El paper central del factor de creixement transformador (TGF-) en el desenvolupament de la fibrosi renal
Mar 26, 2022
Contacte: Audrey Hu Whatsapp/hp: 0086 13880143964 Correu electrònic:audrey.hu@wecistanche.com
PART Ⅰ: Paper del fibroblast renal primari humà en dispositius que imitan la fibrosi mediada per TGF- 1-
Seong-Hye Hwang, Yun-Mi Lee & et al.
1. Introducció
Fibrosi renal, la via comuna final d'innombrables malalties renals progressives, es caracteritza per un augment de la producció de proteïnes de la matriu extracel·lular (ECM), una disminució de la degradació de la matriu, una disfunció de la interacció cèl·lula-matriu, la transformació de les cèl·lules residents i la infiltració de cèl·lules inflamatòries.Factor de creixement transformador-(TGF-) és un pèptid dimèric multifuncional que regula processos biològics com la proliferació cel·lular, la diferenciació i les respostes immunològiques [1]. Entre els nombrosos factors fibrogènics, TGF- (Factor de creixement transformador-) té un paper central i té un efecte antiinflamatori. TGF- 1(Factor de creixement transformador-)-els ratolins deficients moren per una inflamació massiva. Ratolins transgènics que sobreexpressen TGF- 1(Factor de creixement transformador-)estan pràcticament protegides del desenvolupament de patologia fibròtica renal, principalment a través de la seva activitat antiinflamatòria [2]. Les propietats profibròtiques i antiinflamatòries del TGF-(Factor de creixement transformador-)són espases de doble tall pel que fa a l'aplicació terapèutica del TGF-(Factor de creixement transformador-)inhibició. S'han fet esforços notables per obstruir el TGF-(Factor de creixement transformador-)acció per dificultar la progressió derenalfibrosi[3]. Encara que s'han utilitzat molts enfocaments per combatrerenalfibrosi, un model experimental per avaluar els fàrmacs disponibles actualment no és ideal.
cistanche herba prevenirmalalties renals
En general, els estudis amb animals tenen un paper fonamental en les proves preclíniques per predir la farmacocinètica i l'eficàcia dels fàrmacs. Tanmateix, existeixen diverses diferències entre animals i humans, la qual cosa ens porta a qüestionar l'exactitud de les proves d'eficàcia i seguretat dels fàrmacs basats en animals 4. Els informes anteriors han depengut d'estudis preclínics en animals durant el desenvolupament de fàrmacs per avaluar la nefrotoxicitat i la seguretat dels fàrmacs. El funcionament renal dels animals és més del doble que el dels ronyons humans. Per tant, els fàrmacs es metabolitzen més ràpidament en animals que en humans, cosa que dificulta dilucidar els resultats de les proves de toxicitat dels fàrmacs mitjançant estudis amb animals. A més, els resultats dels experiments amb animals no es poden utilitzar per predir les respostes dels fàrmacs en humans, ja que els animals tenen diferents funcions fisiològiques. Basat en animalsfibrosi renalEls models tenen dificultats per reproduir humansfibrosi renal; per tant, s'està investigant per superar els obstacles actuals i optimitzar les plataformes de descobriment de fàrmacs [5].
La tecnologia Organ-on-a-Chip (OoC) ha sorgit com un concepte nou per resoldre aquests problemes. Aquesta plataforma va ser dissenyada tenint en compte les deficiències actuals, i ha mostrat una gran promesa en el camp de la nefrologia [6]. A més, els models OoC tenen un gran potencial com a reemplaçament dels models animals experimentals, proporcionen una solució per a les diferències entre espècies i poden ajudar a acabar amb la crueltat animal i els debats ètics [7]. Hi ha pocs models in vitro que utilitzen simultàniament fibroblasts renals primaris amb cèl·lules endotelials i epitelials, que són cèl·lules importants enronyófibrosi. El paper de cada cèl·lula enfibrosis'està estudiant per separat; tanmateix, hi ha un coneixement limitat sobre la interacció de les cèl·lules.
