Els papers crucials de TRPM6 en la regulació circadiana de la pressió arterial

Contacte:joanna.jia@wecistanche.com/ WhatsApp: 008618081934791

Importància del canal iònic renal TRPM6 en la secreció circadiana de renina per augmentar la pressió arterial

Yosuke Funato, Daisuke Yamazaki, Daisuke Okuzaki, Nobuhiko Yamamoto i Hiroaki Miki

Pressió sanguíneaté un patró diari, amb valors més alts en el període actiu. La seva elevació a l'inici del període actiu augmenta substancialment el risc d'esdeveniments cardiovasculars mortals. La secreció de renina estimulada per les neurones simpàtiques renals es considera essencial per a aquest procés; tanmateix, el seu mecanisme regulador segueix sent en gran part desconegut. Aquí, mostrem la importància depotencial de receptor transitori relacionat amb la melastatina 6 (TRPM6), un canal catiònic permeable Mg2 més, per augmentar la secreció de renina en el període actiu.TRPM6l'expressió es redueix significativament al túbul contornejat distal de ratolins hipotensos amb deficiència de Cnnm2-. Generem específics del ronyóTRPM6-ratolins deficients i observen una disminució depressió sanguíneai una desaparició de la seva variació circadiana. De manera consistent, la secreció de renina no augmenta en el període actiu. A més, s'abroga la secreció de renina després de l'activació farmacològica del -adrenoreceptor, l'objectiu de l'estimulació neuronal, i l'expressió del receptor es redueix a les cèl·lules secretores de renina. Aquests resultats indiquen els papers crucials deTRPM6 en la regulació circadiana depressió sanguínea.

Es calcula que aproximadament mil milions de persones a tot el món tenen hipertensió, la qual cosa augmenta significativament el risc de diverses malalties, incloses malalties potencialment mortals, com la cardiopatia isquèmica i l'ictus. Se sap que aquests incidents mortals relacionats amb la hipertensió es produeixen amb freqüència a primera hora del matí, l'inici del període actiu quansangpressiópuja bruscament. Es considera que la secreció de renina desencadenada per les neurones simpàtiques renals té un paper crucial en aixòpressió sanguíneaelevació, però el seu mecanisme regulador no s'entén bé².

culturisme cistanche

Està àmpliament acceptat que alguns minerals de la dieta, especialment el sodi i el potassi, tenen un paper important en el control desangpressió. El magnesi és un element essencial important implicat en una varietat d'activitats biològiques. Els estudis epidemiològics han demostrat una relació inversa significativa entre els nivells de magnesi en la dieta i el risc d'hipertensió3-6. A més, l'excreció urinària de magnesi, que se suposa que està en equilibri aproximat amb l'absorció intestinal de magnesi, està inversament correlacionada amb el risc d'hipertensió. Aquestes troballes suggereixen una estreta associació entre l'homeòstasi del magnesi i l'organismepressió sanguínearegulació, destacant la importància dels canals i/o transportadors de Mg2 plus en la regulació depressió sanguínea.

Una gran quantitat de magnesi es reabsorbeix constantment al ronyó. La major part del magnesi del filtrat glomerular es reabsorbeix a l'extremitat ascendent gruixuda del bucle de Henle, però el pas final de la reabsorció es produeix al túbul contornejat distal (DCT)8. Aquest últim procés està estrictament regulat per ajustar la quantitat de reabsorció a un nivell adequat per mantenir l'homeòstasi del magnesi. Les anàlisis genòmiques de malalties congènites amb símptomes d'hipomagnesèmia han revelat diverses molècules clau implicades en aquest procés.TRPM6, codificaciópotencial de receptor transitori relacionat amb la melastatina 6(TRPM6), que està mutat en pacients amb hipomagnesèmia recessiva amb hipocalcèmia secundària2,10.TRPM6forma un canal iònic permeable Mg2 més localitzat a la membrana apical de les cèl·lules DCT i media la ingesta de Mg2 més del lumen tubular1. Una altra molècula clau és la ciclina M2 (CNNM2) i el transportador Mg2 més localitzat a la membrana basolateral de les cèl·lules DCT12,13. Les mutacions de Cnnm2 causen hipomagnesèmia familiar dominant, que es caracteritza per defectes en la reabsorció de magnesi al ronyól2. Els ratolins amb deficiència de Cnmm2-presenten símptomes similars d'hipomagnesèmia amb malbaratament de magnesi al ronyól4. El paper molecular precís de CNNM2 encara és controvertit, però diverses línies d'evidència suggereixen que media Mg2 més eflux de cèl·lules DCT a través de la membrana basolateral5, contribuint així a la reabsorció de magnesi. Anàlisis posteriors de ratolins amb deficiència de Cnnm2-han revelat que aquests ratolins també tenensangpressióque els ratolins de control4. Tanmateix, els detalls mecanicistes i la implicació d'altres canals/transportadors de Mg2 plus en aixòsangpressióla regulació segueix sent desconeguda.

