ResumTot i que l'envelliment és el factor de risc més gran de les malalties cròniques humanes (càncer, diabètics, cardiovasculars i neurodegeneratives), es coneixen poques intervencions a més de la restricció calòrica i un petit nombre de fàrmacs (amb efectes secundaris substancials) que tracten directament l'envelliment. Per tant, hi ha una necessitat urgent de noves opcions que generalment puguin retardar els processos d'envelliment i prevenir malalties relacionades amb l'edat. L'envelliment cel·lular és la base dels processos d'envelliment. La vida cronològica (CLS) del llevat Saccharomyces cerevisiae és el sistema model ben establert per investigar les intervencions de l'envelliment cel·lular postmitòtic humà. CLS es defineix com el nombre de dies que les cèl·lules romanen viables en una fase estacionària. Hem desenvolupat un mètode quantitatiu nou, barat i ràpid per mesurar CLS en cultius cel·lulars incubats juntament amb diversos agents químics i controls en plaques de 96-pous. El nostre protocol PICLS amb (1) l'ús de iodur de propidi per a la lectura de supervivència cel·lular basada en fluorescents en un lector de microplaques i (2) la mesura del recompte total de cèl·lules mitjançant l'absorció de OD600nm de la mateixa placa proporciona una capacitat real d'alt rendiment. Depenent de la logística, es poden processar grans nombres de plaques en paral·lel, de manera que el cribratge de milers de compostos sigui factible en poc temps. El mètode es va validar mesurant l'efecte de la rapamicina i la restricció calòrica sobre el CLS del llevat. Hem utilitzat aquest enfocament per a la detecció d'agents químics. Hem descobert el potencial antienvelliment/neuroprotector del 2,5-anhidro-D-manitol (2,5-AM) i suggerim el seu ús individualment o en combinació amb altres intervencions antienvelliment.

El glicòsid de cistanche també pot augmentar l'activitat de la SOD en els teixits del cor i del fetge, i reduir significativament el contingut de lipofuscina i MDA a cada teixit, eliminant eficaçment diversos radicals reactius d'oxigen (OH-, H₂O₂, etc.) i protegint contra els danys de l'ADN causats. per radicals OH. Els glucòsids feniletanoides de Cistanche tenen una forta capacitat d'eliminació dels radicals lliures, una capacitat reductora superior a la de la vitamina C, milloren l'activitat de SOD en la suspensió d'esperma, redueixen el contingut de MDA i tenen un cert efecte protector sobre la funció de la membrana espermàtica. Els polisacàrids de Cistanche poden millorar l'activitat de SOD i GSH-Px en eritròcits i teixits pulmonars de ratolins senescents experimentalment causats per D-galactosa, així com reduir el contingut de MDA i col·lagen al pulmó i el plasma, i augmentar el contingut d'elastina. un bon efecte d'eliminació de DPPH, allarga el temps d'hipòxia en ratolins senescents, millora l'activitat de SOD al sèrum i retarda la degeneració fisiològica del pulmó en ratolins senescents experimentalment Amb la degeneració morfològica cel·lular, els experiments han demostrat que Cistanche té la bona capacitat antioxidant. i té el potencial de ser un fàrmac per prevenir i tractar malalties de l'envelliment de la pell. Al mateix temps, l'echinacòsid a Cistanche té una capacitat significativa per eliminar els radicals lliures de DPPH i té la capacitat d'eliminar espècies reactives d'oxigen i prevenir la degradació del col·lagen induïda pels radicals lliures, i també té un bon efecte reparador sobre el dany anònic dels radicals lliures de timina.

Feu clic per veure els productes anti-envelliment

【Per a més informació: david.deng@wecistanche.com / WhatApp:86 13632399501】

Paraules clauSaccharomyces cerevisiae · Vida útil cronològica · Cribratge químic · Compost antienvelliment · 2,5-anhidro-D-manitol

Introducció

The growing fraction of the elderly (>65 anys) entre la població total (des del ~ 10% a tot el món (per sobre del 20% als països del primer món) el 2020 fins al 16% extrapolat el 2050), així com la seva esperança de vida creixent (en ~ 10 anys des del 1960 als països del primer món). ), s'enfronta al món amb problemes cada cop més difícils [1, 2]. A més de reduir en general l'activitat vital, l'envelliment continua sent el major factor de risc per al desenvolupament de malalties cròniques que, posteriorment, comprometen la vida humana independent i, finalment, condueixen a la mort [3–7]. Els enfocaments mèdics actuals per prevenir les patologies relacionades amb l'edat són recomanacions per a un estil de vida saludable, inclòs l'exercici i la dieta. Tanmateix, aquestes intervencions per si soles no són suficients per prevenir l'aparició de malalties relacionades amb l'edat.

