efectes de MG53 podrien estar mediats mitjançant NF-kB perquè la presència de MG53 al compartiment nuclear dels homogeneïts renals va suggerir el potencial d'interferència transcripcional. La localització nuclear de MG53 no és sense precedents. En un model transgènic que sobreexpressava MG53 miocàrdic, l'MG53 nuclear va regular l'expressió del receptor alfa activat pel proliferador de peroxisomes a nivell transcripcional i va afectar el metabolisme dels lípids cardíacs.49 A més, recentment hem demostrat que rhMG53 va suprimir l'activació de NF-kB per mitigar la insuficiència cardíaca relacionada amb l'edat. mitjançant la reducció de les citocines proinflamatòries, l'apoptosi i l'estrès oxidatiu en cardiomiòcits vells.³⁷

El mecanisme molecular de com MG53 modula la mobilització nuclear/citoplasmàtica de p65 no està clar. MG53 no conté cap senyal de localització nuclear, però conté 3 senyals d'exportació nuclear rics en leucina N-terminals, un motiu reconegut per l'exportació de proteïnes d'exportació nuclear.⁵⁰La interacció directa entre MG53 i p65 va ser força feble com a efecte disruptiu únic o principal de MG53 sobre l'activació de NF-kB. Tot i que sembla que MG53 afecta el transport nucleocitoplasmàtic dinàmic dels components crítics de NF-kB, els mecanismes exactes encara estan per determinar.

El resultat crític de la renoprotecció mediada per MG53-sembla ser disminuir la remodelació fibròtica mitjançant l'atenuació de la inflamació mediada per NF-kB. La fibrosi renal és un procés complex que implica la deposició patològica de diverses proteïnes de l'ECM.51 Semblava que MG53 tenia efectes clars sobre la fibronectina de la proteïna ECM. La fibronectina va augmentar en els ronyons UUO deficients en MG53 i va disminuir en els ratolins UUO tractats amb MG53. L'expressió d'altres proteïnes ECM en presència i absència de MG53 és més difícil d'entendre. Prèviament vam demostrar que rhMG53 regula negativament la senyalització TGF-b1/Smad i suprimeix la síntesi de proteïnes ECM en un estudi in vitro.31 Les transcripcions in vivo, TGF b1, PAI-1 i Col1a1 no van augmentar en els ronyons UUO de mg53 / animals deficients. Aquestes transcripcions van disminuir en animals UUO induïts a sobreexpressar MG53 mitjançant l'administració de ratolí induït per virus.

macròfags, però quan es va donar MG53 recombinant, no es va observar cap efecte. Aquest pot ser simplement un cas de dosificació suficient perquè els nivells intrarrenals de MG53 assolits eren molt més grans en animals donat el vector de macròfags en comparació amb el MG53 recombinant. A més, no es van mesurar els nivells de proteïnes i els esdeveniments post-transcripcionals podrien modificar l'ECM a UUO. Es necessiten més investigacions per dilucidar el paper emergent de MG53 en la modulació de proteïnes ECM específiques. En conclusió, aquest estudi ha demostrat que una miocina pot ajudar a regular la inflamació inicial en un òrgan remot com el ronyó i, en el context d'una lesió renal, pot ajudar a atenuar i controlar la inflamació. La figura 8 presenta un model de treball del paper de MG53 en la renoprotecció. Durant l'estimulació dels patrons moleculars associats al dany (DAMP, com ara TNF-a) i els patrons moleculars associats a patògens (PAMP, com LPS) i l'estrès isquèmic, el signalosoma NF-kB s'activa al ronyó. MG53 protegeix el ronyó inhibint la fosforilació i l'activació de la senyalització NF-kB, estabilitzant IkBa i reduint la mobilització nuclear de p65, bloquejant l'activació de programes proinflamatoris. Tot i que l'MG53 endògena pot mediar aquests efectes, suggerim que es pot oferir una protecció més sòlida utilitzant MG53 terapèuticament, que és factible en funció de la capacitat de l'MG53 exògen per reduir lesions en UUO. Es garanteix una investigació addicional per entendre com es pot explotar clínicament aquesta miocina.

benefici del cistanche: protegeix el fetge i anti-fibrosi

DIVULGACIÓ

JM té una participació en TRIM-edicine, Inc., que desenvolupa rhMG53 per al tractament de malalties humanes. Les patents sobre l'ús de MG53 estan en poder de la Universitat Rutgers i la Universitat Estatal d'Ohio. Tots els altres autors no van declarar interessos en competència.