També se sap que el DCT renal té un paper críticsangpressióregulació perquè reabsorbeix significativament el sodi i regula el volum del líquid corporal6. A la membrana apical del DCT s'expressen diversos canals/transportadors catiònics, com ara el cotransportador de Na-Cl (NCC), el canal epitelial de sodi (ENaC) i l'intercanviador de Na més / H més 2 (NHE2). aquestes proteïnes medien la ingesta de Na més a les cèl·lules DCT del lumen tubular. A continuació, el Na plus intracel·lular s'extrudeix de les cèl·lules a través de la membrana basolateral mitjançant Na més /K més -ATPasa per aconseguir la seva reabsorció. A més de la implicació directa en la regulació del volum de líquid corporal, el DCT es troba al costat de la màcula densa, que controla la secreció de renina, una hormona amb el paper principal en l'orquestració.pressió sanguíneareglament 17,18. En detectar els nivells urinaris de Cl-, les cèl·lules de la màcula densa estimulen les cèl·lules juxta-glomerulars (JG) properes perquè secretin renina.

En aquest treball, realitzem anàlisis de transcriptoma amb ronyons de ratolins hipotensos amb deficiència de Cnnm2-. Trobem una disminució importantTrpm6, que ens va impulsar a generar específics del ronyóTrpm6-ratolins deficients. De manera inesperada, les anàlisis d'aquesta soca de ratolí revelen un fenotip qualitativament diferent del de Cnnm2-deficient: la pèrdua de la variació circadiana desangpressió. També trobem que aquest fenotip és causat per una secreció deteriorada de renina, apressió sanguínea-augment de l'hormona de la qual el nivell sanguini normalment s'eleva durant la fase activa.

culturisme cistanche

Resultats

Desregulació deTRPM6 (potencial de receptor transitori relacionat amb la melastatina 6)expressió en ratolins deficients de Cnnm2-. Explorar el mecanisme molecular depressió sanguíneareducció dels ratolins amb deficiència de Cnnm2-, vam realitzar anàlisis de microarrays d'ADN per investigar els canvis en l'expressió gènica al ronyó de Cnnm2f/il; Sis ratolins2-Cre, sense els dos al·lels Cnnm2 al ronyól4. Entre els gens expressats de manera diferencial (taula 1), vam optar per analitzar Pvalb iTrpm6, tots dos expressats al DCT919. Les anàlisis quantitatives de PCR (qPCR) ho van revelarTrpm6l'expressió es va reduir de manera similar als ronyons de Cnnm2fi; Sis2-Cre i Cnnm2 plus/ratolins. Com que tant Cnnm2 més /A com Cnnm2fi/; Sis ratolins2-Cre eren hipotensos4, vam analitzarTRPM6 expressió amb més detall. Les anàlisis d'immunoblotting de lisats renals van confirmar una disminució significativa deTRPM6a nivell de proteïnes per deficiència de Cnnm2-, mentre que els nivells de NCC i NCC fosforilat (forma activa) no es van veure afectats notablement, l'expressió de CNNM2 es va confirmar mitjançant successives anàlisis d'immunoprecipitació i immunoblot). La disminució deTRPM6als ronyons de Cnnm2f/i; També es van confirmar sis ratolins2-Cre mitjançant anàlisis d'immunofluorescència.

També vam examinarTRPM6expressió en ratolins que no tenen CNNM4, que també mostren símptomes d'hipomagnesèmia20, però hanpressió sanguínea4. Les anàlisis d'immunoblotting i d'immunofluorescència van indicar queTRPM6l'expressió augmenta a les cèl·lules DCT de ratolins amb deficiència de Cnnm4-, cosa que suggereix queTRPM6l'expressió està íntimament relacionadapressió sanguíneavalors, però no està directament relacionat amb els nivells de magnesi en sang.

Regulació deTRPM6expressió per Mg2 més intracel·lular en cèl·lules DCT. Caracteritzar el mecanisme molecular deTRPM6 regulació a la baixa en ratolins amb deficiència de Cnnm2-, vam utilitzar una línia cel·lular derivada de DCT MDCT21, que expressa predominantment Cnnm2 i moderadament Cnnm3 i Cnnm4 entre els gens de la família Cnnm. Com que CNNM2 i CNNM4 tenen una forta activitat d'eflux de Mg2 més, mentre que CNNM3 no té activitat d'eflux de Mg2 més l5, vam realitzar una derrota mediada per ARN (siRNA) d'interferència petita de Cnnm2, Cnnm4 o ambdues. La derrota de Cnnm2 va augmentar els nivells intracel·lulars de Mg plus ([Mg plus ]) i la derrota simultània de Cnnm4 va provocar una lleugera elevació de la mitjana [Mg2]; valor, que no era estadísticament significatiu. A continuació vam examinarTrpm6expressió per qPCR i va trobar una disminució significativa després de la derrota de Cnnm2 i una disminució molt més gran després de la doble derrota de Cnnm2 i Cnnm4. Per tant,Trpm6l'expressió sembla estar regulada negativament pels nivells intracel·lulars de Mg2 plus, que és coherent amb els informes anteriors23. Per examinar directament la importància de Mg2 plus, vam cultivar cèl·lules MDCT en medis amb diverses concentracions de Mg2 més 0,1 h, la disminució de la concentració extracel·lular de Mg2 plus va provocar la reducció del nivell intracel·lular de Mg2 plus i l'augment deTrpm6expressió, cosa que suggereix un paper supressor de Mg2 més. En el cas de cèl·lules MDCT de doble knockdown (Cnnm2/Cnnm4),Trpm6l'expressió es va suprimir amb la disminució de Mg2 plus