L'envelliment es caracteritza per una pèrdua progressiva de la integritat fisiològica, l'eficiència en les funcions cel·lulars i la senyalització metabòlica [8]. Els esforços creixents es dirigeixen a comprendre els processos d'envelliment cel·lular que afecten la xarxa d'interaccions de gens i proteïnes altament interconnectades i funcionalment redundants [8, 9]. Malgrat la complexitat de l'envelliment, investigacions recents en diferents sistemes de models, inclosos els mamífers, han demostrat que el retard de l'envelliment i l'augment de la salut són factibles mitjançant intervencions contra l'envelliment com l'aplicació de l'administració de fàrmacs rapamicina i la restricció de calories (glucosa) [10-15]. Per tant, ampliar el repertori de compostos anti-envelliment que es poden utilitzar com a terapèutiques geroprotectores i reduir els seus efectes secundaris no desitjats és una de les estratègies prometedores que poden retardar l'envelliment i allargar la salut.

Investigacions recents han demostrat que els mecanismes moleculars observats en l'envelliment humà es conserven en diferents organismes, inclòs el llevat unicel·lular [8, 10, 16, 17]. El llevat germinatiu Saccharomyces cerevisiae és un dels organismes model més estudiats per descobrir els processos biològics implicats en l'envelliment cel·lular. Els avantatges d'estudiar l'envelliment del llevat inclouen un temps de generació curt, una vida útil manejable i la seva capacitat per a assajos d'alt rendiment. Per tant, aquest organisme es va convertir en una potent eina per a la identificació d'intervencions anti-envelliment. El llevat s'utilitza habitualment per estudiar l'envelliment de dues maneres diferents: la vida útil replicativa (RLS) i la vida cronològica (CLS) [18]. L'RLS mesura el nombre de vegades que es divideix una cèl·lula individual, un model d'envelliment per a cèl·lules mitòtiques com les cèl·lules mare. El CLS mesura el temps durant el qual una cèl·lula que no es divideix roman viable en la fase estacionària, un model d'envelliment per a cèl·lules post-mitòtiques com les neurones. La viabilitat de les cèl·lules de llevat envellides en condicions de fase estacionària privades de nutrients disminueix i, finalment, moren.

El CLS s'ha mesurat tradicionalment estimant els recomptes d'unitats formadores de colònies (CFU) a la placa d'agar [18]. Les cèl·lules de llevat en un matràs amb medi total (més o igual a 20 ml) s'exposen a un sol compost químic. En diferents moments (per exemple, després de 2, 5 i 8 dies), petites alíquotes del cultiu d'envelliment cronològic del fask es dilueixen en sèrie, es posen en plaques d'agar nutritiu i s'incuben durant 2-3 dies per a la formació i el recompte de colònies. La fracció de supervivència es determina a partir de la CFU per a cada punt d'edat cronològica en relació al dia 1 (considerada una supervivència cel·lular del 100 per cent). L'enfocament de CFU és quantitatiu, però associat a molts inconvenients. Requereix múltiples dilucions en sèrie, etapes de placa i períodes d'incubació per aparèixer les colònies. El recompte de colònies es realitza amb instruments manuals o costosos. A més, aquest mètode no és adequat i és massa car per al cribratge d'alt rendiment (HTS) de milers de compostos perquè requereix quantitats substancials dels fàrmacs provats, cultius en matràs de gran volum i moltes plaques d'agar. Malauradament, el mètode CFU i totes les variants recents per mesurar CLS depenen críticament de la capacitat de les cèl·lules post-mitòtiques per tornar a entrar a la fase mitòtica. En principi, aquesta metodologia no pot distingir el llevat en detenció mitòtica de les cèl·lules mortes.

