El potencial de les vacunes basades en cèl·lules dendrítiques per modular les poblacions de cèl·lules limfoides innates tipus 3

Resum:

Les vacunes de cèl·lules dendrítiques (DC) són un tipus d'immunoteràpia que es basa en la comunicació de les DC amb altres aspectes del sistema immunitari. Els DC són potents cèl·lules presentadores d'antigen implicades en l'activació de respostes immunitàries innates i en l'educació de la immunitat adaptativa, cosa que els converteix en objectius ideals per a les immunoteràpies. Les cèl·lules limfoides innates (ILC) s'han identificat relativament recentment en el camp de la immunologia i tenen un paper important en la salut i la malaltia. Els estudis descrits aquí van explorar les comunicacions entre ILC tipus 3 (ILC3) i DC mitjançant un model muri de vacunació basada en DC. Es van observar canvis locals i sistèmics a les poblacions d'ILC3 després de l'administració d'una vacuna DC, i després del desafiament amb cèl·lules de melanoma B16F10, es van observar canvis en les poblacions d'ILC3 als pulmons. Les interaccions entre DC i ILC3 s'han d'explorar més per determinar el potencial que podrien tenir les seves comunicacions en salut, malaltia i desenvolupament d'immunoteràpies.

cistanche tubulosa: millora el sistema immunitari

Paraules clau:

cèl·lula dendrítica (DC); cèl·lula limfoide innata tipus 3 (ILC3); innat; comunicació

1. Introducció

Les cèl·lules limfoides innates (ILC) són un grup heterogeni de leucòcits derivats de cèl·lules progenitores limfoides comunes que tenen funcions crucials en el desenvolupament, reparació i homeòstasi dels teixits. Les ILC s'han relacionat amb diferents malalties inflamatòries, com ara la malaltia inflamatòria intestinal, la psoriasi, l'asma i diverses malalties autoimmunes [1]. Normalment es divideixen en tres grups principals, tipus 1 (ILC1), tipus 2 (ILC2) i tipus 3 (ILC3), basats en l'expressió de factors de transcripció, perfils de citocines i marcadors fenotípics específics [2]. Les cèl·lules assassines naturals (NK) de vegades s'agrupen com a subconjunt d'ILC1 a causa de les seves similituds; tanmateix, s'ha demostrat que les cèl·lules NK tenen característiques diferents de les ILC1, com ara expressions de factors de transcripció i activitat citolítica que les han distingit com el seu propi subtipus d'ILC [3]. Tanmateix, molts encara consideren les cèl·lules NK com un subconjunt d'ILC1 [4]. A causa dels seus perfils de citocines, factors de transcripció i funcions immunològiques similars, les ILC (cèl·lules NK, ILC1, ILC2 i ILC3) es consideren homòlegs innats dels components del sistema immunitari adaptatiu que reflecteixen limfòcits T citotòxics, Th1, Th2 i Th17. respostes, respectivament [4]. Tanmateix, a diferència de les cèl·lules T, no tenen receptors específics per a l'antigen [5].

Els DC són leucòcits innats que són crítics en la inducció de respostes immunitàries i la tolerància. Tenen receptors de reconeixement de patrons que reconeixen patrons moleculars associats a patògens i/o danys i són les cèl·lules presentadores d'antigen més eficients [6]. Mitjançant la presentació d'antigen i la secreció de citocines, els DC poden dictar el destí de les cèl·lules T ingènues i induir respostes proinflamatòries o immunosupressió. Les cèl·lules T poden ser educades per reconèixer un antigen com a perillós i atacar-lo o com a no perillós i adoptar un fenotip tolerogènic [6]. Els DC també estan implicats en l'activació de la immunitat innata, així com en l'educació de la immunitat adaptativa. Mitjançant el contacte directe o la producció de diferents citocines i factors solubles, els DC poden activar altres leucòcits innats i promoure respostes immunes innates [7].

El poder dels DC s'ha utilitzat en immunoteràpies com les vacunes DC. Les vacunes DC es preparen aïllant DC d'un pacient o aïllant precursors DC i derivant DC. Aquestes DC es manipulen ex vivo, la qual cosa implica la maduració de les DC de manera immunogènica. Els DC també estan carregats amb antígens específics, que serà el que la vacuna tindrà com a objectiu desenvolupar respostes immunogèniques dirigides [8]. Les vacunes DC són una plataforma immunoterapèutica que aprofita la capacitat dels DC per educar el sistema immunitari adaptatiu per induir respostes específiques d'antigen, en particular les cèl·lules T citotòxiques específiques d'antigen. Per tant, la majoria de la investigació sobre vacunes DC s'ha centrat en la capacitat dels DC per educar el sistema immunitari adaptatiu. Tanmateix, en els darrers anys, s'ha demostrat que la relació entre les DC i les cèl·lules NK té una poderosa influència en la immunitat antitumoral, que és crucial per a l'eficàcia de la vacunació amb DC [9-11]. Això demostra la important necessitat d'explorar altres relacions entre DC i diferents leucòcits innats i la influència que aquestes comunicacions poden tenir en l'eficàcia de les vacunes DC. Com que les cèl·lules NK formen part de la família ILC i a causa de l'estreta semblança de les ILC amb les cèl·lules T [5], l'objectiu dels estudis presentats aquí era investigar la relació potencial entre els DC i un altre membre de la família ILC, ILC3s. Hem utilitzat una plataforma de vacuna DC derivada de monòcits (moDC) on es van generar DC ex vivo a partir de cèl·lules precursores de medul·la òssia murí. Les vacunes MoDC són la forma més comuna de vacunes DC ja que, històricament, eren les més fàcils de produir [12].

Beneficis de cistanche per a homes que enforteixen el sistema immunitari

Feu clic aquí per veure els productes Cistanche Enhance Immunity

【Demanar més】 Correu electrònic:cindy.xue@wecistanche.com / Whats App: 0086 18599088692 / Wechat: 18599088692

Els ILC3 tenen funcions importants en l'homeòstasi intestinal, la immunitat contra els bacteris extracel·lulars i el desenvolupament de teixits limfoides [5]. Els ILC3 es poden subdividir en grups que varien en la seva expressió de marcadors de superfície i producció de citocines. Tanmateix, tots els ILC3 expressen ROR t [13]. Un subgrup d'ILC3 són les cèl·lules inductores del teixit limfoide ILC3-que són importants en l'organogènesi [14]. Els ILC3 també es poden subdividir en funció de l'expressió del receptor de citotoxicitat natural (NCR), que en els ratolins és l'expressió NKp46 [15,16], i en humans, és NKp44 [17,18]. Per tant, hi ha NCR+ i NCR-ILC3 que presenten diferències en les seves capacitats funcionals i característiques fenotípiques. Per exemple, s'ha suggerit que les ILC3 NCR+ produeixen IL-22 però no IL-17, mentre que les ILC3 NCR- poden produir ambdues citocines [19]. Tanmateix, en un estudi recent de Fiancette et al., es va demostrar que els ILC3 NCR+ poden produir una quantitat baixa d'IL-17 [20]. Rankin et al. va demostrar en ratolins que els ILC3 NCR + requereixen el factor de transcripció T-bet. Per tant, els NCR+/− ILC3 es poden diferenciar en funció de l'expressió NKp46 i T-bet. En els estudis descrits aquí, els ILC3 murins es van definir per llinatge-CD45+DX5-ROR t +, amb NCR+ ILC3 també sent T-bet+NKp46+ i NCR-ILC3 sent T-bet-NKp46 − (Taula 1 i figures A1–A3 de l'annex A).