més concentracions fins a 0,2 mm, però les reduccions addicionals van cancel·lar l'efecte supressor; tant intracel·lular Mg2 plus comTrpm6els nivells no eren significativament diferents de les cèl·lules control transfectades amb siRNA tant en condicions 0.1 com 0}.02 mM. Aquests resultats indiquen un mecanisme regulador dependent de Mg2 mésTrpm6expressió, que explica laTrpm6regulació a la baixa en els ronyons de ratolins amb deficiència de Cnnm2-.

Pertorbació condicional deTrpm6 (potencial de receptor transitori relacionat amb la melastatina 6)al ronyó. A continuació, hem volgut generarTrpm6-ratolins deficients per investigar més la importància deTRPM6en el reglament depressió sanguínea. Hem utilitzat un clon de cèl·lules mare embrionàries (ES) que portava un recombinantTrpm6al·lel (Trpm6-) que conté una seqüència acceptora d'empalmament, forçant l'empalmament prematur de l'ARNm i donant lloc a un ARNm truncat després de l'exó 6. Els ratolins heterozigots quimèrics es van obtenir mitjançant la injecció de blastocist de les cèl·lules ES i la recombinació es va confirmar per PCR. Aquests els vam creuarTrpm6més /- ratolins, però noTrpm6-/--des_primavera es van obtenir. Aquest resultat és coherent amb els informes anteriors que mostren la letalitat embrionàriaTrpm6-ratolins deficients24,25

Per tant, vam realitzar una interrupció condicional específica del ronyóTrpm6utilitzant Six2-Cre, que permet l'expressió eficient i específica de la recombinasa Cre fusionada amb GFP al ronyó embrionari.Trpm6fl/, ratolins Six2-Cre (específics del ronyóTrpm6-ratolins deficients) van néixer amb la proporció mendeliana esperada. Per determinar l'expressió deTRPM6, vam realitzar anàlisis d'immunoblot mitjançant un anti-TRPM6anticossos.TRPM6els nivells de proteïnes es van reduir molt als ronyons deTrpm6fl/fl, ratolins Six2-Cre, però no es van observar canvis significatius en altres òrgans. Les anàlisis de tinció d'immunofluorescència tampoc van mostrar cap expressióTRPM6en cèl·lules DCT positives per a NCC. No vam observar cap significatiuTRPM6-senyal positiu en més de 100 d'aquests grups de cèl·lules positives NCC, cosa que suggereix queTRPM6l'expressió està gairebé completament suprimida a les cèl·lules DCT de Trpmfi/; Sis2-ratolins Cre. Aquests resultats confirmen l'èxit de la generació de ronyons específicsTrpm6-ratolins deficients.

Primer vam examinar l'efecte dels ronyons específicsTrpm6-Dèficit de l'homeòstasi del magnesi. Vam mantenir ratolins en gàbies metabòliques i vam recollir mostres d'orina i sèrum, que després van ser sotmeses a quantificació colorimètrica dels nivells de magnesi mitjançant Xylidyl Blue-I. Els nivells sèrics de magnesi van ser significativament més baixosTrpm6l/l; Sis ratolins2-Cre en comparació amb els que tenen controlTrpm6més / més ; Sis ratolins2-Cre, mentre que els nivells urinaris de magnesi eren més alts. També vam realitzar anàlisis d'espectroscòpia d'emissió de plasma acoblada inductivament (ICP-ES) per mesurar diversos elements metàl·lics principals al sèrum i vam trobar que només els nivells de magnesi es van veure afectats significativament a Trpmd/; Sis2-ratolins Cre. Aquests resultats indiquen clarament que els ratolins amb deficiència de Trpm6-específics del ronyó tenen hipomagnesèmia amb desgast renal de magnesi, tal com s'observa al micel4 deficient de Cnnm2-específic del ronyó.