Els avenços tècnics actuals en els mètodes derivats de CFU mesuren la supervivència i el creixement cel·lular basant-se en el creixement del llevat en fase estacionària exposat a fàrmacs en un cultiu ric en nutrients, ja sigui en un medi líquid o mitjançant un assaig de taques en una placa d'agar [17, 19-21] . Després de 24 h, el creixement de les cèl·lules envellides en medi líquid es mesura mitjançant l'absorbància a OD600nm, mentre que en l'assaig de taques, el creixement del cultiu envellit amb taques al medi d'agar s'identifica visualment després de 48 h. La millora logística inclou l'ús de plaques de 96-pous que permeten un cribratge limitat de soques de deleció química o de genoma. Per a les soques de supressió de llevats marcades agrupades, es requereix citometria de flux per quantificar la viabilitat de la soca individual [22].

El iodur de propidi (PI) és un colorant fluorescent que només entra a les cèl·lules mortes i, per tant, és un marcador potent per a la quantificació directa de la viabilitat cel·lular [23–25]. Anteriorment, els estudis van utilitzar un enfocament basat en PI per mesurar CLS i quantificar la viabilitat cel·lular mitjançant l'anàlisi de les imatges adquirides per un comptador de cèl·lules fluorescents, transil·luminador UV o citometria de flux [26, 27]. Tanmateix, els múltiples requisits de processament de mostres, imatges i programari per a l'anàlisi de dades són cars i requereixen temps, cosa que dificultava aquests mètodes en aplicacions reals d'alt rendiment. La introducció de colorants alternatius com el verd SYTOX té un valor limitat en un entorn d'alt rendiment a causa dels costos prohibitius [26].

Per tant, calen nous mètodes per quantificar la viabilitat de la cèl·lula envellida per evitar les limitacions associades a les metodologies existents. En aquest treball, descrivim PICLS, un mètode de mesura CLS basat en PI que és independent del creixement. El nostre nou enfocament es basa en la incubació de cèl·lules de llevat amb diversos compostos de prova o diferents condicions de medi de prova en plaques de 96-pous. Utilitzem PI per quantificar la supervivència cel·lular. La lectura ràpida i eficaç (en un termini de ~ 15 min) la proporciona un lector de microplaques, un dispositiu de baix cost disponible a la majoria de laboratoris. Aquesta metodologia barata és molt adequada per al cribratge a gran escala dels agents químics per identificar compostos anti-envelliment, ja que molts compostos, controls o dilucions diferents es poden col·locar convenientment en una sola placa i es poden processar un gran nombre de plaques en paral·lel. A més, vam validar el nostre mètode determinant l'extensió del CLS del llevat mitjançant intervencions anti-envelliment conegudes com l'administració de rapamicina i la restricció de calories. Una pantalla ràpida de substàncies químiques disponibles al nostre laboratori va revelar inesperadament 2,5-anhidro-D-manitol (2,5-AM) que allarga la vida útil del llevat. També vam confirmar l'activitat antienvelliment de 2,5-AM amb mètodes tradicionals de creixement. Altres anàlegs de sucre provats no van produir cap efecte similar.

Resultats

Desenvolupament d'un mètode per quantificar la viabilitat cel·lular mitjançant la mesura de la fluorescència de iodur de propidi al lector de microplaques

El nostre nou protocol comença amb l'exposició de cèl·lules de llevat de tipus salvatge o els seus mutants col·locats en medis rics en nutrients en plaques de 96-pous juntament amb una concentració específica de compostos químics d'interès. Utilitzem PI com a marcador de mort cel·lular, ja que aquest colorant fluorescent només entra a les cèl·lules que no sobreviuen [23–25]. La viabilitat cel·lular en el cultiu en fase estacionària es quantifica després d'un nombre determinat de dies llegint la fluorescència PI al lector de microplaques que, al seu torn, proporciona un full de càlcul llegible electrònicament per a l'anàlisi de dades.

