Les propietats funcionals de les proteïnes es poden millorar mitjançant la hidròlisi per determinades proteases

Siusplau contactaoscar.xiao@wecistanche.comper a més informació

Resum:Per investigar mètodes per millorar el processament de residus porcins, la pell porcina es va hidrolitzar mitjançant diferents proteases disponibles comercialment (Alcalase, Flavorzyme, Neutrase, Bromelain, Protamex i Papain) en diverses condicions òptimes. Després de la hidròlisi enzimàtica, els hidrolitzats de col·lagen (CH) es van fraccionar per pes molecular (3 kDa) mitjançant ultrafiltració de membrana. Els CHS es van analitzar per a les propietats físiques (pH, recuperació de proteïnes, contingut de grup amino lliure, distribució del pes molecular i composició d'amino), així com per a les propietats funcionals (activitats antioxidants i activitats anti-envelliment). Entre els CH, els CH hidrolitzats per Alcalase (CH-Alcalase) van presentar el grau d'hidròlisi més alt en comparació amb altres CH. Tant "CH-Alcalase" com "CH-Alcalase".<3 kda"="" fractions="" showed="" a="" considerably="" high="" antioxidant="" activity="" and="" collagenase="" inhibition="" activity.="" therefore,="" resulting="" bioactive="" have="" the="" potential="" for="" development="" as="" antioxidants="" and="" anti-aging="" ingredients="" in="" the="" food,="" cosmetics,="" and="" pharmaceuticals,="" from="" animal="">

Paraules clau:hidròlisi; proteases comercials; hidrolitzat de col·lagen; antioxidant; anti edat

Feu clic aquí per saber-ne més

1. Introducció

Amb l'augment de l'esperança de vida, els procediments anti-envelliment de la pell estan rebent molta atenció. El col·lagen, utilitzat en productes per a la cura de la pell com a ingredient cosmecèutic per a l'anti-envelliment, s'utilitza àmpliament al mercat cosmètic. El col·lagen és una proteïna fibrosa d'origen animal d'alt pes molecular, que es troba abundantment al teixit conjuntiu, pell, tendons, cartílags, lligaments, dents, ungles i cabells d'humans i animals. La ramaderia continua sent la principal font de col·lagen industrial[1]. Anualment, grans quantitats de subproductes ramaders són rebutjats a tot el món, com a residus, per les indústries de processament d'aliments i carn. Tanmateix, es poden utilitzar com a recursos proteics importants per a nous materials alimentaris o convertir-se en productes de valor afegit mitjançant la hidròlisi, que s'aplica àmpliament per millorar i millorar les propietats funcionals i nutricionals de les proteïnes [2,3]. El col·lagen també es considera cada cop més una font de pèptids bioactius, que s'han mostrat prometedors com a compostos beneficiosos per al seu ús en aplicacions nutricionals o farmacèutiques.avantatges de cistanche,Per tant, la hidròlisi del col·lagen pot tenir un paper important en la millora de la seva biodisponibilitat i idoneïtat per al seu ús en diversos processos comercials.

Activitats fisiològiques dels pèptids bioactius, que solen contenir 2-20 residus d'aminoàcids (<6000 da),="" are="" based="" on="" the="" composition="" and="" sequence="" of="" their="" amino="" acids="" [2,4].="" due="" to="" their="" structural="" properties="" such="" as="" molecular="" weight,="" bioactive="" peptides="" may="" possess="" specific="" characteristics="" that="" affect="" numerous="" physiological="" processes="" related="" to="" antimicrobial,="" antioxidant,="" emulsifying,="" antihypertensive,="" antidiabetic,="" and="" immunomodulatory="" functions="" in="" organisms[1,5,6].="" generally,="" low="" molecular="" weight="" hydrolysates="" display="" lower="" viscosity,="" better="" dispersion,="" higher="" hydrophobicity,="" and="" smaller="" particle="" size="" [7].="">colesterol de cistancheEl grau d'hidròlisi afecta directament el pes molecular i la composició d'aminoàcids dels hidrolitzats [8]. Per tant, el procés d'hidròlisi pot ser necessari per produir nous pèptids bioactius.