Manca de variació circadiana desangpressiói activitat renina. A continuació, ens vam sotmetreTrpm6i/l; Sis2-ratolins Cre asangpressiómesures mitjançant radiotelemetria. Sistòlica i diastòlicapressió sanguíneaels dos valors eren significativament més baixosTrpm6l/; Sis ratolins2-Cre que en els ratolins de control. Cal destacar que la variació circadiana habitual depressió sanguínea, amb valors alts durant el període fosc i valors baixos durant el període de llum en ratolins, no es va observarTrpm6f/l; Sis2-ratolins Cre. Per examinar si el ritme circadià continua amb normalitat, vam utilitzar radiotelemetria per mesurar l'activitat locomotora dels ratolins i vam confirmar una variació circadiana molt clara enTrpm6l/; Sis{{0}}ratolins Cre. També vam examinar els nivells sanguinis de vasopressina (AVP) i els nivells d'ARNm de dos gens rellotge Bmall i Per2 al cervell i al ronyó; se sap que tots mostren una variació circadiana típica27,28. Hem analitzat en sis punts de temps diferents (a 0,4,8 temps zeitgeber (ZT) per al període clar i a 12,16,20 ZT per al període fosc). Els ratolins de control mostren patrons circadians clars de la seva expressió tal com es va informar anteriorment28, i de nou, no vam trobar cap anomalia significativa enTrpm6/il; Sis2-ratolins Cre. També vam comprovar el nivell d'expressió de Trpm7, que codifica un canal permeable Mg2 més estretament relacionat ambTRPM6, al ronyó. Els patrons d'expressió eren molt semblants en tots dosTrpm6més / més ; Six2-Cre i Trpm6f/; Sis ratolins2-Cre i no mostraven patrons circadians clars. Col·lectivament, arribem a la conclusió que el ritme circadià continua amb normalitatTrpm6i; Sis2-ratolins Cre. S'ha considerat quesangpressióL'elevació durant el període actiu (el període fosc per als ratolins i el període de llum per als humans) tant en humans com en ratolins es produeix en resposta a un augment de la secreció de renina a la sang2. Hem mesurat l'activitat de la renina en mostres de sang recollides en els sis punts de temps diferents descrits anteriorment. Es va observar un augment clar de l'activitat de la renina en sang durant els períodes foscos en mostres de ratolins control, però no es va observar un augment significatiu en mostres de les deTrpm6/lSis2-ratolins Cre. També vam mesurar el nivell sanguini de noradrenalina, l'alliberament de la qual se sap que està estimulat per l'activació del sistema renina-angiotensina29,30. Com era d'esperar, la seva variació circadiana també va desaparèixerTrpm6, ratolins Six2-Cre. Mentrestant, el nivell de proteïna de l'angiotensinogen en sang (AGT), una altra molècula limitant la velocitat per activar el sistema renina-angiotensina en ratolins31, no es va veure afectat perTrpm6 deficiència. Els resultats suggereixen que la alteració de la variació circadiana de la renina és important per a la pèrdua de la variació circadiana desangpressióperTrpm6-deficiència.

La proximitat deTRPM6-expressen cèl·lules a cèl·lules secretores de renina. La renina s'expressa i segrega a les cèl·lules JG al ronyó17,18. Les cèl·lules JG estan en contacte directe amb la màcula densa, que es troba al costat de la DCT i estimula la secreció de renina de les cèl·lules JG en resposta a la reducció dels nivells urinaris de Cl18. La tinció d'immunofluorescència per a la renina i l'òxid nítric sintasa neuronal (nNOS), un marcador de la màcula densa, no va mostrar cap anomalia ni en el patró ni en la intensitat dels senyals positius observats a prop dels glomèruls.Trpm6f/; Sis2-ratolins Cre. Per tant, les cèl·lules directament implicades en la secreció de renina i la seva regulació no semblen estar marcadament afectades perTrpm6deficiència. ComTRPM6s'expressa conjuntament amb NCC al DCT, a continuació vam examinar la relació espacial entreTRPM6Cèl·lules que expressen /NCC (DCT) i la màcula densa o cèl·lules JG. Les imatges confocals de les seccions sagitals de DCT van mostrar gairebé una superposició completaTRPM6i els senyals NCC a tot el DCT. A continuació, vam tacar per a nNOS i NCC, i vam trobar que les àrees positives per a nNOS i NCC estan connectades, sense que hi hagi cap superposició de senyal. A més, una tinció doble per a renina iTRPM6/NCC va revelar que algunsTRPM6Les cèl·lules que expressen /NCC es troben a prop de les cèl·lules JG que expressen renina, cosa que suggereix queTRPM6Les cèl·lules que expressen /NCC, així com la màcula densa, poden tenir un impacte significatiu en la secreció de renina.