En el present estudi hem desenvolupatfibrosi-Imitació de dispositius amb fibroblasts primaris humans. Hem confirmat que TGF- 1(Factor de creixement transformador-)El tractament té diversos efectes sobre elfibrosi renalmodel. En particular, els fibroblasts tenen un paper fonamental com a cèl·lules efectores, promouen la formació d'un microambient pro-fibròtic i segreguen factors de creixement i citocines. Per tant, basant-se en aquest nou mètode, els fibroblasts poden proporcionar un sistema de model cel·lular ideal per estudiar la malaltia renal. Es va avaluar si els fibroblasts derivats de la malaltia renal fibròtica afecten la integritat de les cèl·lules cultivades en tres dimensions (3D). Finalment, presentem un estudi de prova de principi que demostra el potencial de l'ésser humàfibrosi renal-Imitació de dispositius com a model per predir la resposta a l'ésser humàfibrosi renal.
efectes del cistanche: tractar la infecció renal
2. Resultats
2.1. Identificació de l'actina del múscul llis alfa (a-SMA) i la queratina-8(KRT-8) per TGF- 1(Factor de creixement transformador-)en cel·les HK-2
En la fase inicial, vam examinar marcadors coneguts defibrosii el citoesquelet en cultius bidimensionals (2D). Es van realitzar assajos de tinció immunofluorescent per estimar l'expressió -SMA de la fibrosi i el marcador de transició epitelial a mesenquimal tubular (EMT) i els nivells de KRT8 com a marcador del citoesquelet. La tinció d'immunofluorescència va mostrar que l'expressió de -SMA era originalment feble i els nivells de KRT8 eren alts a les cèl·lules epitelials HK-2 monocapa. No hi va haver cap alteració significativa en la intensitat de fluorescència per part del TGF- 1(Factor de creixement transformador-)(5 ng/mL) o el tractament inhibidor específic de les cèl·lules epitelials HK-2 durant 24 h (figura 1).
Figura 1. La immunofluorescència mostra que l'expressió d'alfa-SMA i queratina-8(KRT8) es va mantenir mitjançant el tractament de TGF- 1(Factor de creixement transformador-)o l'inhibidor de les cèl·lules HK-2.(A) L'expressió d'alfa-SMA i (B)CCK-8 no va tenir cap efecte sobre les cèl·lules HK-2 per TGF- 1(Factor de creixement transformador-)(5ng/mL) o l'inhibidor. Les cèl·lules es van xapar originalment a una densitat d'1 × 10 graus per control sense tractar (ac) i （df） estimulades amb 5ng/mL de TGF- 1(Factor de creixement transformador-) o (gi) inhibidor de 10 μM (SB431542) durant 24 h i fixat amb un 4% de paraformaldehid. A continuació, les cèl·lules es van tenyir amb anti- -SMA i anti-citoqueratina-8 durant 20 min. Es va realitzar una tinció conjunta amb el colorant Hoechst H33342 per identificar els nuclis cel·lulars. Les barres d'escala a les micrografies indiquen 200 um.
La pols de cistanche millora la funció renal
2.2. Expressió KRT8 disminuïda en TGF- 1(Factor de creixement transformador-)en un xip
A continuació, vam avaluar els nivells d'expressió de -SMA i KRT8 en HK-2 cultivat en 3D i la longitud total de cèl·lules endotelials de la vena umbilical humana GFP (HUVEC) tractades amb TGF- 1(Factor de creixement transformador-)i un inhibidor específic. Per aconseguir-ho, primer vam establir un patró de xips de teixit que consta de dos tipus de cèl·lules, cèl·lules epitelials HK-2 i GFP-HUVEC. Després de la confirmació de la construcció, vam exposar el xip de teixit amb TGF- 1(Factor de creixement transformador-)(5 ng/mL) o un inhibidor específic (10 um SB431542) durant 24 h.
Com es mostra a la figura 2A-C, l'expressió de -SMA no va ser modificada específicament per TGF- 1(Factor de creixement transformador-)o el tractament inhibidor específic. Tanmateix, l'expressió de KRT8 es va reduir en el xip cocultiu de tipus de dues cèl·lules. A més, l'addició d'un inhibidor de TGF-ß1 va augmentar l'expressió de KRT8.