Com a primera validació, mostrem que treballar amb petites quantitats en pous de microplaques ofereix resultats similars als enfocaments basats en cubetes i que el lector de microplaques és prou sensible per capturar dades de supervivència cel·lular. Així, vam analitzar la tinció de PI de cèl·lules de llevat. Les cèl·lules de llevat es van cultivar al matràs de vidre i es van bullir durant 15 min a 100 graus. Les cèl·lules vives i mortes es van rentar i es van incubar en 1 × PBS (solució salina tamponada amb fosfat) sense i amb PI (5 µg/ml) durant 15 min. Després de la incubació, les cèl·lules es van rentar i es van tornar a suspendre en PBS. Les cèl·lules es van visualitzar mitjançant microscòpia i la intensitat de la fluorescència es va mesurar pel lector de microplaques (figura suplementària S1). Després de la confirmació que PI és un marcador adequat per a la mort cel·lular, es va realitzar una anàlisi posterior per desenvolupar el mètode. Les cèl·lules mortes tenyides de PI es van tornar a suspendre en PBS fins als 48 OD600nm finals mesurats a la cubeta mitjançant un espectrofotòmetre. A continuació, les cèl·lules es van diluir en sèrie en PBS (OD600nm 48 a 0, 05) i es van transferir a una placa de pou 96-negre (costar 3603). Cal tenir en compte que les microplaques negres són quatre vegades més cares que les plaques transparents i són menys fàcilment disponibles, però les vam utilitzar ja que són més adequades per a la lectura de fluorescència a causa de l'autofluorescència amortidora originada a partir de les mostres i les superfícies de la microplaca. Amb un sistema d'imatge GelDoc (Fig. 1A), vam visualitzar el grau d'incorporació de la tinció de PI a les cèl·lules mortes de llevat a diverses dilucions. Utilitzant la mateixa placa, vam mesurar la intensitat de fluorescència PI amb un lector de microplaques a una excitació de 535 nm i una emissió de 617 nm de longituds d'ona. Hem trobat una alta correlació lineal entre la intensitat de la fluorescència PI i l'absorbància cel·lular a OD600nm (Fig. 1B). Aquest resultat indica que la nostra variant del mètode basat en la fluorescència PI és eficaç per quantificar la viabilitat cel·lular.

As a next step, we determined the optimal range of cell density (quantified by OD600nm) so that cell density could be directly measured in 96-well   plates instead of in cuvettes. Using the black microplates with dead yeast cells from the previous experiment, we determined the correlation of  OD600nm measurements taken from the cuvettes and from the microplate directly. We found a high linear correlation between the two series of measurements in the OD600nm range of 0.05 to 12 of the cuvette (Fig.  1C). However, the trend is no longer maintained for higher OD600nm values>12 de la cubeta (Fig. 1D). A continuació, es va determinar la relació entre la intensitat de la fluorescència PI i la cèl·lula OD600 nm de la placa 96- del pou dins del rang OD600nm òptim de 0,05 a 12. Observem una correlació lineal gairebé perfecta (Fig. 1E). Així, el nostre protocol representa un mètode robust per quantificar la viabilitat cel·lular.

Efecte dels tipus de microplaques en la quantificació de la viabilitat cel·lular mitjançant la mesura de la fluorescència de iodur de propidi al lector de microplaques

Efecte de la rapamicina sobre la vida cronològica del llevat

La rapamicina és una de les intervencions anti-envelliment conegudes demostrades per allargar la vida útil de diversos organismes models, inclosos llevats, nematodes, mosques de la fruita i ratolins [10, 14, 15, 28–30]. Inhibeix el complex de detecció de nutrients TORC1 (objectiu del complex 1 de rapamicina). TORC1 és un complex de proteïnes multisubunitats conservades a les cèl·lules eucariotes que combina els nutrients del medi amb el creixement i la proliferació cel·lular [19, 29, 31–34].