Cistanche pot anti-envelliment

La hidròlisi de proteïnes, que condueix a la ruptura dels enllaços peptídics, es pot dur a terme mitjançant processos enzimàtics o químics [9]. Els processos químics, inclosa la hidròlisi alcalina o àcida mitjançant extraccions amb dissolvents, són perjudicials no només per al medi ambient sinó també per als humans que consumeixen els productes resultants [4,10]. Els processos químics, que són difícils de controlar, donen productes que contenen aminoàcids modificats [9]. En canvi, la hidròlisi enzimàtica es pot realitzar en condicions suaus, evitant així els ambients extrems que requereixen els tractaments químics. A més, els processos no produeixen reaccions secundaries ni disminueixen el valor nutricional de la font de proteïnes [8]. Diverses proteases, com l'Alcalase, la pepsina, el Protamex, la tripsina i la Neutrasa, s'utilitzen habitualment per hidrolitzar proteïnes, donant lloc a diversos tipus d'hidrolitzats de proteïnes i pèptids amb una varietat d'activitats biofuncionals. Un estudi va informar de la producció d'hidrolitzats de col·lagen amb activitat antioxidant a partir de gelatina de pell porcina mitjançant hidròlisi enzimàtica per pepsina i pancreatina [11].efectes secundaris de cistanche deserticolaEls subproductes del salmó es van hidrolitzar per produir hidrolitzats pèptics mitjançant diverses proteases, on els pèptids finals van mostrar excel·lents propietats antioxidants i antiinflamatòries [12].

L'objectiu de la investigació va ser: (a) identificar els hidrolitzats de col·lagen més actius produïts per hidròlisi enzimàtica mitjançant diferents proteases disponibles comercialment (Alcalase, Flavorzyme, Neutrase, Protamex, Bromelain i Papaïna); (b) per confirmar l'efecte de fraccionament de hidrolitzats de col·lagen obtinguts a partir de la hidròlisi enzimàtica, i (c) determinar les seves activitats antioxidants i antienvelliment in vitro.

2. Resultats i discussió

2.1.Efecte de la hidròlisi enzimàtica sobre els hidrolitzats de col·lagen

2.1.1.pH

Les propietats funcionals de les proteïnes es poden millorar mitjançant la hidròlisi de determinades proteases. En aquest estudi, es van utilitzar sis proteases diferents (Alcalase, Flavorzyme, Neutrase, Bromelain, Protamex i Papaïna) per hidrolitzar el col·lagen de la pell porcina per tal d'obtenir hidrolitzats de col·lagen actius de baix pes molecular.dosificació de cistanche redditEl canvi de pH dels hidrolitzats de col·lagen (CH) es mostra a la figura 1. El pH de la suspensió de col·lagen (mescla de pell porcina del 5%) era inicialment de 6.39-6,55 (a 0h). CH-Alcalase i CH-Flavorzyme van assolir un pH òptim (pH 8.0) a les 12 h d'incubació. CH-Protamex, CH-Bromelina i CH-Papain van assolir un pH òptim (pH7.0) a les 6 h d'incubació, mentre que CH-Flavorzyme va continuar disminuint de pH 6,39 a pH 5,69 durant 24 h d'incubació (figura 1). El pH d'un hidrolitzat proteic és un factor important que regula les reaccions d'hidròlisi enzimàtica[13]. Per tant, la generació d'hidrolitzats de col·lagen en condicions de pH diferent pot ser deguda a canvis en la conformació de l'enzim que depenen del pH, que poden afectar la seva bioactivació i propietats fisicoquímiques.

