El mecanisme de Cistanche Deserticola que promou la funció intestinal

Yuan Gao, Chuanjie Zong, Fen Liu, Lei Fang, Runlan Cai, Yue Shi, Xi Chen, Yun Qi

Resum

Feniletanoideglicòsids(PhGs), una classe de compostos polifenòlics, es consideren un dels principals constituents bioactius deCistanchedeserticolaYC Ma (CD), l'extracte del qual s'utilitza per via oral en la medicina tradicional xinesa. Tot i que estudis farmacològics anteriors han informat que els PhG exerceixen moltes activitats, els seus perfils de transport intestinal no s'han aclarit. En aquest estudi, hem investigat la permeabilitat intestinal d'un extracte ric en PhG (PRE) deCistancheDeserticolacom a sistema integrat en el model de monocapa de cèl·lules Caco-2 mitjançant un sistema de bioassaig. Els resultats van mostrar que el PRE es transporta principalment mitjançant una difusió passiva mal absorbida per un gradient de concentració sense sortida, que proporciona la base farmacocinètica per a l'aplicació clínica de PhG enCistanche Deserticola. També vam determinar la permeabilitat intestinal de tres principalsPhGs[acteòsid (AC), isoacteòsid (IS) i equinacòsid (EC)]per HLPC. A més, hem desenvolupat un nou mètode de detecció de fluorescència HPLC per determinar amb precisió la quantitat de flux d'AC i IS. Com era d'esperar, les característiques de transport dels tresPhGssón coherents amb els de PRE, cosa que indica que el sistema de bioassaig actual és adequat i fiable per a l'avaluació de les característiques de transport dels grups d'ingredients actius (AIG) a PRE. A més, aquest sistema també pot ser adequat per a altres extractes de plantes amb una bioactivitat adequada.

Contacte:joanna.jia@wecistanche.com/ WhatsApp: 008618081934791

Cistanche deserticola té molts efectes, feu clic aquí per saber-ne més

Introducció

La línia cel·lular Caco-2, que es va derivar d'adenocarcinomes de còlon humà, presenta característiques semblants als enteròcits. En condicions normals, les cèl·lules Caco-2 es diferencien espontàniament de les cèl·lules madures i formen monocapes intactes [1]. Les cèl·lules adjacents s'adhereixen mitjançant unions estretes formades al costat apical de la monocapa, que poden discriminar els fàrmacs transportats de manera passiva i activa a través de la capa epitelial [2]. A causa de la similitud morfològica i bioquímica amb els enteròcits normals, les monocapes de cèl·lules Caco-2 serveixen com a model in vitro ben acceptat per a l'estudi del potencial d'absorció intestinal i les característiques de transport dels fàrmacs [3, 4].

A diferència dels productes químics, els extractes de plantes (PE) són mescles l'activitat biològica i els components actius de les quals sovint no estan ben identificats [5]. A més, les propietats de transport intestinal del PE, a diferència de les propietats dels seus components, estan estretament relacionades amb l'ús clínic. Les mesures de flux per a una mostra de prova a través d'una monocapa de cèl·lules Caco-2 solen incloure mètodes químics, com ara HPLC, LC/MS, etc. Tot i que aquests mètodes són eines potents, són complexos, requereixen molt de temps, són costosos i ocasionalment requereixen equips sofisticats. Més important encara, ni un component únic ni un component minoritari poden reflectir l'EP en el seu conjunt. Per tant, cal establir un nou enfocament independent de la determinació dels components per identificar i avaluar les característiques de transport de PE.

CistanchedeserticolaYC Ma (CD), una planta holoparàsita, és una medicina tradicional xinesa comuna que s'utilitza principalment per tractar la deficiència renal, la debilitat corporal i el restrenyiment, i aquests usos s'han registrat oficialment a la Farmacopea Xinesa [6]. Els glucòsids feniletanoides (PhG), inclosos els equinacòsids (EC), acteòsids (AC), isoacteòsids (IS), etc., són una classe de compostos polifenòlics [7]. Es consideren un dels principals constituents bioactius deCistancheespècie [8]. Els estudis farmacològics han demostrat que la bioactivitat dePhGsés divers i inclou efectes antioxidants [9], antifatiga [10], hepatoprotectors [11], immunomoduladors [12], antiinflamatoris [7, 13] i neuroprotectors [14]. No obstant això, les característiques del transport intestinal dePhGsno han estat investigats. En aquest estudi, vam explorar la permeabilitat intestinal d'un extracte ric en PhG (PRE) de CD com a sistema integrat i la permeabilitat de tres PhG principals (AC, IS i EC) en cèl·lules Caco-2 diferenciades. Els nostres resultats van indicar que el PRE es transporta principalment mitjançant una difusió passiva mal absorbida per un gradient de concentració sense efluència, que proporciona la base farmacocinètica per a l'aplicació clínica de PhG a la MC.