Taula 1. Subconjunts ILC3 definits per anàlisi de citometria de flux.

L'objectiu d'aquesta investigació era ajudar a dilucidar si hi ha comunicacions entre les vacunes DC i les ILC3 i el potencial que podrien tenir les seves interaccions en les immunoteràpies DC. S'ha demostrat que els ILC3 tenen papers en diverses malalties i càncers i, per tant, tenen potencial en diferents contextos d'immunoteràpia. Els ILC3 són relativament nous en l'escena de la immunologia i, com a resultat, s'han explorat de manera limitada les seves influències en la malaltia i els tractaments. Els ILC3 responen a estímuls externs, que dictaran les seves activitats i si promouen la progressió o la supressió dels tumors [21,22]. De manera semblant a les cèl·lules Th17, les ILC3 tenen el factor de transcripció ROR t i produeixen citocines de resposta Th17 com IL-17 i IL-22. IL-22 és important per controlar les infeccions bacterianes a l'intestí [16]. Tanmateix, en un model de càncer de còlon induït per bacteris, es va demostrar que IL-17 i IL{-22 dels ILC del còlon contribuïen al desenvolupament del càncer de còlon [23]. A més, els ILC3 s'han correlacionat amb resultats negatius en càncers de mama [24]. Per contra, s'ha observat una associació entre NCR+ ILC3 i estructures limfoides terciàries (TLS) i millors resultats clínics en càncers de pulmó de cèl·lules no petites [18]. A més, un estudi recent va investigar els ILC3 en càncer colorectal. L'estudi va observar un augment de les ILC1 i una disminució de les ILC3 en mostres de pacients de tumors colorectals resecats en comparació amb teixits adjacents no malignes coincidents. La seqüenciació de l'ARN i el perfil transcripcional van revelar que els ILC3 tenien una plasticitat augmentada i diferents capacitats funcionals dins dels tumors colorectals en comparació amb els teixits no malignes. Curiosament, la seqüenciació de l'ARN també va suggerir que els ILC3 que s'infiltraven en el tumor havien regulat la plasticitat per canviar a un fenotip ILC1. L'estudi va observar que les interaccions ILC3 amb les cèl·lules T donaven suport a la immunitat de tipus I i, en els càncers colorectals, aquestes interaccions són limitades, cosa que dificulta les respostes antitumorals. Això admet una funció important per als ILC3 en la immunitat antitumoral. En general, el document va demostrar els papers significatius que tenen els ILC3 en la regulació de l'homeòstasi immunològica i el càncer colorectal [25]. Per tant, es considera que els ILC3 tenen un doble paper en salut i malaltia. Poden promoure la progressió del càncer [23,24,26] però també poden contribuir a les respostes antitumorals [18,25,27,28]. El seu fenotip i les seves contribucions al càncer semblen ser contextuals, cosa que indica un potencial per manipular ILC3 mitjançant la immunoteràpia per obtenir un fenotip que ajudi a les respostes contra el càncer en lloc de donar suport a la progressió del tumor. Així, les vacunes basades en DC representen un possible mètode per influir en el microambient tumoral mitjançant la manipulació dels fenotips ILC i la seva producció de citocines, cosa que permetria adaptar la resposta immune en funció de les circumstàncies i podria ser beneficiós en la investigació del càncer.

Com que hi ha hagut investigacions limitades sobre les comunicacions entre DC i ILC3, especialment en el context de la vacunació amb DC, els estudis aquí descrits van investigar els canvis en les poblacions ILC3 després de l'administració d'una vacuna basada en DC a ratolins. En aquest article, es va observar la comunicació entre una vacuna basada en DC i ILC3, que es va demostrar mitjançant la influència sostinguda de la vacuna en les respostes ILC3 durant almenys 10 dies després de la immunització.

cistanche tubulosa: millora el sistema immunitari

2. Resultats

2.1. El nombre d'ILC3 NCR+ i NCR− va augmentar al gangli limfàtic de drenatge local després de l'administració de vacunes DC 

Es va preparar una vacuna de DC diferenciant DC de cèl·lules derivades de medul·la òssia murina ex vivo. Aquests DC van ser estimulats per afavorir la seva maduració i així adquiriren un fenotip immunogènic. A continuació, els DC es van carregar amb un pèptid. Com que aquest estudi se centra en la naturalesa de la comunicació entre dos leucòcits innats, DC i ILC3, el pèptid seleccionat per a la producció de la vacuna era intencionadament irrellevant per al nostre model biològic per evitar que les cèl·lules T específiques de l'antigen es convertís en una variable de confusió. Per tant, la vacuna DC es va carregar amb un pèptid derivat de l'ovalbúmina de pollastre.

Per començar a investigar si la vacunació amb DC influeix en les poblacions ILC3, primer vam avaluar si hi havia diferències en la cel·lularitat proximal al lloc de vacunació. Hi va haver canvis en el gangli limfàtic de drenatge local després de la vacunació amb DC, que va incloure un augment del nombre d'ILC3 (figura 1). La cinètica de l'augment de les ILC3 va mostrar que les ILC3 van augmentar gradualment després de la vacunació amb DC (figura 1b, c). Es va avaluar el nombre de NCR+ i NCR− ILC3 al gangli limfàtic de drenatge local i ambdues subpoblacions van augmentar després de l'administració de la vacuna DC. Tot i que les poblacions NCR+ i NCR− ILC3 van assolir el màxim tres dies després de la vacunació DC, els NCR− ILC3 van tornar als números homeostàtics set dies després de la immunització, mentre que el nombre de NCR+ ILC3 es va mantenir significativament més alt en comparació amb els ratolins control tractats amb simulació.