2.1.2. Electroforesi en gel de dodecil sulfat de sodi-poliacrilamida (SDS-PAGE)

Es mostren els perfils d'electroforesi en gel de dodecilsulfat de poliacrilamida (SDS-PAGE) de CH tractats amb diverses proteases durant 24 h (figura 2). El perfil peptídic de la suspensió de col·lagen (a les 0 h) mostrava una banda visible en el rang de pes molecular de baix a alt. Els resultats van indicar una hidròlisi ràpida en CH-Alcalase, CH-Neutrase, CH-Bronneline i CH-Protamex, ja que no hi havia bandes després de 3 h d'incubació. Les bandes d'alt pes molecular de CH-Alcalase, CH-Neutrase i CH-Protamex van disminuir d'una manera d'incubació depenent del temps. Tanmateix, CH-Bromeline no va variar amb el temps d'incubació perquè té la cervesa completament hidrolitzada després de només 1 h d'incubació. Curiosament, els CH van desaparèixer completament quan la mostra va reaccionar amb Alcalase o Neutrase durant 6 hores, cosa que indica que el col·lagen va actuar com a substrat adequat per a alguns dels altres enzims provats.beneficis de l'extracte de cistanche,Tanmateix, les bandes de CH-Flavorzyme i CH-Papain van aparèixer en el rang de pes molecular baix a alt després de 24 h. Les proteïnes es poden hidrolitzar parcialment en pèptids o aminoàcids per hidròlisi enzimàtica, depenent del tipus de proteasa, el temps d'incubació i la relació proteasa-substrat (quantitat de proteïna)[14]. El procés d'hidròlisi enzimàtica està determinat principalment per si el tipus de proteasa implicat és una endopeptidasa o una exopeptidasa [15, 16]. Com que l'Alcalase, la Neutrase i el Protamex són endopeptidases, es pot esperar que els seus processos d'hidròlisi trenquin els enllaços peptídics dels aminoàcids no terminals de manera aleatòria, facilitant així una més hidròlisi de proteïnes. D'altra banda, Flavorzyme és alhora una endopeptidasa i una exopeptidasa, que trenca el terminal no o N-terminal de les cadenes peptídiques. En aquest estudi, la proteïna de col·lagen contenia llocs d'unió, que eren més susceptibles a l'activitat exopeptidasa que a l'activitat endopeptidasa de Flavorzyme. Així, a causa de l'activitat de l'exopeptidasa, la hidròlisi de proteïnes de col·lagen per part de Flavorzyme va implicar la ruptura pas a pas dels enllaços peptídics des de l'N-terminal dels aminoàcids, la qual cosa va frenar la hidròlisi de les proteïnes.