Secreció alterada de renina perTrpm6 (potencial de receptor transitori relacionat amb la melastatina 6)deficiència. En general, el sistema nerviós autònom té un paper crucial en l'orquestració de la progressió del ritme circadià. Es creu que la secreció de renina de les cèl·lules JG durant el període actiu és estimulada per la noradrenalina secretada per les neurones simpàtiques renals32. Per investigar directament l'efecte d'aquesta estimulació sobre la secreció de renina, vam preparar rodanxes de ronyó i les vam estimular amb isoproterenol, un agonista dels adrenoreceptors (AR). Els resultats van mostrar una disminució molt clara del senyal positiu de renina que quedava a la llesca després de l'estimulació amb isoproterenol durant 30 min. Les anàlisis quantitatives van mostrar que el percentatge de glomèruls envoltats de senyal positiu de renina va disminuir d'aproximadament un 80% a un 30% després de l'estimulació amb isoproterenol, cosa que indica l'aparició d'una secreció massiva de renina. Tanmateix, no vam observar un efecte significatiu de l'estimulació d'isoproterenol sobre el senyal de renina en rodanxes de ronyó deTrpm6/1; Sis2-ratolins Cre. Per confirmar el resultat, també vam mesurar l'activitat de la renina en sang després de l'administració d'isoproterenol. Els resultats mostren que només es va observar una elevació significativa de l'activitat de la renina en sang en els ratolins control, mentre que l'augment de la freqüència cardíaca es va observar habitualment en ambdues soques. Aquests resultats impliquen que les cèl·lules JG secretores de renina no poden respondre a l'estimulació de les neurones simpàtiques renals, d'acord amb la desaparició de l'augment circadià desangpressiói activitat de la reninaTrpm6l/fl; Sis2-ratolins Cre.

Les cèl·lules JG també es poden estimular per secretar renina en resposta a prostaglandines, entre les quals la prostaglandina E2(PGE2) es considera la més significativa, ja que és secretada fisiològicament per les cèl·lules de la màcula densa quan els nivells urinaris de Cl- disminueixen17,18. A més, també se sap que PGE, el tractament de rodanxes de ronyó, pot estimular la secreció de renina de manera eficient33. L'estimulació de les cèl·lules JG amb PGE2 i isoproterenol activa habitualment la producció d'AMPc, que finalment provoca la secreció de renina. Per tant, també vam provar l'efecte de la PGE i l'anàleg de cAMP permeable a la membrana, dibutylyl-cAMP (db-cAMP). PGE2 i db-cAMP van estimular amb èxit la secreció de renina en rodanxes de ronyó de Trpmdi/A, Six2- Creu ratolins i controleu ratolins. Això indica queTrpm6 La deficiència no anul·la la maquinària general implicada en la detecció de senyals externs, la retransmissió de senyals intracel·lulars i l'execució de la secreció de renina, però afecta específicament la resposta a -AR.

Disminució de l'expressió -AR a les cèl·lules JG perTrpm6 (potencial de receptor transitori relacionat amb la melastatina 6)deficiència. Resposta del receptor -AR deterioradaTrpm6l/l; Sis ratolins2-Cre ens van portar a investigar l'estat de l'expressió del receptor -AR i, per tant, vam realitzar la immunofluorescència de 1-AR, el principal subtipus -AR expressat a les cèl·lules JG34. Com es va informar anteriorment34, vam trobar el patró de tinció semblant a una banda en seccions renals tant de ratolins control com de Trpmdi/l, Six2-Cre. Se sap que 1-AR s'expressa fortament tant als vasos sanguinis com a les cèl·lules JG34 i, de manera coherent, les 1-cèl·lules AR positives al final de la tinció semblant a una banda al ronyó del ratolí de control també van ser positives. per a la tinció de renina (mostrat amb una punta de fletxa). En canvi, la tinció de Trpm6l/fl; El ronyó de ratolí de sis2-Cre va mostrar un nombre menor de cèl·lules 1-AR/renina doble positives, cosa que suggereix que l'expressió 1-AR va disminuir a les cèl·lules JG. Per corroborar aquesta troballa, vam aïllar cèl·lules JG mitjançant el mètode de centrifugació de gradient de densitat de Percoll segons l'informe anterior35. Les anàlisis d'immunoblotting van revelar que les cèl·lules JG positives per a la renina s'enriqueixen a la fracció de la banda 3, cosa que és coherent amb el seu informe35, i l'expressió 1-AR en aquesta fracció de la banda 3 era específicament molt inferior a Trpmdi/1; Sis2-ratolins Cre. En conjunt, ho vam trobarTrpm6la deficiència disminueix el nivell d'expressió de 1-AR a les cèl·lules JG, cosa que és coherent amb la alteració de la secreció de renina.

L'efecte de la intervenció artificial sobre el circadiàsangpressióvariació. En el conjunt final d'experiments, vam provar l'efecte de diverses intervencions sobre el circadiàsangpressióvariació. Per confirmar la importància de la renina, vam administrar un inhibidor de la renina aliskiren36 clínicament disponible a ratolins de tipus salvatge. M'agradaTrpm6l'ablació, l'administració d'aliskiren mitjançant la implantació quirúrgica d'una minibomba osmòtica va suprimir significativament el circadiàsangpressióvariació. A continuació, vam realitzar operacions de denervació renal, ja que l'activació de -AR a les cèl·lules JG a través del sistema nerviós simpàtic és la via principal per estimular la secreció de renina de manera circadiana2. De nou, vam trobar que la intervenció va suprimirsangpressióvariació. Aquests resultats estan d'acord amb el nostre model que els defectes en la resposta -AR i la secreció de renina són responsables de la pèrdua depressió sanguíneavariació en Trpmdl/l; Sis2-ratolins Cre.