Materials i mètodes

Materials

The human intestinal Caco-2 cell line was obtained from the American Type Culture Collection (ATCC, Rockville, MD, USA). AC, IS and EC (>El 98 per cent) es van comprar a Must Biotechnology Co. (Chengdu, Xina). El medi d'àguila modificat de Dulbecco (DMEM), el sèrum boví fetal (FBS) i els aminoàcids no essencials (NEAA) van ser produïts per Gibco BRL (Grand Island, NY, EUA). 6-Les plaques TranswellTM de pou (insereix l'àrea de creixement de la membrana 4,67 cm2) es van obtenir de Corning (Costar) Inc. (Tewksbury, MA, EUA). El col·lagen de cua de rata es va obtenir de Sigma-Aldrich (St. Louis, MO, EUA). Tots els reactius i productes químics per a l'anàlisi HPLC eren de grau analític.

Preparació de PRE de Cistanche deserticola

El material CD assecat a l'aire es va pols i es va extreure per percolació amb etanol al 70%. La fracció rica en PhG es va preparar tal com es va descriure anteriorment [10] i es va extreure amb alcohol n-butílic saturat d'aigua. El licor d'extracte es va concentrar i es va assecar a pressió reduïda. L'espectrofotometria UV de resina macroporosa [15] va mesurar un contingut de PhG del 78,4 per cent. La mostra final va representar un rendiment de l'1,75 per cent de matèria primera en pes sec. La mostra obtinguda es va emmagatzemar a -20 graus fins a un nou ús.

Determinació d'AC, IS i EC per HPLC

Es va utilitzar un sistema HPLC Shimadzu equipat amb el programari de solució LC per analitzar els continguts d'AC, IS i EC a PRE. Es va utilitzar una columna Intersil C18 de fase inversa (4, 6 mm × 25 0 mm, 5 μm) i es va mantenir a temperatura ambient. Les fases mòbils eren acetonitril i aigua que contenia 0,1 per cent d'àcid fosfòric (v/v) amb elució en gradient (taula 1) a un cabal d'1,0 ml/min. El detector d'espectrofotòmetre UV es va establir a 334 nm. Per determinar amb precisió el flux d'AC i IS, hem desenvolupat un nou mètode de detecció de fluorescència HPLC (HPLC-FLD). Després d'una anàlisi estructural i una exploració de longitud d'ona de fluorescència (dades no mostrades), vam obtenir les condicions òptimes de detecció de fluorescència per a AC (Ex: 338 nm, Em: 448 nm) i IS (Ex: 320 nm, Em: 434 nm)

El mètode analític HPLC es va validar utilitzant les següents característiques de rendiment: estabilitat, linealitat, sensibilitat, precisió (variabilitat intra i interdia) i precisió. Els analits del tampó de transport es van emmagatzemar a 25 graus a la foscor durant 24 hores i es va mesurar la seva estabilitat. Els analits eren molt estables en presència de vitamina C (0,4 per cent) perquè els valors de desviació estàndard relativa (RSD) a les zones màximes eren <3,5 per="" cent.="" l'equació="" de="" regressió="" lineal,="" el="" coeficient="" de="" correlació,="" el="" rang="" de="" linealitat,="" el="" lod="" i="" el="" loq="" per="" a="" ac,="" is="" i="" ec="" es="" mostren="" a="" la="" taula="" 2.="" els="" lod="" (18–30="" nm)="" i="" loq="" (60–100="" nm)="" els="" valors="" il·lustren="" que="" els="" mètodes="" hplc-fld="" i="" hplc-uv="" són="" altament="" sensibles.="" els="" valors="" rsd="" que="" expressen="" la="" precisió="" del="" mètode="" eren="" tots="">< 2="" per="" cent="" per="" a="" la="" variabilitat="" intra="" i="" interdia,="" cosa="" que="" indica="" una="" bona="" precisió.="" per="" a="" l'avaluació="" de="" la="" recuperació,="" es="" va="" afegir="" ac,="" is="" i="" ec="" al="" tampó="" de="" transport="" per="" obtenir="" tres="" nivells="" de="" concentració="" (alt,="" mitjà="" i="" baix).="" els="" valors="" de="" recuperació="" del="" mètode="" per="" als="" analits="" es="" resumeixen="" a="" la="" taula="" 3.="" les="" recuperacions="" mitjanes="" van="" oscil·lar="" entre="" el="" 90,0%="" i="" el="" 96,4%,="" cosa="" que="" indica="" una="" bona="" precisió.="" en="" conclusió,="" els="" mètodes="" d'hplc="" establerts="" són="" satisfactoris="" pel="" que="" fa="" a="" la="" linealitat,="" la="" sensibilitat,="" la="" precisió="" i="" l'exactitud="" per="" a="" la="" quantificació="" d'ac,="" is="" i="" ec="" al="" tampó="" de="">