Vam examinar la formació d'una xarxa capil·lar tubular 3D per TGF- 1(Factor de creixement transformador-)tractament en HUVEC, ja que les cèl·lules endotelials poden formar espontàniament una xarxa tubular semblant a capil·lars 3D. D'acord amb les nostres condicions culturals, la formació de línies gruixudes es va reduir significativament. Tanmateix, les línies fines com capil·lars es van incrementar al TGF- 1(Factor de creixement transformador-)GFP-HUVEC tractats. En el cas del TGF- 1(Factor de creixement transformador-)tractament amb inhibidors al xip cultivat en 3D, la longitud total de les línies gruixudes i gruixudes va mostrar una tendència inversa al TGF- 1(Factor de creixement transformador-)tractament. Es va observar un augment de la longitud de la línia gruixuda en comparació amb el grup control no tractat. Es va observar un patró similar en el diàmetre de la línia gruixuda a GFP-HUVEC després de TGF- 1(Factor de creixement transformador-)tractament i tractament inhibidor. El diàmetre del GFP-HUVEC va ser suprimit pel TGF- 1(Factor de creixement transformador-)tractament, però va augmentar independentment del gruix de la línia per part de l'inhibidor en comparació tant amb els controls com amb el TGF- 1(Factor de creixement transformador-). La longitud total i el diàmetre de la línia gruixuda es van augmentar dràsticament amb el tractament amb inhibidors de TGF- 1 en comparació amb el control no tractat i el tractament amb TGF- 1. En particular, els resultats obtinguts van indicar una augment de la densitat de petits vaixells al TGF-(Factor de creixement transformador-)-grup tractat en comparació amb els seus homòlegs no tractats. En canvi, la densitat dels vasos gruixuts al TGF- 1(Factor de creixement transformador-)El grup de tractament va ser inferior al del grup control no tractat (figura 2D, E).
Figura 2. Expressió de KRT8 en HK-2 i longitud total i diàmetre dels HUVEC.(A) La immunofluorescència mostra que l'expressió de -SMA es va mantenir i l'expressió de KRT8 es va reduir dràsticament amb el tractament de TGF - 1(Factor de creixement transformador-)a Hong Kong-2. Les cèl·lules es van xapar i es van estimular amb 5 ng/mL de TGF- 1(Factor de creixement transformador-)o inhibidor de 10 μm （SB 431542） durant 24 h i fixat amb un 4% de paraformaldehid. Les cèl·lules es van tacar amb anti- -SMA i anti-citoqueratina-8 durant 20 min. Es va realitzar una tinció conjunta amb el colorant Hoechst H33342 per identificar els nuclis cel·lulars. L'expressió de -SMA (ac) no va tenir cap alteració, però KRT8 (df) a les cèl·lules HK-2 i la GFP a l'expressió HUVEC (gi) van ser canviades significativament per TGF- 1(Factor de creixement transformador-)(5 ng/mL) i l'inhibidor (B, C). En la longitud total dels HUVEC, el vas prim es va augmentar, però el vas gruixut es va reduir pel TGF- 1(Factor de creixement transformador-). El diàmetre es va augmentar tant en els vasos prims com en els gruixuts. Aquests resultats van ser revertits per l'inhibidor SB431542 (D, E). Les barres d'escala a les micrografies indiquen 100 μm.*p<><><0.001 versus="" the="" control=""><><0.001 versus="" the="" tgf-β1="" group.="" each="" value="" represents="" three="" technical="" replicates="" of="" each="" of="" the="" three="" biological="" replicates.="" statistical="" significance="" of="" the="" length="" compared="" to="" the="" non-treated="" cells="" is="" represented="" in="" the="" graph.="" thin="" vessels="" mean="" a="" length="" shorter="" than="" 50="" um="" and="" thick="" vessels="" represent="" a="" length="" longer="" than="" 50="">
per a què serveix el cistanche: tractar malalties renals cròniques
2.3. TGF- 1(Factor de creixement transformador-)Afecta tres tipus de cèl·lules del xip amb una estructura multicompartiment
Per estudiar el TGF- 1(Factor de creixement transformador-)les respostes del xip 3D proposat, vam realitzar la immunotinció a cada compartiment per separat (figura 3). En aquesta anàlisi es van utilitzar fibroblasts renals humans primaris. Les mostres es van analitzar mitjançant FACS i es van confirmar que eren positives per a l'anticòs marcador de fibroblast. Després de la incubació dels tres tipus de cèl·lules amb TGF- 1(Factor de creixement transformador-)durant 24 h, es va realitzar una immunotinció per avaluar l'expressió de -SMA i KRT8. L'expressió d'a-SMA va ser regulada a l'alça pel tractament amb TGF-1 i es van observar resultats oposats amb TGF- 1(Factor de creixement transformador-)tractament inhibidor. Per contra, l'expressió de KRT8 va ser regulada a la baixa pel TGF- 1(Factor de creixement transformador-)i va mostrar una resposta contrària al TGF-(Factor de creixement transformador-)inhibidor (figura 4A-C).