També vam provar l'efecte d'elevar el contingut de magnesi en la dieta. Amb aquest propòsit, els ratolins de tipus salvatge van ser alimentats amb una dieta alta en Mg que contenia 0,6 per cent (dieta normal: 0,3 per cent de magnesi) durant 1 mes. Com era d'esperar, aquests ratolins van mostrar nivells elevats de Mg en sang. Després vam comprovar el nivell d'expressió deTRPM6a DCT; va disminuir dràsticament amb l'alimentació d'una dieta alta en Mg, i l'extensió va disminuirTRPM6l'expressió era més gran que l'ablació renal de Cnnm2. Quan vam mesurar elpressió sanguíneaen aquests ratolins, vam trobar que els ratolins alimentats amb una dieta alta en Mg eren significativament més petitssangpressióvariació queTrpm6-ratolins deficients, que és coherent amb la nostra noció que renalTRPM6és important per al circadiàpressió sanguíneavariació.

Taula 1 Gens que estaven regulats a l'alça o a la baixa als ronyons de Cnnm2flfl/flfl; Sis2-ratolins Cre.

Discussió

En aquest estudi hem demostrat la importància deTRPM6 (potencial de receptor transitori relacionat amb la melastatina 6)en el reglament depressió sanguínea. En particular, mostrem la desaparició gairebé completa de la variació circadiana depressió sanguíneaen específic del ronyóTrpm6-ratolins deficients. També vam trobar que la secreció de renina, una hormona clau que orquestra la pressió arterial, va ser severament abrogada enTrpm6-ratolins deficients, que és coherent amb l'observatpressió sanguíneafenotip. Diversos informes han demostrat que TRPM7, un altre canal permeable Mg2 plus molt semblantTRPM6, també afecta la pressió arterial37,38. TRPM7 evita l'augment depressió sanguíneadesprés de l'administració d'angiotensina II suprimint la resposta de les cèl·lules endotelials vasculars a l'angiotensina II37. Al contrari, recentment s'ha informat que TRPM7 també facilita l'elevació depressió sanguíneadesprés de l'administració de leptina mitjançant la mediació de Mg2 més l'afluència a les cèl·lules del cos caròtide38. Així, el paper de TRPM7 apressió sanguíneala regulació és ambigua. Tanmateix, atès que el nivell d'expressió de TRPM7 al ronyó no es va veure afectat pel renalTrpm6ablació (figura suplementària 5), ​​sembla que TRPM7 no està directament implicat en els fenotips observats en aquest estudi.

Com s'ha observat en ratolins amb deficiència de Cnnm2-,pressió sanguíneaes van reduir els valorsTrpm6-ratolins deficients(Fig.2)14. Tanmateix, cal tenir en compte que hi havia una clara diferència entre aquests ratolins. La interrupció de Cnnm2 es redueix generalmentpressió sanguínea, però la variació circadiana encara era clarament observable. En canvi, aquesta variació va desaparèixerTrpm6-ratolins deficients. Aquesta diferència qualitativa també és coherent amb la nostra observació que la variació circadiana de la renina es va conservar en ratolins amb deficiència de Cnnm 2- (figura suplementària 9). Cal tenir en compte que tant CNNM2 comTRPM6Es creu que són importants per a la reabsorció renal de Mg2 més mitjançant la mediació del transport vectorial de Mg2 més a través del DCT i, de fet, els ratolins amb deficiència en qualsevol dels gens presentaven un fenotip de pèrdua de Mg2 més renal idèntic (Fig. 1 i ref. 39). La diferència qualitativa depressió sanguíneafenotip entre Cnnm2-iTrpm6Els ratolins deficients suggereixen que el transport de Mg2 més a la DCT, la funció comuna de les dues molècules, no està directament implicat en la variació circadiana depressió sanguíneai la secreció de renina, cosa que suggereix que el paper independent de la CNNM2-TRPM6subjau a aquests fenotips intrigants.