2.1.3. Recuperació de proteïnes i contingut gratuït del grup d'amino

Es mostra la recuperació de proteïnes dels CH obtinguts mitjançant diferents proteases comercials (figura 3A). El control (suspensió de col·lagen) tenia un contingut de recuperació de proteïnes d'1,19 mg/mL. La recuperació de proteïnes és un paràmetre de l'eficiència de la hidròlisi enzimàtica. El baix contingut de recuperació de proteïnes de CH és indicatiu d'una major degradació de proteïnes. A més, la recuperació de proteïnes es correlaciona bé amb la solubilitat de proteïnes. Una major activitat hidrolítica pot ser causada per un augment de les cadenes laterals hidrofòbiques exposades, que condueix a un augment de les interaccions hidrofòbiques entre proteïnes i/o pèptids. Aquestes cadenes laterals hidrofòbiques poden conduir a una disminució de la solubilitat de les proteïnes, donant lloc a una major recuperació de proteïnes dels hidrolitzats. En el nostre estudi, el contingut de recuperació de proteïnes estava ben correlacionat amb els canvis en els patrons SDS-PAGE. Els nivells de recuperació de proteïnes més baixos i més alts es van registrar per a la hidròlisi d'Alcalase i Flavorzyme, respectivament. Per a l'eficiència de la hidròlisi relacionada amb el temps d'incubació, CH-Alcalase, CH-Bromelain i CH-Protamex van disminuir dràsticament en una hora d'incubació en comparació amb el control. La disminució del contingut de recuperació de proteïnes resultant de la hidròlisi de proteïnes va mostrar una relació inversa amb el contingut del grup amino. A més, la majoria dels CH, excepte la CH-Neutrase, presentaven un baix contingut de proteïnes entre les 3 i les 12 h. Després de 24 hincubacions, el seu contingut de proteïnes va tornar a augmentar en CH-Alcalase, CH-Flavorzyme, CH-Neutrase, CH-bromelina, CH-Protamex i CH-Papaina de la següent manera:0,83 mg/mL, 1,29 mg/ mL, 0,75 mg/mL, 0,97 mg/mL, 0,77 mg/ml i 1,11 mg/mL, respectivament. Alguns informes indiquen que el temps òptim d'hidròlisi depèn de diversos factors com l'espècie seleccionada, la matèria primera, l'enzim utilitzat, la taxa de matèria primera/enzim, la concentració de l'enzim i el grau d'hidròlisi que es persegueix, etc. [16]. ]. Alguns informes indiquen que la hidròlisi enzimàtica estesa (més de 24 h) pot conduir a una reducció de l'activitat de la proteasa; per tant, la hidròlisi enzimàtica s'ha de dur a terme dins de les 24 hores posteriors a la hidròlisi enzimàtica [17,18].

The free amino group content of CH, which is an indicator of enzymatic hydrolysis efficiency, was estimated(Figure 3B). The expected outcome of protein breakdown is that protein may be hydrolyzed into shorter peptide products. The free amino group content of the control was initially 0.14 mg/mL. The free amino group content of all CHs dramatically increased with increasing incubation time. After 24 h incubation, the free amino group content by descending order was: CH-Alcalase (1.00 mg/mL)>CH-Protamex(0.70 mg/mL)> CH-Neutrase(0.68 mg/mL)>CH-Bromeline (0.67 mg/mL)>CH-Flavorzyme (0.53 mg/mL)>CH-Papaïna (0,40 mg/mL). Les diferències habituals en el contingut de proteïnes totals o de grup amino lliure de mostres hidrolitzades enzimàticament poden estar relacionades amb l'especificitat de l'enzim. Depèn de les propietats d'un enzim durant el procés d'hidròlisi enzimàtica [16,17]. Per exemple, les proteases alcalines (com l'alcalasa) presenten activitats hidrolítices més altes en comparació amb les proteases àcides o neutres.

2.2. Efecte d'ultrafiltració sobre les propietats de l'hidrolitzat de col·lagen

Un procés d'ultrafiltració pot ser un mètode útil i avantatjós industrialment per produir petites fraccions peptídiques amb una mida molecular desitjada i una alta bioactivitat, depenent de la composició de l'hidrolitzat inicial i de l'activitat que s'està estudiant [19]. Es mostra la solubilitat, el contingut de grups amino lliures i el rendiment de CH després de la liofilització (taula 1). La solubilitat i el contingut del grup amino lliure del control eren de l'11,95 per cent i el 0,79 per cent, respectivament. Després de la hidròlisi enzimàtica i la ultrafiltració amb un tall de pes molecular de 3 kDa, es va observar la solubilitat més alta (21,17 per cent) i el contingut de grup amino lliure (14,17 per cent) a CH-Alcalase.<3 kda.="" however,=""><3kda was="" the="" lowest="" field="" (12.42%)observed.="" therefore,="" although="" ultrafiltration="" is="" useful="" in="" separating="" chs="" with="" low="" molecular="" weight,="" it="" may="" cause="" a="" reduction="" in="">