Figura 1. El nombre de receptors naturals de citotoxicitat (NCR)+ i NCR− tipus 3 de cèl·lules limfoides innates (ILC3s) va augmentar al gangli limfàtic de drenatge local després de la immunització amb DC. Les femelles de ratolins C57BL / 6 es van inocular amb vacunes DC mitjançant injeccions de coixinet posterior. Es van examinar els ganglis poplites per a les poblacions ILC3. ( a ) Es va determinar el nombre total de cèl·lules del gangli limfàtic. Acumulació de (b) NCR− ILC3 i (c) NCR+ ILC3 al gangli limfàtic i el percentatge de cèl·lules CD{{10}} al gangli que eren (d) NCR− ILC3 i (e) NCR+ ILC3. Cada barra representa dades de quatre ganglis limfàtics poplites. Es va utilitzar una prova t de Student en cada moment per determinar diferències significatives entre els ratolins control inoculats amb solució salina tamponada amb fosfat (PBS) i els ratolins inoculats amb la vacuna DC (valors p * < 0).{{ 21}}5, ** <0,005, *** <0,0005 i **** <0,0001). Gràfics de punts representatius que mostren el nombre mitjà de (f) NCR− ILC3 i (g) NCR + ILC3 al gangli limfàtic popliteal drenant. Els gràfics mostren la mitjana amb la desviació estàndard.

2.2. Les vacunes DC van augmentar la producció de citocines ILC3 a la melsa sense canviar el nombre total d'ILC3 esplèniques

A continuació, es van examinar els canvis sistèmics a les poblacions ILC3 avaluant la melsa, que és l'òrgan limfoide secundari més gran [29], una setmana després de la vacunació de DC, que és el punt de temps estàndard del nostre laboratori per avaluar els canvis en els leucòcits de manera sistèmica. No es va observar cap diferència significativa en el nombre total de NCR+ o NCR− ILC3 a la melsa (figura 2).

Figura 2. No hi va haver canvis en el nombre d'ILC3 esplèniques després de la immunització amb DC. Les femelles de ratolins C57BL/6 (n=8 [PBS] o 10 [DC]) es van inocular amb vacunes DC mitjançant injeccions de coixinet posterior. Les melses es van collir una setmana després de la inoculació i es van examinar per a les poblacions ILC3. Nombre total esplènic de (a) NCR− ILC3s i (b) NCR+ ILC3s (i la intensitat fluorescent mitjana geomètrica de T-bet per a NCR+ ILC3s) i el percentatge de cèl·lules CD45+ esplèniques que eren (c) NCR− Els ILC3 i (d) NCR + ILC3 es van controlar i quantificar mitjançant anàlisi de citometria de flux. Es va utilitzar una prova t de Student per determinar la importància entre les poblacions dels ratolins control inoculats amb solució salina tamponada amb fosfat (PBS) i els ratolins inoculats amb DC. Els mitjans no eren significativament diferents. Gràfics de punts representatius que mostren el nombre mitjà de esplènics (e) NCR− ILC3 i NCR+ ILC3. La desviació estàndard i la mitjana es representen per les barres de gràfics i les barres d'error.

Atès que els perfils de citocines ILC3 poden estar influenciats per factors ambientals, la producció d'IL-22 i IL-17 a la melsa es va mesurar una setmana després de la vacunació amb DC. Hi va haver un augment dels ILC3 que produeixen IL-17 o IL{-22 o ambdues citocines en ratolins tractats amb vacunes DC en comparació amb els ratolins control (figura 3).

Figura 3. Hi va haver un augment de les ILC3 esplèniques que produeixen IL-17 i IL-22 després de la immunització amb DC. Les femelles de ratolins C57BL/6 (n=12-18) van ser inoculades amb vacunes DC mitjançant una injecció de coixinet posterior. Els ratolins control es van tractar amb solució salina tamponada amb fosfat (PBS). Una setmana després de la immunització, es van recol·lectar mels i es van examinar per detectar ILCs que produeixen IL-17- i IL{{{0}}. El nombre de cèl·lules CD127+DX5− de llinatge que produeixen (a) IL-17, (b) IL-22 i (c) tant IL-17 com IL{{ 16}} i les seves intensitats fluorescents mitjanes geomètriques corresponents es van determinar mitjançant tinció de citocines intracel·lulars i citometria de flux. Les dades es van analitzar mitjançant una prova ANOVA de dues vies (valors p * <0,05, ** <0,005). (d) Els gràfics de punts representatius mostren el nombre mitjà de cèl·lules CD45+ de llinatge-CD127+DX5- esplèniques que produeixen IL-17 i/o IL-22. Els gràfics mostren la mitjana amb la desviació estàndard.

2.3. Subpoblacions ILC3 després de la immunització i el repte de DC amb cèl·lules de melanoma B16F10

Els ILC3 poden tenir un doble paper en la progressió del càncer contribuint a respostes pro- i antitumorigèniques [22]. Per tant, es va investigar la influència de la vacunació amb DC en les respostes ILC3 en un context de càncer. Els ratolins van ser tractats amb vacunes DC i una setmana més tard, van ser desafiats per via intravenosa amb cèl·lules de melanoma B16F10, cosa que va donar lloc a la sembra dels pulmons. Com s'ha esmentat, com que només s'estaven avaluant els components de la immunitat innata, l'educació específica de l'antigen per part de la vacuna no s'havia d'avaluar en els nostres experiments i, per tant, el model de melanoma utilitzat no expressava ovoalbúmina, la qual cosa feia que el pèptid carregat als DC. irrellevant. L'experiment de cinètica (figura 1) va demostrar que les respostes locals dels ILC3 es podrien observar en tres dies. Per tant, tres dies després del repte, es va examinar el nombre de subpoblacions ILC3 i la seva capacitat per produir citocines a la melsa i als pulmons. De manera semblant al que es va observar a la melsa de ratolins ingènus, no hi va haver cap diferència significativa en el nombre total de NCR + i NCR- ILC3 esplènics entre el grup control i el grup immunitzat amb DC (figura 4). Tanmateix, a diferència del model naïf, a la melsa, ja no hi va haver canvis en la producció d'IL-17 i/o IL-22 (figura 5).

Figura 4. No hi va haver cap canvi en el nombre total d'ILC3 esplèniques després de la vacunació amb DC i el desafiament amb cèl·lules de melanoma B16F10. Les femelles de ratolins C57BL/6 (n=10) es van inocular amb vacunes DC mitjançant una injecció de coixinet posterior i una setmana després, els ratolins es van administrar amb 3 × 105 cèl·lules B16F10 mitjançant una injecció de la vena de la cua. Les melses es van collir i es van examinar per a l'acumulació de poblacions ILC3 tres dies després de l'administració de B16F10. El nombre de (a) NCR− ILC3s esplèniques i (b) NCR+ ILC3s (i la intensitat fluorescent mitjana geomètrica de T-bet per a NCR+ ILC3s) i el percentatge de cèl·lules CD45+ esplèniques que eren (c) NCR− Els ILC3 i (d) NCR + ILC3 es van controlar i quantificar mitjançant citometria de flux. Es va utilitzar una prova t de Student per determinar la importància entre les poblacions dels ratolins control tractats amb solució salina tamponada amb fosfat (PBS) i els ratolins inoculats amb DC. Els mitjans no eren significativament diferents. Els gràfics de punts representatius mostren el nombre mitjà de esplènics (e) NCR− ILC3 i NCR+ ILC3. La mitjana i la desviació estàndard es representen amb els gràfics de barres i les barres d'error.