Diversos mecanismes funcionen per estimular la secreció de renina de les cèl·lules JG per mantenir-lapressió sanguínea. Entre ells, es considera que l'entrada de les neurones simpàtiques renals té el paper principal en l'augmentpressió sanguíneadurant el període actiu de variació circadiana32. Aquestes neurones segreguen noradrenalina, que s'uneix i activa -AR a les cèl·lules JG per estimular la producció d'AMPc i, finalment, condueix a la secreció de renina1732. En els nostres experiments utilitzant rodanxes de ronyó obtingudes deTrpm6ratolins deficients, l'estimulació amb isoproterenol, un agonista -AR, no va mostrar cap efecte sobre la secreció de renina, mentre que l'estimulació amb PGE2 o db-cAMP augmentava de manera eficient la secreció de renina (Fig. 4). La PGE2 és secretada per la màcula densa en resposta a nivells baixos de Cl- i activa els receptors EP2 i EP4 a les cèl·lules JG, que, com l'activació de -AR, estimula la producció d'AMPc40. Per tant, aquests resultats impliquen que la senyalització -AR s'abroga selectivament a les cèl·lules JG deTrpm6-ratolins deficients, sense afectar la via de senyalització mediada per cAMP aigües avall. De manera consistent, la immunofluorescència de les seccions de ronyó de ratolí i la immunoblotting de cèl·lules JG aïllades van revelar que l'expressió -AR es va reduir significativament a les cèl·lules JG deTrpm6-ratolins deficients (Fig. 5). Aquesta expressió -AR reduïda hauria de fer que les cèl·lules JG no puguin secretar renina en resposta a l'estimulació del nervi simpàtic durant el període actiu, eliminant així la variació circadiana del nivell de renina en sang ipressió sanguínea. Cal tenir en compte que hi ha un estudi que utilitza ratolins knockout 1/ 2-AR, que va mostrar una disminució del circadiàpressió sanguíneavariació comTrpm6-ratolins deficients41. Ho van atribuir a la disminució de l'activitat locomotora, però encara és possible que la reducció de la variació circadiana de l'activitat de la renina contribueixi a una disminució de la variació circadiana depressió arteriale. Alternativament, el fons inusual dels seus ratolins (fons mixt de C57BL6/J, 129 i VFB; hem utilitzat fons C57BL6/ pur) podria emmascarar l'efecte de -AR enpressió sanguíneavariació; Els antecedents genètics són crítics per al circadiapressió sanguíneavariació 42.

culturisme cistanche

Com la pèrdua deTRPM6 (potencial de receptor transitori relacionat amb la melastatina 6)a les cèl·lules DCT condueix a la disminució de l'expressió -AR a les cèl·lules JG s'ha mantingut esquiva. Els experiments amb altres tipus de cèl·lules han demostrat que l'expressió -AR està regulada per diverses molècules conegudes per mediar la senyalització intercel·lular: l'addició de glucocorticoides al medi de cultiu de la línia cel·lular derivada dels conductes deferents DDT1 MF-2 augmenta l'expressió -AR43. A més, es va informar que l'òxid nítric (NO) va suprimir la degradació -AR a les cèl·lules cardíaques mitjançant la nitrosilació S de GRK24. Entre aquestes molècules, cal destacar que el NO és secretat per les cèl·lules de la màcula densa renal, estimulant les cèl·lules JG de manera paracrina per augmentar la secreció de renina45. Tot i que l'expressió de nNOS, l'enzim productor de NO al ronyó, està restringida a les cèl·lules de la màcula densa, estan en contacte directe amb les cèl·lules DCT, el següent segment del tubulel renal6. Així, és possible queTrpm6- La deficiència de cèl·lules DCT condueix a la disminució de l'expressió -AR a les cèl·lules JG afectant la producció o l'alliberament de NO de les cèl·lules de la màcula densa adjacents.

Se sap que les cèl·lules JG també es comuniquen amb altres cèl·lules mitjançant la formació d'unions gap amb les cèl·lules circumdants, com les cèl·lules mesangials, i reben Ca2 plus per suprimir la secreció de renina7. Tot i que les cèl·lules JG i les cèl·lules DCT no es posen en contacte directament entre elles, encara es troben molt properes (ref.46 i Fig.3) i és possible que aquestes cèl·lules utilitzin comunicacions d'unió gap a través de cèl·lules intervingudes, com les cèl·lules mesangials; els tres tipus de cèl·lules expressen Cx3747,48, una isoforma de connexina que s'oligomeritza i constitueix unions buits. Una anàlisi addicional pot identificar la molècula i la ruta responsable de la senyalització intercel·lular entre les cèl·lules DCT i JG, la qual cosa és important per revelar el mecanisme global de la alteració del circadià.pressió sanguíneavariació perTrpm6-deficiència.

EnTrpm6-ratolins amb deficiència, la variació circadiana dels nivells sanguinis no només de renina sinó també de noradrenalina va desaparèixer. L'activació del sistema renina-angiotensina estimula l'alliberament de noradrenalina al torrent sanguini29,30 i, per tant, sembla raonable que l'efecte deTrpm6 (potencial de receptor transitori relacionat amb la melastatina 6)l'ablació dels nivells de renina i noradrenalina en sang va ser similar. Com que la noradrenalina també actua sobre el -AR de les cèl·lules JG per promoure la secreció de renina, se suposa que les dues molècules constitueixen un bucle de retroalimentació positiva, estimulant la secreció de l'altra. No obstant això, cal assenyalar que els resultats dels experiments d'administració d'isoproterenol mostren explícitament el defecte en la secreció de renina (Fig.4) i, per tant, sembla ser la causa principal de la pèrdua de la variació circadiana tant de la renina com de la noradrenalina.