Hem examinat l'efecte de la rapamicina en la vida cronològica (CLS) de la soca de llevat per validar el nostre protocol desenvolupat recentment. Aquí i a continuació, hem utilitzat la soca de llevat prototròfica (CEN.PK113- 7D) en els nostres experiments per evitar els forts efectes de l'auxotròfia dels aminoàcids sobre la supervivència cel·lular en cultiu en fase estacionària [35, 36]. Les cèl·lules es van envellir amb diferents concentracions de rapamicina en el medi sintètic definit (SD). El creixement cel·lular es va mesurar en diferents moments (24 h, 48 h i 72 h). Vam trobar que el creixement cel·lular va arribar a la saturació aproximadament 24 h després d'incubar amb rapamicina 5 nM o menys (Fig. 4A). No obstant això, l'administració de rapamicina 10 nM va frenar el creixement cel·lular i la saturació només es va assolir després de 48 h (Fig. 4A). Anteriorment, es va observar una tendència similar per a les cèl·lules que creixen amb rapamicina en un experiment CLS [37].

Com a pas següent, es va mesurar el CLS de cèl·lules cultivades en diferents concentracions de rapamicina. Es va determinar la supervivència cel·lular mitjançant la fluorescència PI en diferents moments cronològics. El punt de temps de creixement 72 h es va considerar com el dia 1. Podem deduir del gràfic de supervivència que diferents concentracions d'addició de rapamicina estenen el CLS del llevat (Fig. 4B). La supervivència de cèl·lules envellides complementades amb rapamicina (5 nM i 10 nM) el dia 4 va ser d'un 75 per cent; no obstant això, sense rapamicina va ser d'un 50 per cent. El dia 7, la supervivència de les cèl·lules envellides complementades amb rapamicina va ser del 70 per cent; no obstant això, sense rapamicina es va reduir a menys del 20 per cent. L'extensió CLS de cèl·lules envellides també es pot observar a concentracions més baixes (0,62-2,5 nM) de rapamicina (Fig. 4B).

Hem validat el nostre protocol comparant-lo directament amb dos enfocaments tradicionals de creixement que mesuren el CLS del llevat. En primer lloc, vam realitzar l'assaig de creixement en el medi líquid per mesurar l'efecte de la rapamicina en la vida útil. La supervivència de les cèl·lules d'envelliment cronològic es va controlar en diferents punts d'edat transferint un cultiu de 3-µl a 200 µl de medi YPD en una placa de pou 96- fresca. El creixement correspon al nombre de cèl·lules viables de l'inòcul (Fig. 4C). El creixement cel·lular envellit registrat mitjançant l'absorbància OD600nm es va determinar mitjançant un lector de microplaques. La fracció de supervivència es va calcular a partir de l'absorbància OD600nm de creixement per a cada punt d'edat en relació amb el dia 1 (considerada una supervivència cel·lular del 100 per cent). El gràfic de supervivència es mostra a la figura 4D.

De la mateixa manera, vam realitzar el creixement mitjançant l'assaig de taques en el medi d'agar. Vam detectar 3-µl de cultiu d'envelliment a la placa d'agar YPD i el vam incubar durant 48 h. El creixement de cèl·lules envellides a la placa d'agar YPD es va visualitzar pel sistema d'imatge GelDoc (Fig. 4E). Com era d'esperar, podem observar tendències d'extensió de la vida útil de la rapamicina tant amb assajos de creixement de líquids YPD com d'agar que es paral·lelen als determinats amb el nostre nou protocol.

Aquests resultats mostren que el nostre protocol HTS reprodueix que la rapamicina allarga la vida cel·lular. A més, avaluem el factor Z per avaluar la qualitat d'aquest mètode [38]. En general, els factors Z en el rang de 0.5-1.0 són indicatius d'excel·lents assajos HTS. El factor Z es va determinar per a diferents concentracions de rapamicina amb fluorescència PI de cèl·lules envellides (figura suplementària S2). El nostre finançament, un factor Z {{10}},70 per a 5 nM de rapamicina i 0,74 per a 10 nM de rapamicina, situa aquest mètode HTS a la categoria d'alta qualitat. Per tant, el nostre protocol és prou robust per identificar possibles compostos anti-envelliment.