Figura 5. No hi va haver cap canvi en el nombre d'IL-17 esplèniques i/o IL-22-que produeixen IL-22-després de la vacunació amb DC i el desafiament amb cèl·lules de melanoma B16F10. Les femelles de ratolins C57BL/6 (n=10) es van inocular amb vacunes DC mitjançant una injecció de coixinet posterior i una setmana més tard, es van administrar 3 × 105 cèl·lules B16F10 per via intravenosa. Tres dies després, es van recol·lectar mels i es van examinar per a la producció de citocines ILC3. El nombre de cèl·lules CD{127+DX{5- de llinatge que produeixen (a) IL-17, (b) IL{-22 i (c) tant IL{-17 com IL-22 i les seves intensitats fluorescents mitjanes geomètriques corresponents es van determinar mitjançant tinció de citocines intracel·lulars i citometria de flux. Les dades es van analitzar mitjançant una prova ANOVA de dues vies i no es va detectar cap diferència significativa entre els ratolins vacunats amb DC i els controls tractats amb solució salina tamponada amb fosfat (PBS). (d) Els gràfics de punts representatius mostren el nombre mitjà de cèl·lules CD45+de llinatge CD127+DX5- esplèniques que produeixen IL-17 i/o IL-22.

La injecció intravenosa de cèl·lules B16F10 a través de la vena de la cua és un model de ratolí comú de metàstasis de melanoma sintètic als pulmons [30]. Per tant, també es van examinar els pulmons per determinar el nombre de subpoblacions ILC3 i avaluar la seva producció de citocines.

Hi va haver una disminució del nombre de NCR− ILC3 amb un augment concomitant del nombre de NCR+ ILC3 (figura 6). Tanmateix, no es va observar cap efecte de la vacunació amb DC sobre la producció de citocines mediada per ILC3- als pulmons (figura 7).

Figura 6. Després de la immunització amb DC i el repte amb cèl·lules B16F10, hi va haver canvis numèrics en les subpoblacions ILC3 als pulmons. Les femelles de ratolins C57BL/6 (n=10) van rebre vacunes de DC mitjançant la injecció de la part posterior i una setmana més tard, es van administrar 3 × 105 cèl·lules B16F10 per via intravenosa. Tres dies després del repte, els pulmons es van examinar mitjançant citometria de flux per al nombre de (a) NCR− ILC3 i (b) NCR + ILC3 (i la intensitat fluorescent mitjana geomètrica de T-bet per a NCR + ILC3) i el percentatge de CD{ {18}} cèl·lules que eren (c) NCR− ILC3 i (d) NCR+ ILC3. Es va utilitzar una prova t de Student per determinar la importància entre les subpoblacions dels ratolins control tractats amb solució salina tamponada amb fosfat (PBS) i els ratolins inoculats amb DC (valors p *<0.05, *** <0.0005, and **** < 0.0001). Representative dot plots showing the average number of pulmonary (e) NCR− ILC3s and NCR+ ILC3s. The graphs display the mean with the standard deviation.

Figura 7.No hi va haver cap canvi en el nombre d'ILC3 que produeixen IL-17 i/o IL{-22 als pulmons després de la vacunació amb DC i el desafiament amb cèl·lules de melanoma B16F10. Les femelles de ratolins C57BL/6 (n=10) es van inocular amb vacunes DC mitjançant una injecció de coixinet posterior i una setmana més tard, se'ls va administrar per via intravenosa amb 3 × 105 cèl·lules B16F10. Tres dies després, es van recol·lectar els pulmons i es van examinar la producció de citocines mediada per ILC3-. El nombre de cèl·lules CD127+DX5 de llinatge que produeixen (a) IL-17, (b) IL-22 i (c) es van determinar tant IL{{0}} com IL{-22 i les seves intensitats fluorescents mitjanes geomètriques corresponents mitjançant tinció de citocines intracel·lulars i citometria de flux. Les dades es van analitzar mitjançant una prova ANOVA de dues vies (valors p *** <0, 0005). No hi va haver cap diferència significativa en el nombre total de IL-22-productor, IL-17-productor i IL{-22 i IL{-17 llinatge-CD{{ productor de múltiples citocines 12}}Cèl·lules DX5−. (d) Gràfics de punts representatius que mostren el nombre mitjà de cèl·lules CD45+ de llinatge-CD127+DX5- pulmonars que produeixen IL-17 i/o IL-22. La desviació estàndard i la mitjana es representen per les barres de gràfics i les barres d'error.

3. Discussió

Els estudis aquí descrits pretenien investigar les comunicacions potencials entre ILC3 i DC en el context d'una vacuna DC. Hi va haver augments en el nombre de subpoblacions ILC3 NCR + i NCR− als ganglis limfàtics drenants (figura 1) després de la vacunació amb DC, cosa que suggereix que es produïen comunicacions locals entre la vacuna DC i les subpoblacions ILC3. Tanmateix, la comunicació entre DC i NCR + ILC3 va tenir una influència més duradora en el nombre total de NCR + ILC3 que l'observada entre DC i NCR− ILC3. Això va indicar que els DC poden tenir interaccions úniques amb ILC3 en funció de la seva expressió de NCR. No es va observar cap canvi en el nombre de subpoblacions ILC3 a la melsa set dies després de la vacunació amb DC (figura 2) o deu dies després de la vacunació amb DC i tres dies després del repte de cèl·lules de melanoma B16F10 (figura 4). Els nostres mètodes per assajar ILC3 per a la seva producció d'IL-17 i IL{-22 tenen una limitació perquè mostren les respostes tant translacionals com transcripcionals a causa de la reestimulació in vitro de les cèl·lules. Tanmateix, vam afegir un control experimental en tots els experiments, que seria el tractament sense estimulació in vitro per detectar què produeixen els ILC3 en resposta al senyal rebut in vivo. Tal com es mostra a les figures 3d, 5d i 7d, les cèl·lules que no van rebre estimulació in vitro van produir IL-17 i IL-22. A més, tot i que el nombre de cèl·lules ILC3 esplèniques no va canviar (figura 2), la producció de citocines per part de les subpoblacions ILC3 va ser diferent set dies després de la vacunació de DC (figura 3). Això va suggerir que la vacunació amb DC podria influir en la funcionalitat de les respostes ILC3 sense afectar-les numèricament. En ser components del sistema immunitari innat, el tràfic d'ILC3 dins i fora dels teixits podria haver-se produït en uns pocs dies, evitant, per tant, la detecció de diferències numèriques modulades pel tractament de set a deu dies després de la vacunació amb DC. Es va observar evidència d'això al gangli limfàtic drenant la vacuna DC on el nombre d'ILC3 va augmentar al llarg de tres dies i després va començar a disminuir (figura 1). Per tant, pot haver-hi hagut canvis numèrics en les subpoblacions ILC3 a la melsa que es van perdre perquè havien tornat als números homeostàtics a la immunització del setè dia després de la DC. No obstant això, els estudis es van centrar en respostes de llarga durada en lloc de respostes transitòries a curt termini i, per tant, no van investigar més aquesta via. Curiosament, tot i que el nombre de subpoblacions d'ILC3 esplèniques no era diferent dels grups control, els seus perfils de citocines es van alterar (figura 3). La producció d'IL-22 i IL{-17 es va incrementar en les ILC3 esplèniques, demostrant així que la vacunació amb DC tenia un efecte sistèmic sobre les ILC3. En resum, la vacunació amb DC no va afectar la quantitat d'ILC3 esplèniques, però sí que va influir en la seva funcionalitat.