El pes molecular mitjà dels hidrolitzats de proteïnes és un factor important que determina les seves propietats biològiques [19]. En general, una fracció mitjana amb MW<3 kda="" represents="" a="" collagen="" hydrolysate;="" an="" average="" fraction="" with="" mw=""> 50 kDa represents gelatin, and an average fraction with MW>300 kDa representen col·lagen [20, 21]. La distribució relativa del pes molecular del control (mostra de pretractament), CH-Alcalase i CH-Alcalase<3 kda="" is="" depicted="" in="" figure="" 4.="" the="" molecular="" weight="" distribution="" was="" over="" 20,100="" da="" for="" the="" control,="" which="" did="" not="" include="" the="" collagen="" hydrolysate=""><3 kda).="" this="" could="" not="" be="" numerically="" provided="" in="" this="" study,="" as="" the="" detection="" limit="" of="" the="" index="" detector="" system="" only="" ranged="" from="" 106="" to="" 20,100="" da.="" however,="" ch-alcalase="" showed="" detectable="" values="" in="" a="" higher="" range="" of="" relative="" molecular="" weight="" distribution,="" which="" ranged="" from="" 20,100="" da="" to="" 4270="" da="" (maximum="" peak:12,600="" da).in="" ch-alcalase=""><3 kda,="" the="" molecular="" weight="" distribution="" mainly="" showed="" three="" peaks:="" one="" with="" an="" mw="" of="" approximately="" 4270="" da(maximum="" peak),="" one="" with="" an="" mw="" of="" approximately="" 424="" da,="" and="" one="" with="" an="" mw="" of="" approximately="" 222="" da="" and="" 102="" da.="" ultrafiltration="" is="" an="" effective="" purification="" method="" used="" to="" obtain="" low="" molecular="" weight="" peptides="" from="" crude="" hydrolysates.="" results="" indicated="" that="" enzymatic="" hydrolysis="" by="" alcalase="" clearly="" reduced="" the="" high="" mw="" of="" the="" control="" (either="" collagen="" or="" gelatin),="" and="" that="" ultrafiltration="" was="" an="" effective="" purification="" method="" that="" can="" be="" used="" to="" obtain="" low="" molecular="" weight=""><3 kda)="" from="" crude="" collagen="" hydrolysates.="" reportedly,="" low="" molecular="" weight="" peptides="" (2-20="" amino="" acids)="" are="" more="" biologically="" active="" compared="" to="" their="" parent="" polypeptide/="" proteins,="" which="" are="" larger="">

Es mostra la composició d'aminoàcids en els CH (taula 2). El CHS de diferents proteases tenia diferents composicions d'aminoàcids i propietats antioxidants [23]. La composició d'aminoàcids del col·lagen era rica en glicina (Gly), prolina (Pro) i àcid glutàmic (Glu). El contingut d'aminoàcids de CHs (CH-Alcalasa i CH-Alcalasa<3 kda)="" increased="" more="" than="" that="" of="" the="" control,="" following="" enzymatic="" hydrolysis="" with="" or="" without="" ultrafiltration.="" in="" particular,="" the="" content="" of="" gly,="" pro,="" and="" glu="" was="" much="" higher="" in=""><3 kda(gly="" 218="" mg/g,="" pro="" 152="" mg/g,="" and="" glu="" 120="" mg/g)="" than="" ch-alcalase(gly149="" mg/g,="" pro="" 95mg/g,="" and="" glu78="" mg/g).="" an="" increase="" in="" the="" content="" of="" these="" amino="" acids="" is="" strongly="" related="" to="" enhanced="" antioxidant="" capabilities="" 16,20].="" gly="" and="" pro="" contain="" hydrophobic="" amino="" acid="" groups,="" and="" glu="" contains="" negatively="" charged="" amino="" acid="" groups.="" these="" amino="" acids="" have="" been="" reported="" to="" enhance="" antioxidant="" activity="" because="" of="" their="" increased="" solubilities="" in="" lipids="" or="" via="" free="" radical="" reactions="">

Aquest article està extret de Molecules 2019, 24, 1104; doi:10.3390/molecules24061104 www.mdpi.com/journal/molecules