Fins ara, s'han desenvolupat i utilitzats diversos fàrmacs efectius per tractar pacients hipertensos. No obstant això, un nombre important de pacients mostren resistència als tractaments convencionals que utilitzen una combinació de principals fàrmacs antihipertensius de diferents mecanismes funcionals4. La denervació quirúrgica de les neurones simpàtiques renals mitjançant catèters endovasculars s'ha dut a terme com a prova per tractar aquesta hipertensió resistent50. La seva efectivitat pràctica per millorarpressió sanguíneaEl control ha estat controvertit51,52, però estudis publicats recentment han demostrat una reducció significativa depressió sanguíneaen comparació amb els controls simulats53,54. També hi ha resultats contradictoris sobre l'efecte de la denervació renal sobre la variació circadiana depressió sanguínea. Alguns informes van demostrar que l'extensió depressió sanguíneala disminució de la denervació renal va ser més gran durant els períodes actius53, però altres no van informar cap canvi en la variació circadiana depressió sanguínea55,56. En l'anàlisi amb animals de laboratori, les nostres operacions de denervació renal contra ratolins van suprimir la variació circadiana depressió sanguínea(Fig.6). També es van realitzar operacions similars contra rates, però fins i tot les rates de tipus salvatge de control no mostren gairebé cap circadiàpressió sanguíneavariació en primer lloc57,58, dificultant l'avaluació de l'efecte de l'operació. Es necessiten més estudis per aclarir l'impacte de la denervació renal en el circadiàpressió sanguíneavariació, que també ens ajudaria a entendre el mecanisme més detallat depressió sanguíneadesregulació per partTrpm6-deficiència.

Mesures telemètriques depressió sanguínea, freqüència cardíaca i activitat locomotora. Mesures telemètriques depressió sanguíneaes van realitzar de la següent manera4.Pressió sanguíneaes van inserir quirúrgicament transductors (TAl1PA-C10, Data Sciences International) a l'artèria caròtida comuna esquerra de 2- a 3-ratolins d'un mes sota anestèsia (mitjançant administració intraperitoneal de 0,3 mg/ kg de medetomidina, 4 mg/kg de midazolam i 5 mg/kg de butorfanol). Després de 3 setmanes de recuperació, sistòlica i diastòlicapressió sanguíneaels valors es van registrar amb un mostreig programat de 2-min cada 60 minuts mitjançant el programari Dataquest ART (Data Sciences International). Es van obtenir registres durant almenys cinc dies consecutius i es van determinar les mitjanes de les mesures preses a la mateixa hora cada dia per a cada ratolí i es van utilitzar per a anàlisis estadístiques posteriors, excepte la figura suplementària 4. Basat en Nakamori et al.68, renal. la denervació es va realitzar 2 setmanes abans de la inserciópressió sanguíneatransductors de la següent manera. Els ronyons es van exposar mitjançant una incisió abdominal i es va disseccionar el teixit connectiu al voltant dels vasos renals. A continuació, els vasos renals es van submergir en etanol al 95 per cent durant 2 minuts i després, en PBS durant 2 minuts. L'operació simulada es va realitzar mitjançant el procediment equivalent sense immersió amb etanol. L'aliskiren es va administrar 25 mg/kg/dia mitjançant la incorporació subcutània d'una bomba osmòtica (1004, ALZET) i es va iniciar el registre des de l'endemà de la introducció de la bomba. Per a la suplementació de magnesi, els ratolins van ser alimentats amb una dieta enriquida amb magnesi que contenia un 0,6 per cent de magnesi (CLEA Japó) durant 1 mes abans.pressió sanguíneamesura.

La freqüència cardíaca es va mesurar amb el mateix sistema de radiotelemetria, excepte que l'enregistrament es va realitzar amb un mostreig programat de 30-s cada minut i es va utilitzar una sola mesura per a una anàlisi posterior.

Les activitats locomotores es van avaluar mitjançant el mateix sistema de radiotelemetria, mitjançant el seguiment dels canvis en la força del senyal del transductor a causa de la locomoció de l'animal. En aquest cas, els transductors es van inserir quirúrgicament a l'espai subcutani del flanc dret. Els enregistraments es van realitzar amb els mateixos intervals de temps que es descriuen anteriorment.

culturisme cistanche

Referències

1. Giles, TDCritme circadià depressió sanguíneai la relació amb els esdeveniments cardiovasculars.J. Hipertensos. 24, S11-S16 (2006).

2. Smolensky, MH, Portaluppi, F. & Hermida, RC inPressió sanguíneaMonitoring in Cardiovascular Medicine and Therapeutics, 3r EDT.(eds White, WB)Part II, Ch.6, 105-128(Springer,2016).

3. Witteman, JCet al. Un estudi prospectiu de factors nutricionals i hipertensió entre dones dels EUA. Circulació 80,1320-1327(1989).

4. Ascherio, A. et al. Un estudi prospectiu de factors nutricionals i hipertensió entre homes dels EUA. Circulació 86,1475-1484(1992).

5. Ascherio, A.et al. Estudi prospectiu dels factors nutricionals,pressió sanguínea, i hipertensió entre les dones dels EUA. Hipertensió 27,1065-1072(1996).

Nota:l'anterior no és una llista de referències completa