Determinació de PRE per sistema d'assaig biològic

El bioassaig (capacitat antioxidant total) es va basar en l'assaig FRAP (ferric reductor/antioxidant power) que hem descrit anteriorment [16] i validat en termes de linealitat i precisió (variabilitat intra i interdia). La linealitat del mètode de bioassaig es va determinar a partir de les corbes de calibratge. L'interval de concentració de linealitat va ser 0.0625 − 40 ug/ml (y=0,0258x més 0,0968, R2=0,996). La precisió del mètode de bioassaig establert es va determinar en termes de variabilitat intra i interdia per a una anàlisi de PRE (10,0 ug/ml). La repetibilitat intradia del mètode es va determinar a partir de cinc determinacions consecutives el mateix dia. La repetibilitat entre dies es va mesurar a partir de cinc determinacions consecutives en tres dies diferents. Els valors de RSD per a la precisió del mètode van ser de l'1,014 per cent i del 4,72 per cent per a la variabilitat intradia i entre dies, respectivament, cosa que indica una bona precisió. Així, el mètode de bioassaig establert és satisfactori pel que fa a la linealitat, la precisió i la precisió per a la quantificació de PRE al tampó de transport.

Cultiu cel·lular

Les cèl·lules de caco{{0}} es van cultivar a 37 graus i un 95 per cent d'humitat relativa en una atmosfera que contenia un 5 per cent de CO2 i un medi format per DMEM, un 10 per cent de FBS, un 1 per cent de NEAA, un 1 per cent de L-glutamina, penicil·lina ( 100 U/ml) i estreptomicina (100 ug/ml). El medi es va canviar cada dos dies durant el creixement i la diferenciació cel·lular. Les cèl·lules es van cultivar en matràs de plàstic de 75-cm2 i es van collir cada 3-5 dies amb un 0,05 per cent d'EDTA-tripsina. Per als experiments de transport, les cèl·lules es van sembrar a una densitat d'1 × 105 cèl·lules/cm2 sobre insercions Transwell recobertes de col·lagen. Aproximadament 21 dies després de la sembra, les monocapes es van utilitzar per als experiments de transport. La seva integritat es va determinar mesurant la resistència elèctrica transepitelial (TEER) a través de les monocapes amb un EVOM equipat amb ENDOHM-SNAP (World Precision Instruments, Inc., EUA). Els valors TEER de la monocapa de cèl·lules Caco-2 havien de superar els 500 O∙cm2.

Experiments de transport

La monocapa es va rentar amb tampó de transport (tampó P que conté 10 mM de HEPES, 1 mM de piruvat de sodi, 10 mM de glucosa, 3 mM de CaCl2 i 145 mM de NaCl, pH 7,4) i es va preincubar durant 20 min a 37 graus. Després d'eliminar el tampó de transport, es va afegir un tampó de transport fresc que contenia mostres de prova a la cambra apical (AP) (1, 5 ml) en estudis direccionals AP a basolaterals (BL) o la cambra BL (2, 5 ml) en estudis direccionals BL a AP. Per als assajos AC, IS i EC mitjançant HPLC, es va treure una alíquota (300 ul) de cada cambra receptora a diferents intervals de temps (30, 60, 90 i 120 min). La cambra receptora es va reposar amb el mateix volum de tampó de transport fresc preescalfat (37 graus) després de cada mostreig. Les mostres recollides es van emmagatzemar a -20 graus per a un ús posterior. Per a la determinació de PRE mitjançant bioassaig, només es van prendre les mostres als 120 min. A causa de la inestabilitat de PRE, AC, IS i EC, es va afegir un 0,4 per cent (p/v) de vitamina C per estabilitzar les mostres per tal de determinar els continguts de AC, IS i EC per HPLC i les mostres per al PRE Els bioassaigs es van analitzar immediatament després de ser mostrejats. Es va calcular el valor del coeficient de permeabilitat aparent (Papp o 'Papp) de cada mostra.