Figura 3. Imatge de mostra amb demostració esquemàtica del dispositiu de la fabricació i programa experimental.(A) Les dues imatges superiors mostren el disseny. La imatge de l'esquerra mostra una foto general de dalt a baix del dispositiu. Les imatges inferiors mostren la secció transversal. Vista esquemàtica que detalla les dimensions de les guies de líquid. (B) Aquesta figura descriu els horaris experimentals perfibrosi- aparells imitadors. El procés de càrrega de quatre passos per a cada pou. Ubicació de cada àrea de patronatge d'hidrogel, així com la col·locació del medi en secció transversal de dalt a baix i isomètrica. (1) Un total d'1,5 uL d'hidrogel 1 es guia espontàniament al canal central. (2) El canal central s'omple amb 5 uL d'hidrogel. (3) Un total de 10 uL d'hidrogel 3 estan dissenyats al sòl del dipòsit. (4) Es distribueixen un total de 200 μL de suport. Barra d'escala vermella=9 mm.
Tal com es mostra a la figura 4D-G, la longitud de la línia prima capil·lar va augmentar significativament pel TGF- 1(Factor de creixement transformador-)tractament en els GFP-HUVEC. Tanmateix, el gruix de la línia gruixuda es va reduir al TGF- 1(Factor de creixement transformador-)HUVEC tractats. El diàmetre es va reduir de mitjana per als vasos prims i gruixuts dels HUVEC. En el cas del TGF- 1(Factor de creixement transformador-)tractament amb inhibidors al xip cultivat en 3D, la longitud total de les línies gruixudes i gruixudes va mostrar una tendència oposada al tractament amb TGF- 1. A més, es va augmentar la longitud de la línia gruixuda en comparació amb el grup control no tractat.
Figura 4. Alteració de HK-2 i HUVEC cultivats en 3D amb fibroblasts renals primaris.Les cèl·lules totals es van xapar a una densitat de 5 × 10 graus per xip 3D i es van estimular amb 5 ng/mL de TGF- 1(Factor de creixement transformador-)o inhibidor de 10 μm （SB 431542） durant 24 h i fixat amb un 4% de paraformaldehid. (A) Les cèl·lules del xip 3D es van tacar amb anti-o-SMA i anti-citoqueratina -8. L'expressió de -SMA (ac) es va incrementar i l'expressió de KRT8 (df) es va reduir significativament per TGF- 1(5 ng/mL). La durada total dels HUVEC; els vasos prims van augmentar dràsticament i els vasos gruixuts es van reduir per TGF-ß1(Factor de creixement transformador-)(D, E). El diàmetre es va reduir per als vasos prims i gruixuts (F, G). Aquests resultats van ser revertits per l'inhibidor SB431542. Les barres d'escala a les micrografies indiquen 100 μm.*p<><0.01,and **=""><0.001 versus="" the="" control=""><><><0.001 versus="" the="" tgf-β1="" group.="" each="" value="" represents="" three="" technical="" replicates="" of="" each="" of="" the="" three="" biological="" replicates.="" thin="" vessels="" mean="" a="" length="" shorter="" than="" 50="" um="" and="" thick="" vessels="" represent="" a="" length="" longer="" than="" 50="">
2.4.TGF-81 Modula el mediador inflamatori i els factors de creixement
A continuació, vam investigar les citocines inflamatòries i els factors de creixement del sobrenedant; IL-1, FGF-2, TGF- 2(Factor de creixement transformador-)i TGF- 3(Factor de creixement transformador-)la secreció de proteïnes va ser espectacularment més alta en els xips cultivats en 3D que els fibroblasts 2D cultivats bé, tot i que tenien el mateix recompte total de cèl·lules. Tanmateix, TGF- 1(Factor de creixement transformador-) els nivells eren similars, ja que els models cultivats en 2D o 3D es van tractar amb concentracions similars de TGF- 1(Factor de creixement transformador-)(Figura 5A-E). En particular, l'alliberament de FGF-2 dels fibroblasts renals primaris humans va ser de 20,9 ± 0,4 pg/dia/5 × 10 graus de cèl·lules del cultiu monocapa 2D i 3094,8 ± 0,2 pg/dia/5 × 10 cel·les de grau incloent els HUVEC i HK-2 del xip cultivat en 3D al control no tractat. La secreció de FGF-2 pel TGF- 1(Factor de creixement transformador-)l'estimulació va ser de 31,0±0.2pg/dia/5×10 graus de cèl·lules per al cultiu 2D i 3683,9±0,8 pg/dia/5×10 graus de cèl·lules per al 3D -xip cultivat. Aquest augment de la producció de proteïnes FGF-2 en el cultiu de monocapa 2D va ser paral·lel a un augment del model de xip cultivat en 3D per TGF- 1(Factor de creixement transformador-)tractament (figura 5B).