Tot i que hi va haver un efecte sostingut sobre la producció de citocines derivades d'ILC3-set dies després de la immunització de DC a la melsa de ratolins lliures de tumors, aquesta influència sobre els ILC3 a la melsa va ser indetectable tres dies després del repte intravenós amb cèl·lules de melanoma B16F10 ( Figura 5). La vacuna DC va semblar afavorir les poblacions ILC3 en el model lliure de tumors que es va suprimir després del desafiament del tumor. Com que els ILC estan molt influenciats pel seu entorn, això podria suggerir que les comunicacions entre els DC de la vacuna i els ILC3 es limitaven al model lliure de tumors. Per contra, això també podria ser degut a la mobilització d'ILC3 primers a altres llocs del cos on els B16F10 es podrien haver congregat i establir un microambient que va induir el reclutament de leucòcits.

Es va observar un canvi en les subpoblacions ILC3 als pulmons deu dies després de la vacunació de DC i tres dies després del repte de cèl·lules B16F10 en comparació amb els ratolins control no vacunats amb DC que només van rebre l'administració de cèl·lules B16F10. Concretament, es va produir un augment del nombre d'ILC3 NCR+ i una disminució de les ILC3 NCR- als pulmons (figura 6). T-bet és un factor de transcripció que s'associa amb les respostes Th1 [31]. Per tant, l'augment de NCR+ ILC3, que expressen T-bet, va indicar una possible promoció de la immunitat tipus 1. Aquesta podria ser una resposta ILC3 beneficiosa en un context de càncer on normalment es desitgen respostes immunes de tipus 1.

Beneficis de cistanche per a homes que enforteixen el sistema immunitari

S'ha demostrat que els NCR+ ILC3 poden derivar d'un subconjunt de NCR− ILC3 [16]. Per tant, l'augment de NCR+ ILC3 i la disminució de NCR− ILC3 es podrien atribuir a una estimulació que va induir un canvi en NCR− ILC3 per convertir-se en NCR+ ILC3. Si els ILC3 estaven passant per un canvi de fenotip de NCR− a NCR+, potser no podrien produir citocines durant o poc després del canvi i mentre s'adaptaven a l'entorn i al seu nou fenotip. Per tant, la seva producció de citocines pot haver-se aturat o retardat mentre es produïa el canvi de fenotip, cosa que podria explicar per què no hi ha hagut canvis en la producció d'IL{-17 i/o IL-22 mediada per ILC3- els pulmons (figura 7). Tanmateix, també és possible que la vacunació amb DC simplement no hagi influït en la producció de citocines per part dels ILC3 als pulmons en aquest moment.

4. Materials i Mètodes

Aprovació ètica

Tots els estudis murins es van realitzar seguint el protocol d'utilització d'animals #3807 sota la supervisió del personal de cura d'animals de la Universitat de Guelph.

Els ratolins

Es van rebre ratolins C57BL6 femelles dels laboratoris de Charles River d'entre cinc i vuit setmanes. Els ratolins es van allotjar en un entorn controlat a la unitat d'aïllament d'animals de la Universitat de Guelph i es van aclimatar una setmana abans de l'inici dels experiments. Els ratolins van ser alimentats i donats aigua ad libitum.

Cultius de cèl·lules dendrítiques

Es van collir els fèmurs i les tíbies de les femelles de ratolins C57BL6 i es van tallar els extrems dels ossos. Amb una xeringa, la medul·la òssia de les tíbies i els fèmurs es va eliminar amb PBS en una placa de Petri. La medul·la òssia es va tornar a suspendre en una suspensió unicel·lular i es va comptar amb un hemocitòmetre. A continuació, les cèl·lules es van tornar a suspendre en medis (RPMI [HyClone Cat# SH30027.01] amb 2-mercaptoetanol [Gibco Ref# 21985-023], 1% de penicil·lina/estreptomicina [HyClone Cat# SV30010] i 10% sèrum boví fetal [VWR Cat #97068-085]) a una concentració d'1,25 × 106 cèl·lules per ml, complementat amb 20 ng/ml de factor estimulant de colònies de granulòcits i macròfags (GM-CSF) (Biolegend Cat # 576308) i alíquotes en matràs de cultiu de 25 cm2, 5 ml per matràs. Els cultius es van posar en incubadores humidificades a 37 ◦C amb un 5% de CO2 i es van deixar créixer durant 7 dies. El segon dia del cultiu, es van afegir 5 ml de medi fresc amb 20 ng/ml de GM-CSF. El dia cinc, es van centrifugar 5 ml de cada cultiu i es va eliminar el sobrenedant. Les cèl·lules es van tornar a suspendre en 5 ml de medi fresc amb 20 ng/ml de GM-CSF i es van tornar a afegir als matràs de cultiu. Els cultius es van collir el dia 7 i es van preparar per a la vacunació.

Preparació de la vacunació de cèl·lules dendrítiques

Els cultius de cèl·lules dendrítiques (DC) es van transferir a un tub cònic de 50 ml i es van comptar amb un hemocitòmetre. Les cèl·lules es van estimular amb 100 ng/mL de lipopolisacàrid (LPS) d'Escherichia coli O55: B5 (Sigma Cat # L2880) i 1 µg/mL d'ovalbúmina de pollastre (OVA) 257–264 (SIIN) (PepScan Systems, Lelystad, Netherland) durant 1 h en una incubadora a 37 ◦C amb un 5% de CO2. Les cèl·lules es van rentar tres vegades amb PBS i es van tornar a suspendre a una concentració de 5 × 105 cèl·lules per 30 µL. Les vacunes es van administrar a dosis de 5 × 105 cèl·lules per 30 µL de PBS.

Processament de teixits

Els ganglis limfàtics i la melsa es van recollir i es van col·locar en plaques de Petri amb 2 ml de solució salina tamponada Hanks (HBSS). Es van pressionar en suspensions unicel·lulars mitjançant la part posterior d'un tap de xeringa de 3 ml. Les suspensions unicel·lulars es van filtrar en un tub cònic de 50 ml mitjançant un colador cel·lular de 70 µm de mida de porus. Els ganglis limfàtics es van comptar amb un hemocitòmetre. Es van centrifugar les mels, es va eliminar el sobrenedant i les cèl·lules es van tornar a suspendre en tampó de lisi ACK (8,29 g de NH4Cl [0,15 M], 1 g de KHCO3 [10,0 mM], 37,2 mg de Na2EDTA [0,1 mM] en 1 ml d'aigua Milli Q) i es deixa reposar durant cinc minuts per lisar els eritròcits. Les cèl·lules es van rentar amb HBSS dues vegades abans de ser resuspeses al medi i es van comptar amb un hemocitòmetre.