Anàlisi de dades

Els valors de Papp a les direccions AP BL o BLAP d'AC, IS i EC es van calcular a partir de l'equació següent: Papp {{0}} (4Q/4t)/(AC0), on Papp és el coeficient de permeabilitat aparent (cm/s) determinat per HPLC. (4Q/4t) és la velocitat d'aparició del compost de prova (AC, IS o EC) al costat del receptor (μmol/s); A és la superfície de la inserció (cm2); C0 és la concentració inicial del compost de prova al costat del donant (μmol/ml). Concretament, es va utilitzar la unitat de massa "ug" en lloc de "μmol" quan es van calcular els valors de "Papp". Les dades s'expressen com a mitjanes ± SD.

Resultats

Composició d'Acteòsid, Isoacteòside i Echinacoside en PRE de Cistanche Deserticola

Com que AC, IS i EC es consideren els principals PhG bioactius de les espècies de Cistanche [8], vam analitzar el seu contingut a PRE mitjançant HPLC-UV. El cromatograma representatiu es mostra a la figura 1. La identificació d'aquests components es va basar en comparar els temps de retenció i l'espectre UV amb els d'estàndards autèntics a una longitud d'ona de 334 nm. Els continguts d'AC, IS i EC a PRE eren del 26,60 per cent, 1,84 per cent i 32,83 per cent, respectivament. Així, aquests tres compostos representen el 61,27 per cent del PRE; a més, els resultats anteriors indiquen que el contingut de PhG a PRE és del 78,4 per cent. Per tant, AC, IS i EC representen aproximadament el 80 per cent dels PhG a PRE.

Capacitats antioxidants totals de PRE, AC, IS i EC

S'han informat estudis sobre l'activitat antioxidant de PhG de CD [9], i AC, IS i EC representen aproximadament el 80 per cent dels PhG a PRE. Així, es van analitzar les capacitats antioxidants totals de PRE, AC, IS i EC i s'expressen mitjançant els valors FRAP (× 10–6 mmol). Com es mostra a la figura 2, quan el valor de FRAP era de 8 × 10–6 mmol, les concentracions finals de PRE, AC, IS i EC eren de 6,20 ug/ml, 3,14 ug/ml, 22,92 ug/ml i 4,89 ug/ml. ml, respectivament, indicant que la capacitat antioxidant total d'aquestes quatre mostres es classifica de la següent manera: AC > EC > PRE > IS. La bioactivitat de PRE s'atribueix als seus grups d'ingredients actius (AIG). Durant aproximadament el 60 per cent de PRE, AC i EC van mostrar una activitat antioxidant total més forta que PRE i IS. Com que l'IS (1,84 per cent) constitueix una fracció molt petita de PRE, altres components, com l'IS feblement antioxidant, també són clarament actius en PRE. Sorprenentment, l'activitat antioxidant total va variar gairebé 7- vegades entre AC i el seu isòmer IS, cosa que indica no només el nombre de grups hidroxil fenòlics [9] sinó també la posició dels grups hidroxil fenòlics a la molècula afectava l'anti -efecte oxidatiu.

Validació de les monocapes Caco-2

Per validar el sistema de monocapa de cèl·lules Caco-2, els valors Papp del propranolol (un marcador ben transportat) i el groc Llucifer (un marcador mal transportat) de l'AP al BL a través de les monocapes de Caco-2 es van determinar com a 1,51 × 10–5 cm/s i 2,8 × 10–7 cm/s, respectivament, i aquests valors coincidien amb els publicats en informes anteriors [17, 18]. L'assaig d'activitat de la fosfatasa alcalina també va confirmar que les monocapes de cèl·lules Caco-2 eren qualitativament comparables a l'epiteli intestinal prim [19]

