El lector RNA M6 A YTHDF2 controla la immunitat antitumoral i antiviral de cèl·lules NK Part 3

YTHDF2 és necessari per a la supervivència, la proliferació i les funcions efectores de cèl·lules NK mediades per IL-15

IL-15 és una de les citocines, si no la més important, per a les funcions pleiotròpiques de les cèl·lules NK. Nosaltres i altres vam descobrir anteriorment que l'IL-15 juga un paper clau en la regulació de l'homeòstasi, la supervivència i les funcions efectores de les cèl·lules NK (Becknell i Caligiuri, 2005; Carsonet al., 1997; Carson et al., 1994; Wang et al., 1994; 2019b; Yu et al., 2013).

La pleiotropia de les cèl·lules fa referència a la seva capacitat per realitzar diferents funcions en diferents entorns. La pleiotropia cel·lular està estretament relacionada amb la immunitat perquè moltes cèl·lules del sistema immunitari poden exercir una varietat de funcions diferents.

En el sistema immunitari, les cèl·lules T són un tipus de cèl·lules molt crítiques. Reconeixen i ataquen els patògens, alhora que regulen l'activitat d'altres cèl·lules immunitàries. La pleiotropia de les cèl·lules T és molt important perquè quan el sistema immunitari es troba amb un nou patogen, les cèl·lules T han de jugar diferents papers en un període curt per respondre eficaçment. Per exemple, quan el sistema immunitari es troba amb una infecció bacteriana, les cèl·lules T han de jugar el paper de matar els bacteris, i quan el sistema immunitari es troba amb una infecció viral, les cèl·lules T han de jugar el paper de regular altres cèl·lules immunitàries.

A més, en el sistema immunitari, una classe de cèl·lules anomenades macròfags també tenen efectes pleiotròpics. Poden fagocitar i descompondre patògens estrangers, i també poden activar altres cèl·lules immunitàries per atacar patògens. La pleiotropia dels macròfags és important perquè necessiten jugar diferents papers en diferents entorns. Per exemple, en les infeccions víriques, els macròfags necessiten segregar algunes substàncies per combatre el virus, mentre que en les infeccions bacterianes, els macròfags necessiten absorbir i digerir els bacteris per eliminar el patogen.

En resum, hi ha una estreta relació entre la pleiotropia cel·lular i la immunitat. Les cèl·lules pleiotròpiques poden jugar diferents papers en entorns infectats per diferents patògens, millorant així la capacitat de resposta del sistema immunitari i millorant la immunitat del cos a diversos patògens. Per tant, hem de parar atenció a la pleiotropia de les cèl·lules i també enfortir el cultiu de la immunitat per mantenir la salut humana. Es pot veure que hem de millorar la memòria, i Cistanche deserticola pot millorar significativament la memòria, perquè Cistanche deserticola també pot regular l'equilibri dels neurotransmissors, com augmentar els nivells d'acetilcolina i factors de creixement. Aquestes substàncies són molt importants per a la memòria i l'aprenentatge. A més, Cistanche deserticola també pot millorar el flux sanguini i promoure el lliurament d'oxigen, cosa que pot garantir que el cervell rebi suficients nutrients i energia, millorant així la vitalitat i la resistència del cervell.

Fes clic a Coneix maneres de millorar la teva memòria

En l'estudi actual, mostrem que IL-15 va regular els nivells d'ARNm i proteïnes de YTHDF2 a les cèl·lules NK (Fig. 6 A; i Fig. 1, D-F). Per tant, vam especular que YTHDF2 és necessari per a la supervivència mediada per IL-15 i les funcions efectores de les cèl·lules NK.

Primer vam intentar identificar possibles factors de transcripció aigües avall de la senyalització IL-15 que regulen directament l'expressió YTHDF2. Hem analitzat l'Enciclopèdia d'elements d'ADN mitjançant la base de dades del navegador del genoma de la Universitat de Califòrnia, Santa Cruz (https://genome.ucsc.edu), que proporciona prediccions de llocs d'unió a tot el genoma, en combinació amb JASPAR (http://jaspar.genereg). .net).

Hem trobat que STAT5, que és un factor clau aigües avall d'IL-15 a les cèl·lules NK, té quatre llocs d'unió dins de 2 kb aigües amunt del lloc d'inici de la transcripció (TSS) de Ythdf2, cosa que indica que IL-15 pot positivament regular la transcripció de Ythdf2 a les cèl·lules NK del ratolí mitjançant STAT5.

Mitjançant l'ús de l'inhibidor STAT5 STAT5-IN{-1 (Müller et al., 2008), vam demostrar que la inhibició de STAT5 va donar lloc a una disminució de Ythdf2 tant als nivells d'ARNm com de proteïnes a les cèl·lules NK murines (Fig. S4, A). i B). Per confirmar encara més que YTHDF2 és un factor aigües avall regulat per STAT5, hem utilitzat ratolins Stat5fl/fl Ncr1-iCre (d'ara endavant anomenats ratolins Stat5ΔNK), on STAT5 s'elimina específicament a les cèl·lules NK del ratolí (Wiedemann et al. al., 2020).