Figura 5. Comparació de models cultivats en 2D i 3D com a plataformes d'imitació de fibrosi renal.Les cèl·lules es van xapar a una densitat de 5 × 10 graus per pou 2D o xip 3D i es van estimular amb TGF de 5 ng/mL- 1(Factor de creixement transformador-)o inhibidor de 10 um (SB 431542) durant 24 h. Els fibroblasts renals humans primaris es van utilitzar en el model de cultiu en 2D i en el model de cultiu en 3D. Els fibroblasts es van utilitzar a una densitat de 8 × 10 * cultivats amb HUVEC i HK-2. La proporció principal de fibroblasts renals humans a HUVEC, o relació F:H, va ser d'1:5 per avaluarfibrosiLes cèl·lules .HK-2 es van utilitzar amb una densitat de 2×104. La detecció del factor de creixement de fibroblasts bàsic (A)IL-1, (B) (FGF-2) i (CE)TGF-beta 1, 2 i 3 en el sobrenedant es va realitzar mitjançant anàlisi múltiple de citocines i immunoassaig múltiple de perles. Cada barra representa la mitjana± SE.*p<0.05,***><0.001 versus=""><0.01,##><0.001 versus="">(Factor de creixement transformador-).
Beneficis de cistanche tubolosa: tractament de malalties renals
A més, es va estimar l'expressió d'ARNm de citocines proinflamatòries com IL-1, IL-6, IL-8 i TNF-. Els resultats es van reduir significativament pel TGF humà recombinant- 1(Factor de creixement transformador-)tractament en el xip cultivat en 3D com a propietat antiinflamatòria del TGF-(Factor de creixement transformador-). Hem trobat que l'expressió d'ARNm estava regulada a l'alça pel TGF- 1(Factor de creixement transformador-)inhibidor (SB431542). A més, l'expressió mediada per inhibidors d'IL-6, IL-8 i TNF- es va reduir específicament en comparació amb el control no tractat (figura 6A-D). El nivell d'ARNm de VEGF, un factor fibròtic, va augmentar significativament pel TGF- 1(Factor de creixement transformador-)tractament. El nivell d'ARNm de VEGF va disminuir per l'inhibidor de TGF- 1 (figura 6E), mentre que l'expressió d'ARNm d'IL-10 amb efecte antifibròtic es va reduir en condicions fibròtiques induïdes pel TGF- 1 . En canvi, l'expressió d'ARNm I-10es va augmentar amb el tractament amb inhibidors de TGF- 1 (figura 6F).
Figura 6. La PCR en temps real mostra l'expressió global d'ARNm del xip 3D.Les cèl·lules es van xapar a una densitat de 5 × 10 graus per xip 3D i es van estimular amb 5 ng/mL de TGF- 1(Factor de creixement transformador-)o inhibidor de 10 um (SB431542) durant 24 h. ARN total extret del xip cultivat en 3D. L'expressió d'ARNm de (A)IL-1, (B)TNF-, (C)IL-6 i (D)IL-8 representa l'efecte antiinflamatori del TGF{ {10}}(Factor de creixement transformador-)tractament. Es va augmentar l'expressió de (E) VEGF com a factor angiogènic. L'expressió (F)IL-10 com a factor antifibròtic es va reduir significativament pel TGF- 1.*p<><><0.001 versus=""><><><0.001 versus="">(Factor de creixement transformador-).