AGRAÏMENTS

Aquest treball va comptar amb el suport dels National Institutes of Health (NIH) R01-DK106394 (JM, BHR i P-HL) i NIH R01-AG062896 (P-HL i BHR). Aquest projecte també va comptar amb el suport parcial d'un fons intramural Lockwood de la Universitat Estatal d'Ohio (P-HL) i un premi del Centre Nacional per a l'Avenç de les Ciències Translacionals (NCATS; P-HL, número de premi UL1TR002733). El contingut és responsabilitat exclusiva dels autors i no representa necessàriament les opinions oficials de l'NCATS o el NIH.

CONTRIBUCIONS DE L'AUTOR,

PD, P-HL, JM i BHR van concebre i/o dissenyar els estudis; HL, PD, P-HL, ZL i XZ van realitzar els experiments, van adquirir dades i van realitzar anàlisis de dades; PD, P-HL i BHR van interpretar els resultats; i P-HL i BHR van redactar, revisar i aprovar el manuscrit. Tots els autors van llegir i van aprovar la versió final.

MATERIAL COMPLEMENTARI

Fitxer suplementari (PDF) Mètodes suplementaris.

Taula S1.Seqüències de primers. Figura S1. Els ratolins mg53-/- mostren una deposició millorada de proteïnes ECM. Es van tenyir teixits renals de tipus salvatge (WT) i mg53-/- coincidents per edat (10 mesos) amb 40 6-diamidino-2-fenilindol (DAPI; blau, panells esquerre), a- actina del múscul llis (SMA; verd, segon panell), fibronectina (vermell, tercer panell) i fusionat (panells dret). Barra ¼ 25 mm. Quantificació de l'àrea de fibrosi renal (n ¼ 3 per grup). Les dades es presenten com a mitjanes -SD. Prova t de l'estudiant. ***P <>

Figura S2.Distribució del múscul esquelètic MG53 entre nucli i citoplasma. Els ratolins ormg53-/- derivats del múscul esquelètic de tipus salvatge (WT) es van fraccionar i es van immunoblotar amb un anticòs anti-MG53 fet a mida (3 mg de lisats) i marcadors de compartiments cel·lulars (20 mg de lisats). Les adenosina trifosfatases de sodi i potassi s'utilitzen com a marcador de membrana cel·lular, la histona H3 com a marcador nuclear i la tubulina com a marcador del citosol.

Figura S3.Les cèl·lules del túbul proximal del ronyó HKC-8 absorbeixen específicament rhMG53 marcat amb AlexaFluor 647. rhMG53 (Trimedicine) i l'albúmina sèrica bovina (BSA; ThermoFisher Scientific) es van etiquetar amb kits d'etiquetatge d'anticossos Alexa Fluor (AF) (Life Technologies) segons el protocol del fabricant. Les cèl·lules HKC-8 es van cultivar en un plat amb fons de vidre Delta TPG (Bioptechs Inc.) en el medi Eagle modificat de Dulbecco (DMEM) amb un 10 per cent de sèrum fetal boví (FBS) en presència de proteïnes marcades, BSA-AF647 (esquerra). ) i rhMG53-AF647 (dreta), durant 24 hores. Les imatges de la pila Z es van prendre d'un microscopi confocal LSM780 (Zeiss). Les imatges mostren cel·les a la part inferior dels plats. Barra ¼ 25 mm.

Figura S4.Enginyeria de cèl·lules RAW per mediar la secreció inducible de MG53. (A) Les cèl·lules RAW es van infectar amb Ad-tPA-MG53 durant 24 hores i es van tractar sense (doxiciclina [Dox]) o amb Dox (þDox, 1 mg/ml) durant 24 hores addicionals per induir l'expressió de tPA-MG53. Les imatges confocals van mostrar la inducció de l'expressió MG53 (anticossos anti-MG53 fets a mida, vermell, panells inferiors) a partir de cèl·lules RAW semblants a macròfags (tinció F4/80, verd, panells superiors). Barres ¼ 25 mm. (B, C) Anàlisi Western blot de lisats cel·lulars (en quantitat de 0.6, 3 i 6 mg) per a l'expressió induïda de tPA-MG53 i MG53 a partir de cèl·lules RAW infectades (B) i el cultiu corresponent concentrats de mitjans (en volums de 2, 5 i 10ml) (C). Es van carregar com a estàndards diverses quantitats de rhMG53 (en una quantitat de 0,2, 1, 0,05 i 0,025 ng). Mw, marcadors de pes molecular.