Per explorar si el mètode és efectiu en un fons genètic de llevat diferent, vam provar l'efecte de la rapamicina en el CLS de la soca BY4743. La soca Saccharomyces cerevisiae BY4743 és auxòtrofa per a la histidina, la leucina i l'uracil. La soca BY4743 es va cultivar en diferents concentracions de rapamicina en el medi SD complementat amb constituents auxotròfics. La supervivència de les cèl·lules envellides es va quantificar mitjançant la fluorescència PI (figura suplementària S3). Vam trobar que la rapamicina augmentava quantitativament la viabilitat de les cèl·lules BY4743 de manera similar a la de CEN.PK113-7D. Així, aquests resultats revelen que el nostre mètode és eficaç en diferents soques de llevat.

Efecte de la glucosa en la vida cronològica del llevat

També vam validar el nostre mètode examinant l'efecte de la restricció calòrica sobre la vida cronològica del llevat. La restricció calòrica és una de les intervencions establertes per retardar l'envelliment i allargar la vida útil de l'organisme model, incloses les cèl·lules de llevats i de mamífers [11, 13, 16]. Per determinar l'efecte de la restricció calòrica sobre el CLS del llevat, reduïm el contingut de glucosa en el medi de cultiu. Vam fer créixer la cèl·lula en tres condicions de medi SD diferents que contenien 0,25 per cent, 0,5 per cent i 2 per cent de glucosa. Hem mesurat el creixement cel·lular en diferents moments (24 h, 48 h i 72 h). Tots els cultius van assolir la saturació de creixement després de 24 h (Fig. 5A). El creixement cel·lular va ser inferior al 0,25% i al 0,5% en comparació amb el 2% de glucosa (figura 5A). Es va mesurar la supervivència de l'envelliment cronològic de les cèl·lules cultivades a diferents concentracions de glucosa mitjançant el mètode de fluorescència PI (Fig. 5B). Deduïm del gràfic de supervivència que la restricció de glucosa amplia el CLS del llevat. També vam confirmar simultàniament l'extensió del CLS mitjançant assajos de creixement (Fig. 5C, D i E), validant encara més el nostre nou mètode per determinar el CLS del llevat. L'efecte de la restricció de glucosa en l'extensió CLS de la soca BY4743 també es va mostrar pel mètode PICLS (figura suplementària S3). Així, el nostre enfocament per mesurar el CLS del llevat representa un mètode nou, ràpid i de baix cost per seleccionar els agents químics i les condicions de cultiu per identificar les intervencions anti-envelliment.

El cribratge dels agents químics mitjançant el mètode recentment desenvolupat va identificar el 2,5-anhidre-D-manitol com un nou compost anti-envelliment

Després de desenvolupar i validar el nou protocol, vam utilitzar aquest mètode per seleccionar centenars d'agents químics per a la identificació de compostos anti-envelliment (figura suplementària S4 i taula suplementària 1). Com a un dels resultats sorprenents, vam trobar indicacions per al compost 2, 5-anhidro-D-manitol (2,5-AM) per estendre el CLS del llevat. A la figura 6, presentem el resultat dels experiments detallats de seguiment d'aquest compost. Hem provat l'activitat antienvelliment de 2,5-AM a diferents concentracions a la placa 96-pou. En primer lloc, vam determinar l'efecte de 2,5-AM sobre el creixement cel·lular. Les cèl·lules de llevat es van incubar amb concentracions variables de 2,5-AM al medi SD. El creixement cel·lular es va mesurar en diferents moments (24 h, 48 h i 72 h). Vam trobar que el creixement cel·lular va assolir el mateix nivell de saturació després de 24 h per a totes les concentracions provades de 2, 5-AM (Fig. 6A). A continuació, vam mesurar la supervivència de cèl·lules envellides cronològicament complementades amb diferents concentracions de 2,5-AM mitjançant el mètode de fluorescència PI. Com anteriorment, el cultiu de creixement de 72 hores es va considerar el dia 1 per a l'anàlisi CLS. El gràfic de supervivència es dibuixa per a diferents punts de temps cronològics (Fig. 6B). Trobem que 2,5-AM amplia el CLS de manera dependent de la concentració. La supervivència de cèl·lules envellides complementades amb 2,5-AM (8 mM) el dia 4 va ser del ~ 80 per cent; tanmateix, sense les 2,5- AM era ~ 50 per cent . El dia 7, la supervivència de 2,5-AM suplementades cèl·lules envellides va ser de ~ 75 per cent; tanmateix, sense 2,5-AM es va reduir a menys del 20 per cent . L'activitat antienvelliment de 2,5-AM també es va verificar mitjançant assajos de creixement (Fig. 6C, D i E).