Hem tractat cèl·lules NK esplèniques de ratolins Stat5WT i Stat5ΔNK amb IL-15. Hem trobat que YTHDF2 va disminuir substancialment a les cèl·lules NK de Stat5ΔNKmice en comparació amb les cèl·lules NK de ratolins Stat5WT tant a nivells d'ARN com de proteïnes (Fig. 6, B i C; i Fig. S4, C i D).

L'assaig del reporter de la luciferasa va demostrar que tant STAT5a com STAT5b activaven directament la transcripció del gen Ythdf2 (Fig. 6, D i E). Els resultats de la immunoprecipitació de cromatina (ChIP)-qPCR van mostrar que STAT5 té un enriquiment significatiu en quatre llocs sobre el control normal d'IgG, cosa que indica la unió directa a les cèl·lules NK del ratolí (Fig. 6 F). En conjunt, els nostres resultats demostren que l'expressió YTHDF2 està regulada per STAT5 aigües avall de la senyalització IL-15 a les cèl·lules NK.

Aleshores ens vam preguntar si les cèl·lules NK deficients de Ythdf2-eren defectuoses en la seva resposta a IL-15. Hem aïllat cèl·lules NK esplèniques de ratolins Ythdf2ΔNK i ratolins Ythdf2WT i hem cultivat in vitro en presència d'IL-15. Hem trobat que el creixement de cèl·lules NK va disminuir significativament en els ratolins Ythdf2ΔNK en comparació amb els ratolins Ythdf2WT (Fig. 6 G). Els assaigs d'etiquetatge CellTrace Violet (CTV) van mostrar que la proliferació de cèl·lules NK es va veure afectada per la deficiència de Ythdf2 (Fig. 6 H).

 L'anàlisi de la distribució del cicle cel·lular va revelar una fracció significativament augmentada de cèl·lules NK de ratolins Ythdf2ΔNK a la fase G0/G1, però una fracció significativament disminuïda de cèl·lules NK de ratolins Ythdf2ΔNK a la fase S (Fig. 6 I), cosa que suggereix que la deficiència de Ythdf2 resulta en aturada de fase G{0/G1 en cèl·lules NK.

A més, hi va haver un augment de dues a tres vegades de les cèl·lules NK apoptòtiques (annexina V + Sytox-Blue +/-) dels ratolins Ythdf2ΔNK en comparació amb les dels ratolins Ythdf2WT (Fig. 6 J), cosa que indica la supervivència defectuosa de les cèl·lules NK després de la pèrdua de Ythdf2. Aquests resultats suggereixen que YTHDF2 regula la resposta de les cèl·lules NK a IL-15 in vitro. Com que IL-15 es tradueix i es secreta malament in vivo en estat estacionari (Corbel et al., 1996; Fehniger et al., 2001), per explorar si les cèl·lules NK deficients en Ythdf2- són defectuoses en la seva resposta. a IL-15 in vivo, vam tractar ratolins amb IL-15.

Hem trobat que les cèl·lules deficients de Ythdf2-en comparació amb les cèl·lules NK de WT van mostrar una proliferació cel·lular significativament reduïda i un augment de l'apoptosi cel·lular quan els ratolins van ser tractats amb IL-15 (Fig. 6 K; i Fig. S4, E–J). Aquestes dades suggereix que YTHDF2 regula la resposta de les cèl·lules NK a IL-15, especialment en algunes condicions amb un alt nivell d'IL-15. També vam trobar que els nivells d'ARNm i proteïnes d'IFN-, granzima B i perforina es van reduir significativament a les cèl·lules NK Ythdf2ΔNK en comparació amb les cèl·lules NK Ythdf2WT en resposta a IL-15 (Fig. 6, L–N), cosa que indica que YTHDF2 també contribueix a les funcions efectores de cèl·lules NK mediades per IL-15 in vitro.

Col·lectivament, les nostres dades demostren que YTHDF2 és necessari per a la supervivència, la proliferació i les funcions efectores de cèl·lules NK mediades per IL-15. A continuació, vam investigar els mecanismes aigües avall pels quals YTHDF2 regula la supervivència, la proliferació i la funció efectora de NK mediada per IL-15. Hem trobat que les cèl·lules NK dels ratolins Ythdf2ΔNK i Ythdf2WT tenien nivells similars dels receptors IL-15 CD122 (IL{-15R) i CD132 (IL{-15R c; Fig. S4 K). La senyalització IL-15 està mediada per almenys tres vies de senyalització aigües avall a les cèl·lules NK: Ras–Raf–MEK–ERK, PI3K–AKT–mTOR i JAK1/3–STAT3/5 (Mishra et al., 2014).

Per investigar quina via de senyalització està regulada per YTHDF2 a les cèl·lules NK, vam examinar els nivells de fosforilació de cèl·lules ERK, AKT, S6, STAT3 i STAT5 a NK de ratolins Ythdf2ΔNK o ratolins Ythdf2WT després de l'estimulació amb IL -15.