Els pulmons es van recol·lectar i es van pesar abans de col·locar-los en un tub suau MACSTM que contenia 1 mg/ml de col·lagenasa IV (Gibco Ref#17104-019) i 5 µg/mL de DNasa I (Roche Ref# 11284932001) en HBSS. Utilitzant el dissociador gentleMACSTM, les mostres es van passar a través del protocol pulmonar A i després es van incubar durant 20 min en una incubadora a 37 ◦ C amb un 5% de CO2. Les mostres es van passar a través del protocol pulmonar B al dissociador gentleMACSTM. Es va afegir dues vegades el volum de mostra d'HBSS a les mostres per neutralitzar la reacció enzimàtica. Les mostres es van filtrar en un tub cònic de 50 ml a través d'un colador cel·lular de 70 µm de mida de porus. A continuació, es van rentar les cèl·lules dues vegades amb HBSS i es van tornar a suspendre en tampó de lisi ACK. Després de cinc minuts al tampó de lisi ACK, les cèl·lules es van rentar dues vegades amb HBSS i es van tornar a suspendre al medi.

Assaig de resposta de citocines

Les suspensions unicel·lulars de les mostres de teixit es van sembrar en plaques de 96-pous per duplicat, on un pou va ser tractat com a control sense estimulació i l'altre va rebre un tractament estimulant. Els pous no estimulats només van rebre medis i els pous tractats amb estimulants van rebre 10 ng/mL d'acetat de miristat de forbol (PMA) i 1.500 ng/mL d'ionomicina al medi. Les cèl·lules es van col·locar en una incubadora a 37 ◦ C amb un 5% de CO2 durant una hora. A continuació, es va afegir Brefeldin A (GolgiPlug, Biolegend Cat # 420601) (dilució × 100) a tots els pous de mostra i la placa es va tornar a col·locar a la incubadora durant quatre hores addicionals. Les cèl·lules es van rentar dues vegades amb PBS i es van tacar per analitzar-les mitjançant citometria de flux.

Cèl·lules de melanoma B16F10

Les cèl·lules B16F10 es van descongelar del nitrogen líquid i es van comptar amb un hemocitòmetre. A continuació, les cèl·lules es van tornar a suspendre en medi (medi Eagles modificat en glucosa de Dulbecco [HyClone Cat#SH3002201] amb 1% de penicil·lina/estreptomicina [HyClone Cat# SV30010] i 10% de sèrum boví [VWR Cat#10158-358]) per una concentració d'1 × 105 cèl·lules per ml. Les cèl·lules B16F10 es van repartir en alícuotes en matràs de cultiu i es van col·locar en una incubadora a 37 ◦ C amb un 5% de CO2. Per preparar les cèl·lules B16F10 per a l'administració, les cèl·lules es van transferir dels flascons de cultiu a un tub cònic de 50 ml, es van rentar amb PBS i després es van tornar a suspendre en PBS. Les cèl·lules es van comptar amb un hemocitòmetre i es van tornar a suspendre en PBS per donar dosis de 3 × 105 cèl·lules per 200 µL.

Tinció intracel·lular d'anticossos de citocines

Les cèl·lules es van sembrar en plaques de {{{0}} pous i es van tornar a suspendre en un bloc Fc (anti-CD16/CD32, BioLegend Cat # 101320) i es van incubar a 4 ◦ C durant 15 min. Les cèl·lules es van rentar amb solució salina tamponada amb fosfat que contenia 0,5% d'albúmina sèrica bovina (tampó FACS) dues vegades, després es van tornar a suspendre en una barreja mestra d'anticossos de tinció de superfície cel·lular (CD45, BioLegend Cat # 103132; NKp46, BioLegend Cat # 137617; DX5, BioLegend Cat#108919; CD127, BioLegend Cat#135007; Lineage Cocktail, BioLegend Cat#133311) i es va incubar a 4 graus durant 20 minuts. Les cèl·lules es van rentar dues vegades amb solució salina tamponada amb fosfat i es van tornar a suspendre en un colorant de viabilitat Zombie Aqua Fixable (FVD) (BioLegend Cat # 423101) i es van incubar a 4 ◦ C durant 30 min. Es va utilitzar solució salina tamponada amb fosfat per rentar les cèl·lules dues vegades abans de la resuspensió al tampó de fixació (BioLegend Cat # 420801). Les cèl·lules es van incubar a 4 ◦ C durant 20 min. Després de la fixació, les cèl·lules es van rentar dues vegades amb tampó de permeabilització (BioLegend Cat # 421002). Les cèl·lules es van tornar a suspendre en una barreja mestra d'anticossos de tinció intracel·lular (IL-22, BioLegend Cat#516404; IL-17A, eBioscience Cat# 17-7177-81) i es van incubar a 4 ◦C per 20 min. Les cèl·lules es van rentar dues vegades amb tampó de permeabilització, després es van tornar a suspendre al tampó FACs i després es van processar amb un citòmetre de flux BD FACSCantoTM II i es van analitzar mitjançant el programari BD FACSDivaTM.

Beneficis de cistanche per a homes que enforteixen el sistema immunitari

Tinció d'anticossos del factor de transcripció

Les cèl·lules es van sembrar en plaques de {{{0}}pous i es van tornar a suspendre en un bloc FC (anti-CD16/CD32 BioLegend Cat # 101320) i es van incubar a 4 ◦ C durant 15 min. Les cèl·lules es van rentar dues vegades amb tampó FACs (0,5% en albúmina sèrica bovina [HyClone Cat # SH30574.02] en PBS), després es van tornar a suspendre en una barreja mestra d'anticossos de tinció de superfície cel·lular (CD45, BioLegend Cat # 103132; NKp46). , BioLegend Cat # 137617; DX5, BioLegend Cat # 108919; CD127, BioLegend Cat # 135007; Lineage Cocktail, BioLegend Cat # 133311) i es va incubar a 4 ◦ C durant 20 min. A continuació, es van rentar les cèl·lules amb solució salina tamponada amb fosfat dues vegades resuspesa en FVD (BioLegend Cat # 423101) i es van incubar a 4 ◦ C durant 20 min. Les cèl·lules es van rentar dues vegades amb solució salina tamponada amb fosfat i es van tornar a suspendre en tampó de fixació FoxP3 del ratolí (BD Pharmingen BD Sciences Cat # 51-9006124) i es van incubar a 4 ◦ C durant 30 min. Després de la fixació, les cèl·lules es van rentar amb tampó de permeabilització FoxP3 del ratolí (BD Pharmingen BD Sciences Cat # 51-9006125) resuspès en tampó de permeabilització FoxP3 i es van incubar a 37 ◦ C durant 30 min. Les cèl·lules es van tornar a suspendre en anticossos del factor de transcripció (ROR gamma(t), eBioscience Cat # 17-6988-82; T-bet, eBioscience Cat # 12-5825-82) i es van incubar a 4 ◦ C durant 20 min. Les cèl·lules es van rentar dues vegades amb tampó de permeabilització, després es van tornar a suspendre al tampó FACs i es van analitzar mitjançant un citòmetre de flux BD FACSCantoTM II i el programari BD FACSDivaTM.