2,5-AM és una molècula de sucre que pot entrar a la via de la glucòlisi. S'hidrolitza només en els passos glicolítics aigües amunt que provoquen l'acumulació de 2,5-AM{-1,6-bisfosfat (2,5-AMBP) no metabolitzat a les cèl·lules [39–41]. ]. Per comprovar si 2,5-AM a concentracions similars a l'experiment CLS ha estat processat per enzims de glucòlisi, vam examinar la sensibilitat creixent de la soca de supressió del gen SNF1. SNF1 és un sensor d'energia cel·lular i proteïna quinasa activada per AMP (AMPK) altament conservada en eucariotes [42, 43]. Les cèl·lules de llevat que no tenen activitat AMPK s'associen amb un fenotip de creixement hipersensible en presència d'intermedis glicolítics no metabolitzats [44]. Hem mesurat el creixement de la soca de supressió snf1Δ amb diferents concentracions de 2,5-AM. Hem trobat que 2,5-AM inhibeix el creixement de la soca de supressió snf1Δ en comparació amb la soca de tipus salvatge (figura suplementària S5). Aquest fenotip de creixement observat indica que 2,5-AM pateix glucòlisi i s'hidrolitza en intermedis glicolítics no metabolitzats.

2,5-AM és un anàleg de la fructosa de sucre [39]. Per aclarir si altres sucres també influeixen en el CLS, vam examinar l'efecte de la fructosa, el manitol i la maltosa en l'envelliment del llevat. També vam incloure sorbitol, que és un sucre no metabolitzat que s'informa que augmenta el CLS de les cèl·lules de llevat augmentant l'osmolaritat del medi de cultiu [20, 45]. En primer lloc, vam provar l'efecte de la fructosa, el manitol, la maltosa i el sorbitol en el creixement cel·lular. Les cèl·lules de llevat es van incubar amb diverses concentracions de fructosa, manitol, maltosa i sorbitol similars a 2,5-AM en el medi SD. Com 2,5-AM, les cèl·lules incubades amb fructosa, manitol, maltosa i sorbitol van assolir la saturació de creixement després de 24 h (Fig. 7A). A continuació, vam mesurar la supervivència de cèl·lules envellides cronològicament el dia 1, el dia 7, el dia 14 i el dia 21. A diferència del 2,5-AM, la suplementació amb fructosa, manitol, maltosa i sorbitol no va allargar la vida útil del llevat (Fig. 7B, C, D, E i Fig. S6 suplementària). Sorprenentment, 2,5-AM allarga la vida útil fins i tot en l'etapa tardana de l'envelliment cronològic. Les cèl·lules envellides complementades amb 2,5-AM (8 mM) sobreviuen (~65 per cent) el dia 21. Tanmateix, la supervivència de les cèl·lules envellides sense suplements de 2,5-AM va ser inferior al 10 per cent.

Per a la nostra sorpresa, vam trobar que el sorbitol a baixes concentracions provades no pot augmentar el CLS (Fig. 7B, C, D, E i Fig. S6 suplementària). Vam plantejar la hipòtesi que es podrien requerir concentracions més altes de sorbitol per augmentar el CLS. Vam provar un rang de concentracions més altes, inclòs 1 M de sorbitol, la concentració que es va informar anteriorment que afectava el CLS (18 per cent equivalent a 1 M) [20, 45). D'acord amb els informes anteriors, també trobem que concentracions molt elevades de sorbitol (entre 0, 5 i 1 M) augmenten el CLS del llevat (figura suplementària S7), aparentment augmentant l'osmolaritat del medi. Curiosament, l'augment del CLS en 2,5-AM a una concentració molt baixa (2 mM) suggereix que el seu mecanisme d'activitat antienvelliment és diferent de l'osmòtic. Aquests resultats suggereixen que l'activitat antienvelliment de 2,5-AM és específica per a aquest compost de sucre i no s'observa per a diversos altres productes químics d'estructura similar.

【Per a més informació: david.deng@wecistanche.com / WhatApp:86 13632399501】