La permeabilitat de l'acteòsid, l'isoacteòsid i l'echinacòsid

In general, the Papp values of well-absorbed drugs were high (>1.0 × 10–5 cm/s), mentre que els dels fàrmacs poc absorbits eren baixos (< 1.0="" ×="" 10–6="" cm/s)="" [3].="" as="" shown="" in="" table="" 4,="" the="" papp="" values="" of="" ac,="" is="" and="" ec="" was="" nearly="" on="" the="" order="" of="" 10–7="" cm/s,="" indicating="" that="" these="" compounds="" were="" poorly="" permeable.="" furthermore,="" efflux="" or="" active="" transport="" were="" not="" observed="" because="" the="" ratios="" of="" papp="" bl="" to="" ap="" papp="" ap="" to="" bl="" for="" ac,="" is="" and="" ec="" was="" between="" 0.90="" ~="" 1.55,="" and="" the="" criterion="" of="" net="" efflux="" proposed="" by="" the="" fda="" guidance="" is="" a="" ratio="" less="" than="" 2="" [20].="" based="" on="" the="" kinetic="" curves="" presented="" in="" fig.="" 3,="" the="" bidirectional="" transport="" percentages="" of="" ac,="" is="" and="" ec="" at="" 200="" μm="" increased="" linearly="" with="" time.="" the="" transport="" rate="" (tr)="" values="" of="" the="" three="" compounds="" increased="" linearly="" in="" both="" directions="" between="" approximately="" 100="" and="" 300="" μm="" (fig.="" 4).="" these="" results="" indicate="" that="" the="" main="" transport="" mechanism="" of="" ac,="" is="" and="" ec="" is="" also="" passive="">

La permeabilitat del PRE

Els resultats anteriors indiquen que la capacitat antioxidant total de PRE es deu almenys al 61,27 per cent de l'AIG de PRE. Així, vam avaluar el TR de PRE en funció de la seva corba concentració-efecte de la capacitat antioxidant total i vam calcular els valors de Papp per tal de reflectir les característiques de transport de PRE. Els 'valors Papp de PRE per a AP!BL i BL!AP van ser (2,16 ± 0},26) × 1{0–7 cm/s i (3,13 ± 0,29) × 10–7 cm/ s, respectivament, indicant que aquest compost era poc permeable. A més, l'eflux o el transport actiu no era evident perquè la proporció de 'Papp BL a AP / 'Papp AP a BL per PRE era d'1,45 [20]. A més, el TR bidireccional de PRE va augmentar linealment entre aproximadament 300 i 900 ug/ml (Fig. 5). La manca de preferència direccional dels resultats suggereix que la difusió passiva és el principal mecanisme de transport de PRE.

Discussió

En comparació amb els productes farmacèutics altament purificats, el PE és generalment una barreja que consta de centenars de components amb propietats fisioquímiques molt diferents. Per tant, PE exerceix una acció sinèrgica sistemàtica, multiobjectiu i multicanal a causa del seu complex AIG [21], que dificulta l'anàlisi de les característiques de transport de PE. Per avaluar les propietats de transport de PE de manera més científica, alguns investigadors han identificat diversos components, en lloc d'un únic component, a PE [22-24]. No obstant això, un nombre limitat de components no pot reflectir el PE en el seu conjunt. Tanmateix, determinar tots els components de PE és impossible. A més, si diversos components de PE mostren característiques de transport completament diferents, les característiques de transport holístiques de PE seran difícils d'identificar.

A la dècada de 1990, es van utilitzar sistemes de bioassaig per avaluar el TR dels agents antimicrobians [25]. El 2005, Eguchi i els seus col·legues [26] havien avaluat l'activitat antioxidant de l'extracte de pastanaga utilitzant medis BL de cèl·lules Caco-2 diferenciades; aquest enfocament és més adequat per reflectir situacions in vivo.