Anàlisi estadística

Les poblacions esplèniques i pulmonars de NCR+ i NCR− ILC3 es van analitzar mitjançant proves t no aparellades. L'anàlisi de la població de l'experiment cinètic es va comparar mitjançant l'anàlisi de variància unidireccional (ANOVA) i la prova de comparació múltiple de Tukey. L'anàlisi de citocines a la melsa i els pulmons es va examinar mitjançant ANOVA bidireccional i la prova de comparacions múltiples de Šídák. Les mitjanes dels grups de tractament es van definir com a significativament diferents amb un valor p < 0,05.

Estratègia de gating

Primer, utilitzant l'àrea de dispersió cap endavant (FSC-A) i l'àrea de dispersió lateral (SSC-A), els limfòcits es van tancar. A continuació, es van excloure les cèl·lules de doblet mitjançant FSC-A i FSC-height (FSC-H). Les cèl·lules vives es van tancar prenent les cèl·lules negatives per a FVD. A continuació, es van agafar cèl·lules CD127+ i còctels de llinatge per reduir les ILC. Les cèl·lules CD45+ van ser tancades. Per assegurar-se que totes les cèl·lules NK estaven excloses, es va activar DX5−. Per a la identificació del factor de transcripció d'ILC3, es van activar les cèl·lules ROR t +, i d'aquestes cèl·lules, les ILC3 NCR+ eren T-bet+ i NKp46+ i les NCR− ILC3 eren T-bet− i NKp46. Per a la identificació de citocines, després de l'activació de limfòcits, cèl·lules simples, cèl·lules vives i CD127+ llinatge-CD45+, IL-17 i IL-22 es van controlar com a produïdes per ILC3, ja que les ILC3 serien les úniques cèl·lules d'aquesta porta final que podrien estar produint IL-22 i IL-17.

Beneficis de cistanche per a homes que enforteixen el sistema immunitari

5. Conclusions

Tot i que l'augment de la producció d'IL-17 i IL-22 derivada de l'ILC3-a la melsa observada en el model sense tumor es va perdre en el model de desafiament del tumor, hi va haver un canvi oposat en NCR+ i Poblacions NCR− ILC3 als pulmons. Això suggereix que la vacunació amb DC podria haver influït en els ILC3 en el model de desafiament del tumor, així com en els ratolins sense tumor. Tanmateix, l'efecte d'aquesta relació entre els DC de la vacuna i els ILC3 sobre les respostes antitumorals segueix sent desconegut i és una direcció de recerca futura. Així, els estudis aquí descrits demostren que hi ha comunicacions entre les vacunes basades en DC i les subpoblacions ILC3, tant en ratolins lliures de tumors com amb tumors. Aquestes comunicacions i els seus impactes posteriors en les respostes immunitàries semblen ser complexes. Aquestes observacions contribueixen al conjunt de la literatura que busca desxifrar la relació entre les vacunes de DC i les ILC3 en un esforç per desenvolupar estratègies de vacunació de DC millorades. Recomanem més estudis que investiguin el potencial de dissenyar estratègies de vacunació que puguin modular aquestes comunicacions per optimitzar les respostes ILC3 per ajudar en les respostes antitumorals i limitar el suport de les respostes pro-tumorals.

Referències

1. Crinier, A.; Vivier, E.; Bléry, M. Cèl·lules limfoides innates similars a Helper i immunoteràpia contra el càncer. Semin. Immunol. 2019, 41, 101274. [CrossRef] [PubMed]

2. Salimi, M.; Wang, R.; Yao, X.; Li, X.; Wang, X.; Hu, Y.; Chang, X.; Fan, P.; Dong, T.; Ogg, G. Les poblacions de cèl·lules limfoides innates activades s'acumulen als teixits tumorals humans. BMC Cancer 2018, 18, 341. [CrossRef] [PubMed]

3. Spits, H.; Bernink, JH; Lanier, L. Cèl·lules NK i cèl·lules limfoides innates tipus 1: socis en la defensa de l'hoste. Nat. Immunol. 2016, 17, 758–764. [CrossRef] [PubMed]

4. Bruchard, M.; Ghiringhelli, F. Desxifrar els papers de les cèl·lules limfoides innates en el càncer. Davant. Immunol. 2019, 10, 656. [CrossRef]

5. Mazzurana, L.; Rao, A.; Van Acker, A.; Mjösberg, J. Els papers de les cèl·lules limfoides innates en el sistema immunitari humà. Semin. Immunopatol. 2018, 40, 407–419. [Ref creuat]

6. Solano-Gálvez, SG; Tovar-Torres, SM; Tron-Gómez, MS; Weiser-Smeke, AE; Álvarez-Hernández, DA; Franyuti-Kelly, GA; Tapia-Moreno, M.; Ibarra, A.; Gutiérrez-Kobeh, L.; Vázquez-López, R. Human Dendritic Cells: Ontogenic and Their Subsets in Health and Disease. Med. Ciència. 2018, 6, 88. [CrossRef]

7. Steinman, RM; Hemmi, H. Cèl·lules dendrítiques: traducció de la immunitat innata a adaptativa. Curr. Superior. Microbiol. Immunol. 2006, 311, 17–58. [Ref creuat]

8. Fu, C.; Estora.; Zhou, L.; Mi, QS; Jiang, A. Vacunes basades en cèl·lules dendrítiques contra el càncer: reptes, avenços i oportunitats de futur. Immunol. Investig. 2022, 51, 2133–2158. [Ref creuat]

9. Karimi, K.; Boudreau, JE; Fraser, K.; Liu, H.; Delanghe, J.; Gauldie, J.; Xing, Z.; Bramson, JL; Wan, Y. La immunitat antitumoral millorada provocada per les vacunes de cèl·lules dendrítiques és el resultat de la seva capacitat per implicar cèl·lules NK productores de CTL i IFN. Mol. Allà. 2008, 16, 411–418. [Ref creuat]

10. Bouwer, AL; Saunderson, SC; Caldwell, FJ; Damani, TT; Pelham, SJ; Dunn, AC; Jack, RW; Stoitzner, P.; Les cèl·lules McLellan, AD NK són necessàries per a la immunoteràpia basada en cèl·lules dendrítiques en el moment del desafiament del tumor. J. Immunol. 2014, 192, 2514–2521. [Ref creuat]