Els resultats van mostrar que la deficiència d'Ythdf2 no ​​va afectar la fosforilació d'ERK, AKT, S6 i STAT3 després de l'estimulació d'IL-15(Fig. S4, L i M), però va inhibir significativament l'activació d'STAT5, com ho demostra la reducció dels nivells de fosforilació d'STAT5 a Ythdf{{ 7}}cèl·lules NK deficients que les de les cèl·lules NK dels ratolins Ythdf2WT (Fig. 6 O), cosa que indica que YTHDF2 és necessari per a una senyalització IL-15/STAT5 òptima a les cèl·lules NK activades.

Com que vam demostrar que STAT5 fosforilada aigües avall d'IL-15s'uneix al promotor de Ythdf2 (Fig. 6, D-F) i aquí vam demostrar que YTHDF2 és necessari per a una fosforilació òptima de STAT5, les nostres dades suggereixen un bucle de retroalimentació positiva STAT5-YTHDF2 aigües avall. d'IL-15 que pot controlar la supervivència, la proliferació i les funcions efectores de les cèl·lules NK.

L'anàlisi de tot el transcriptoma identifica Tardbp com un objectiu YTHDF2 a les cèl·lules NK

Per abordar el mecanisme molecular pel qual YTHDF2 regula les cèl·lules NK, primer vam realitzar la seqüenciació d'ARN (seq) en cèl·lules Ythdf2WT i Ythdf2ΔNK NK expandides IL-2. La supressió de Ythdf2 a les cèl·lules NK va donar lloc a 617 gens expressats de manera diferent, inclosos 252 gens regulats a l'alça i 365 gens regulats a la baixa (Fig. S5 A).

L'anàlisi de l'ontologia gènica (GO) va mostrar que els gens expressats de manera diferencial es van enriquir significativament en processos relacionats amb el cicle cel·lular, la divisió cel·lular i la divisió cel·lular, com ara la mitoticcitocinesi, la segregació de cromosomes, el fus, el nucleosoma, el cos mitjà i el cromosoma (Fig. 7). A).

L'anàlisi d'enriquiment del conjunt de gens (GSEA) va demostrar un enriquiment significatiu de les dianes E2F, G2/Mcheckpoint i els conjunts de gens distintius del fus mitòtic a les cèl·lules Ythdf2ΔNKNK (Fig. S5 B). Els gens relacionats amb el cicle cel·lular i la divisió cel·lular, inclosos Aurka, Aurkb, Cdc20, Cdc25b, Cdc25c, Cdk1, E2f2 i Plk1 (Bertoli et al., 2013), es van reduir significativament a les cèl·lules NK dels ratolins Ythdf2ΔNK B (Fig. ).

Els gens de segregació de cromosomes i fusos com Anln, Aspm, Birc5, Bublb, Cenpe, Esco2, Ska1, Ska3 i Tpx2 (Gorbsky, 2015) també es van reduir significativament a les cèl·lules NK dels ratolins Ythdf2ΔNK en comparació amb les cèl·lules NK de Ythdf2ΔNK (Fig.2W7Tmice).

A més, els gens de supervivència cel·lular, inclosos Birc5 (Niu et al., 2010), Septin4 (Larisch et al., 2000) i Rffl (Yanget al., 2007), es van reduir significativament a les cèl·lules NK dels ratolins Ythdf2ΔNK (Fig. 7 D). Els gens de funció efectora de cèl·lules NK, inclosos Klrk1, Ncr1, CD226 i Gzma (Bezman et al., 2012), també es van reduir significativament a les cèl·lules NK dels ratolins Ythdf2ΔNK (Fig. 7 D).

Aquestes dades donen suport als nostres rols caracteritzats de YTHDF2 en la regulació de la proliferació de cèl·lules NK, la supervivència i les funcions efectores. Després vam realitzar m6A-seq en cèl·lules NK expandides IL-2 de ratolins Ythdf2WT i Ythdf2ΔNK. L'anàlisi dels components principals va mostrar que tres rèpliques biològiques de cada genotip es van agrupar (dades no mostrades), cosa que suggereix una bona repetibilitat de les mostres de m6A-seq.

L'anàlisi d'optimització hipergeomètrica de l'enriquiment de motius (HOMER) va identificar el motiu de consens m6A (GGAC), cosa que indica l'èxit de l'enriquiment de les transcripcions modificades per m6A (Fig. 7 E). Les modificacions de m6A es van localitzar predominantment en les transcripcions que codificaven proteïnes, i els pics es van enriquir a les 59 regions no traduïdes (UTR) i 39UTR, especialment al voltant dels codons d'inici i de parada (Fig. 7 F i Fig. S5 C).

L'anàlisi d'enriquiment de gens amb pics m6A va revelar que la majoria de les transcripcions marcades amb m6A a les cèl·lules NK es van enriquir en vies implicades en el cicle cel·lular i la proliferació cel·lular (Fig. S5 D).

For more information:1950477648nn@gmail.com