A partir d'un informe previ de l'activitat dels PhGs [9] i dels nostres resultats (Fig. 2), el TR d'AIG en PRE es pot avaluar determinant la capacitat antioxidant total del medi a la cambra receptora. Després dels experiments de transport, vam trobar que el TR de PRE era similar en ambdues direccions, i aquest transport estava insaturat i mal absorbit ('Papp < ​​1.0="" ×="" 10–6="" cm/s)="" [3],="" i="" no="" va="" indicar="" l'eflux,="" cosa="" que="" suggereix="" que="" la="" difusió="" passiva="" per="" un="" gradient="" de="" concentració="" és="" el="" principal="" mecanisme="" de="" transport="" de="" pre="" (fig.="" 5).="" a="" més,="" les="" característiques="" de="" transport="" de="" pre="" són="" coherents="" amb="" les="" d'ac,="" is="" i="" ec,="" els="" components="" efectius="" que="" mostren="" activitat="" antioxidant="" a="" pre="" (figura="" 4="" i="" taula="" 4).="" aquest="" resultat="" s'esperava="" i="" va="" indicar="" que="" el="" sistema="" de="" bioassaig="" actual="" és="" adequat="" i="" fiable="" per="" a="" l'avaluació="" de="" les="" característiques="" de="" transport="" d'aig="" a="" pre="" en="" cèl·lules="" caco-2="">

En contrast amb el valor Papp canònic, que s'utilitza habitualment per reflectir el transport d'un sol compost, el valor Papp obtingut a partir del TR basat en la corba d'efecte concentració pot reflectir no només els components que penetren les monocapes amb una estructura intacta, sinó que també impliquen altres factors relacionats amb l'activitat objectiu, com els metabòlits dels components, els productes degradats químicament i fins i tot algunes citocines secretades per les cèl·lules Caco-2 en resposta a l'estimulació que pot afectar la bioactivitat objectiu. Així, el multifactor esmentat anteriorment, més que només els components intactes transportats, determina el "valor Papp". Per tant, "Papp pot correlacionar més fortament en situacions de Vivo que el valor canònic de Papp [26]. En aquest estudi, vam aclarir la naturalesa difusa passiva i poc absorbida de PRE en funció del seu valor Papp, i aquesta naturalesa pot estar relacionada amb la dosi alta i el llarg període de tractament clínic de la MC [27]. No obstant això, aquestes troballes proporcionaran una guia més sistemàtica per als metges en l'aplicació de la CD quan només s'han identificat les característiques de transport de la majoria d'AIG en CD, no només els PhG.

Tanmateix, l'element de bioactivitat seleccionat ha de ser prou sensible per ser detectat al medi de la cambra receptora, la qual cosa suposa un repte per a l'establiment d'un sistema d'assaig biològic per avaluar les característiques de transport del PE. A més, la bioactivitat també hauria de dependre de tants components com sigui possible. En el nostre estudi, l'assaig de capacitat antioxidant total era més adequat que diversos altres mètodes (S1 Fig.). Però tot i així, el nostre assaig només pot detectar el TR de PRE als 120 min.

En conjunt, el present estudi va establir un nou sistema de bioassaig per avaluar la permeabilitat intestinal de PRE en cèl·lules Caco-2 diferenciades. Els resultats obtinguts van mostrar que una difusió passiva mal absorbida per un gradient de concentració sense efluència és el principal mecanisme de transport de PRE (Fig. 5), que proporciona la base farmacocinètica per a l'aplicació clínica de PhG en la MC. L'ús d'un nou sistema de bioassaig per avaluar el TR i, per tant, calcular els valors de Papp per avaluar la propietat del transport intestinal d'AIG en PE és clarament factible. Aquest enfocament també pot ser adequat per a altres PE donada la bioactivitat adequada

Informació de suport

S1 Fig. Efectes de PRE sobre (A) anió superòxid, (B) radical hidroxil, (C) producte de peroxidació lipídica i (D) radical DPPH. Els procediments d'assaig es van realitzar segons informes anteriors [1, 2] sense utilitzar tampó de transport. Els valors IC50 (50 per cent de concentració d'inhibició) i SC50 (50 per cent de concentració d'eliminació) es van calcular a partir de les corbes estàndard de concentració-resposta. (DOCX)

Aportacions de l'autor

Va concebre i dissenyar els experiments: YG XC YQ. Realitzat els experiments: YG CZ FL LF RC YS. S'han analitzat les dades: CZ YG YQ. Reactius/materials/eines d'anàlisi aportats: RC. Va escriure el document: YG YQ

Departament de Recerca del Centre de Farmacologia i Toxicologia, Institut de Desenvolupament de Plantes Medicinals, Acadèmia Xinesa de Ciències Mèdiques i Col·legi Mèdic de la Unió de Pequín, Beijing, República Popular de la Xina,

Universitat de Medicina Xinesa de Heilongjiang, Harbin, Heilongjiang, República Popular de la Xina