11. Pampena, MB; Levy, EM Cèl·lules assassines naturals com a cèl·lules auxiliars en vacunes contra el càncer de cèl·lules dendrítiques. Davant. Immunol. 2015, 6, 13. [CrossRef] [PubMed]

12. Gardner, A.; de Mingo Pulido, Á.; Ruffell, B. Les cèl·lules dendrítiques i el seu paper en la immunoteràpia. Davant. Immunol. 2020, 11, 924. [CrossRef] [PubMed]

13. Cortez, VS; Robinette, ML; Colonna, M. Cèl·lules limfoides innates: nous coneixements sobre la funció i el desenvolupament. Curr. Opina. Immunol. 2015, 32, 71–77. [CrossRef] [PubMed]

14. Montaldo, E.; Juelke, K.; Romagnani, C. Cèl·lules limfoides innates del grup 3 (ILC3): Origen, diferenciació i plasticitat en humans i ratolins. Eur. J. Immunol. 2015, 45, 2171–2182. [Ref creuat]

15. Vacca, P.; Chiossone, L.; Mingari, MC; Moretta, L. Heterogeneïtat de cèl·lules NK i altres cèl·lules limfoides innates en decídua humana i murina. Davant. Immunol. 2019, 10, 170. [CrossRef] [PubMed]

16. Rankin, LC; Girard-Madoux, MJ; Seillet, C.; Mielke, LA; Kerdiles, Y.; Fenis, A.; Wieduwild, E.; Putoczki, T.; Mondot, S.; Lantz, O.; et al. Complementarietat i redundància de cèl·lules limfoides innates que produeixen IL-22-. Nat. Immunol. 2016, 17, 179–186. [CrossRef] [PubMed]

17. Hoorweg, K.; Peters, CP; Cornelissen, F.; Aparicio-Domingo, P.; Papazian, N.; Kazemier, G.; Mjösberg, JM; Escup, H.; Cupedo, T. Diferències funcionals entre les cèl·lules limfoides innates NKp44(-) i NKp44(+) RORC(+) humanes. Davant. Immunol. 2012, 3, 72. [CrossRef]

18. Carrega, P.; Loiacono, F.; Di Carlo, E.; Scaramuccia, A.; Mora, M.; Conte, R.; Benelli, R.; Spaggiari, GM; Cantoni, C.; Campana, S.; et al. NCR(+)ILC3 es concentra en el càncer de pulmó humà i està associat amb estructures limfoides intratumorals. Nat. Commun. 2015, 6, 8280. [CrossRef]

19. Spits, H.; Artis, D.; Colonna, M.; Diefenbach, A.; Di Santo, JP; Eberl, G.; Koyasu, S.; Locksley, RM; McKenzie, AN; Mebius, RE; et al. Cèl·lules limfoides innates: una proposta per a una nomenclatura uniforme. Nat. Reverent Immunol. 2013, 13, 145–149. [Ref creuat]

20. Novia, R.; Finlay, CM; Willis, C.; Bevington, SL; Soley, J.; Ng, STH; Baker, SM; Andrews, S.; Hepworth, MR; Withers, DR Les xarxes de factors de transcripció recíprocs governen la funció i la identitat del subconjunt ILC3 resident en teixits. Nat. Immunol. 2021, 22, 1245–1255. [Ref creuat]

21. van Beek, JJP; Martens, AWJ; Bakdash, G.; de Vries, IJM Cèl·lules limfoides innates a la immunitat tumoral. Biomedicines 2016, 4, 7. [CrossRef] [PubMed]

22. Mattner, J.; Wirtz, S. Amic o enemic? El paper ambigu de les cèl·lules limfoides innates en el desenvolupament del càncer. Tendències Immunol. 2017, 38, 29–38. [Ref creuat]

23. Kirchberger, S.; Royston, DJ; Boulard, O.; Thornton, E.; Franchini, F.; Szabady, RL; Harrison, O.; Powrie, F. Les cèl·lules limfoides innates sostenen el càncer de còlon mitjançant la producció d'interleucina-22 en un model de ratolí. J. Exp. Med. 2013, 210, 917–931. [CrossRef] [PubMed]

24. Irshad, S.; Flores-Borja, F.; Lawler, K.; Monypenny, J.; Evans, R.; Mascle, V.; Gordon, P.; Cheung, A.; Gazinska, P.; Noor, F.; et al. Les cèl·lules limfoides innates RORgammat(+) promouen la metàstasi dels ganglis limfàtics dels càncers de mama. Càncer Res. 2017, 77, 1083–1096. [CrossRef] [PubMed]

25. Goc, J.; Lv, M.; Bessman, NJ; Flamar, AL; Sahota, S.; Suzuki, H.; Teng, F.; Putzel, GG; Eberl, G.; Withers, DR; et al. La desregulació dels ILC3 desencadena la progressió i la resistència a la immunoteràpia en el càncer de còlon. Cel·la 2021, 184, 5015–5030.e16. [Ref creuat]

26. Liu, Y.; Cançó, Y.; Lin, D.; Lei, L.; Mei, Y.; Jin, Z.; Gong, H.; Zhu, Y.; Hu, B.; Zhang, Y.; et al. Les cèl·lules limfoides innates del grup 3 NCR(-) orquestren l'eix IL-23/IL{-17 per promoure el desenvolupament del carcinoma hepatocel·lular. EBioMedicine 2019, 41, 333–344. [CrossRef] [PubMed]

27. Bruchard, M.; Geindreau, M.; Perrichet, A.; Truntzer, C.; Papereta, E.; Boidot, R.; Racoeur, C.; Barsac, E.; Chalmin, F.; Hibos, C.; et al. El reclutament i l'activació de cèl·lules limfoides innates tipus 3 promouen respostes immunes antitumorals. Nat. Immunol. 2022, 23, 262–274. [Ref creuat]

28. Rethacker, L.; Noi, M.; Bisio, V.; Roussin, F.; Denizeau, J.; Vicent-Salomó, A.; Borcoman, E.; Sedlik, C.; Piaggio, E.; Toubert, A.; et al. Cèl·lules limfoides innates: els subconjunts NK i ILC3 citotòxics s'infiltren en els ganglis limfàtics del càncer de mama metastàtic. Oncoimmunology 2022, 11, 2057396. [CrossRef]

29. Cesta, MF Estructura, funció i histologia normals de la melsa. Toxicol. Patol. 2006, 34, 455–465. [Ref creuat]

30. Ishiguro, T.; Nakajima, M.; Naito, M.; Muto, T.; Tsuruo, T. Identificació de gens expressats de manera diferencial en sublínies de melanoma murí B16 amb diferents potencials metastàtics. Càncer Res. 1996, 56, 875–879.

31. Szabo, SJ; Kim, ST; Costa, GL; Zhang, X.; Fathman, CG; Glimcher, LH Un nou factor de transcripció, T-bet, dirigeix ​​el compromís del llinatge Th1. Cel·la 2000, 100, 655–669. [CrossRef] [PubMed]