Condensats Imd regulats per teaflavina Controlen l'homeòstasi intestinal i l'envelliment de la drosophila

Siusplau contactaoscar.xiao@wecistanche.comper a més informació

RESUM

El te negre és la beguda de te més consumida al món i s'ha informat constantment que té beneficis contra l'envelliment. Tanmateix, encara es desconeix en gran mesura si les teaflavines, un tipus de fitoquímics característics dels extractes de te negre, estan implicades en la regulació de l'envelliment i la vida útil dels consumidors. En aquest estudi, mostrem que les teaflavines tenen un paper beneficiós en la prevenció de les fuites intestinals i la disbiosi, retardant així l'envelliment de la Drosophila. Mecànicament, les teaflavines regulen el conjunt de condensats d'Imd per governar negativament la sobreactivació dels senyals d'Imd als intestins de la mosca de la fruita. A més, les teaflavines eviten la colitis induïda per DSS en ratolins, cosa que suggereix que les teaflavines tenen un paper en la modulació de la integritat intestinal. En general, el nostre estudi revela un mecanisme molecular pel qual les teaflavines regulen l'homeòstasi intestinal probablement mitjançant el control de la coalescència Imd.

Feu clic aquí per saber-ne més

INTRODUCCIÓ

L'envelliment, caracteritzat per una disminució de les funcions fisiològiques en els sistemes d'òrgans individuals i un risc creixent de malaltia i mort, implica l'acumulació de danys a molècules, cèl·lules i teixits (Alavez et al., 2011; Bartke et al., 2019; Engeet). al., 2017). La identificació de materials funcionals o substàncies químiques que eviten el deteriorament biològic per retardar el procés d'envelliment i allargar la vida útil és sens dubte fonamental (Bar-ardo et al., 2017; Kapahi et al., 2017). Estudis anteriors han informat que el te negre, el te més consumit al món, posseeix activitats importants que retarden l'envelliment (Cameron et al., 2008; Fei et al., 2017; Kumar i Rizvi, 2017; Naumovski et al., 2019). ; Peng et al., 2009; Xiao et al., 2020). La suplementació dietètica amb extractes de te negre allarga de manera eficient la vida útil d'animals d'experimentació com ara cucs (Feet al., 2017), mosques de la fruita (Peng et al., 2009; Site al., 2011), ratolins (Site al., 2011). ; Xiao et al., 2020) i rates (Kumar i Rizvi, 2017).

És ben sabut que els extractes de te negre contenen principalment dos tipus de fitoquímics, a saber, catequines i teaflavines (TF) (Cameron et al., 2008; Kondo et al., 2019; Li et al., 2013), la darrera de les quals es produeixen a partir de catequines per polifenol oxidasa i peroxidasa endògenes durant el procés d'oxidació en la producció de te negre (Li et al., 2013). Una sèrie d'estudis han identificat el paper antienvelliment de les catequines mitjançant la millora de l'estrès oxidatiu i la inflamació associada a l'edat i la reducció del dany tissular (Cameron et al., 2008; Niu et al., 2013; Peng et al., 2009; Si et al., 2009; .2011; Waaner et al., 2015). Tanmateix, els estudis funcionals sobre les contribucions dels TF a l'envelliment han quedat molt endarrerits dels de les catequines, perquè és difícil extreure quantitats suficients de TF de les fulles de te negre per a estudis mèdics (Takemoto i Takemoto, 2018). Recentment, s'han desenvolupat diversos mètodes biosintètics per a la producció massiva de TF (Takemoto i Takemoto, 2018), cosa que permet explorar els efectes biològics exactes dels TF i els mecanismes reguladors subjacents.

Recentment, cada vegada més conjunts de dades han posat de relleu els papers fonamentals dels intestins en l'envelliment i la modulació de la vida útil (Guo et al., 2014; Jji et al., 2019; Maynard i Weinkove, 2018; Rothenberg i Zhang, 2019; Salazar et al., 2019. ,2018). L'epiteli intestinal, que actua com a barrera selectiva, permet l'absorció de nutrients, ions i aigua i limita el contacte de l'hoste amb entitats nocives, com ara microorganismes, antígens dietètics i toxines ambientals (Capo et al., 2019; Nicholson et al. , 2012; Ryu et al., 2010). Com a teixit de gran rotació en individus, el tracte intestinal proporciona el millor entorn de vida per als microorganismes simbiòtics, incloses condicions anaeròbiques naturals, nutrients abundants i una temperatura i pH adequats.

Figura 1. Les teaflavines prolonguen la vida útil de la Drosophila i milloren la capacitat d'escalada

(A i B) Les mosques de la fruita femenines es van cultivar amb aliments estàndard que es van complementar amb 1 mg/ml o 2, 5 mg/mL de teaflavines (TF) o sense TF com a basal. Les mosques es van transferir a vials nous que contenien nous mitjans cada dos dies, i les mosques mortes han anotat al llarg de la vida adulta, es van analitzar i mostrar les corbes de supervivència (A) i la longevitat mitjana (B) de les mosques femelles.

(Cand D) Les dones w18 van ser alimentades amb aliments estàndard de Drosophila (referit Basal) o amb aliments suplementats amb 1 mg/ml o 2,5 mg/ETF, respectivament. Sis grups independents de mosques a les edats indicades (10 dies, 30 dies, 40 dies i 50 dies, respectivament) es van sotmetre als assajos de cafe (C) i d'alimentació de fluoresceïna (D). valor, formant nínxols ocupats per espècies bacterianes específiques al cos (Bonfini et al., 2016; Buchon et al., 2013; Nicholson et al., 2012). Mentrestant, aquests microorganismes simbiòtics i els seus metabòlits també afecten directament o indirectament el processament dels nutrients; digestió i absorció; balanç energètic; funció immune; desenvolupament i maduració gastrointestinal; i moltes altres activitats fisiològiques importants (Bonfini et al., 2016; Broderick, 2016; Maynard i VVeinkove, 2018; Nicholson et al., 2012). La relació mútuament beneficiosa entre els dos simbionts pot mantenir l'estabilitat i l'equilibri dinàmic del microecosistema intestinal (Bonfini et al., 2016; Brodeerick, 2016; Broderick et al., 2014; Guo et., 2014; May-nard i Weinkove, 2018; Nicholson et al., 2012).

cistanche pot anti-envelliment

Una sèrie d'estudis han demostrat que la resposta immune innata és fonamental per mantenir l'homeòstasi de la microbiota intestinal i es conserva des dels invertebrats fins als vertebrats (Guillouet al., 2016; Guo et al., 2014; Ryu et al., 2006, 2010; Vijay-). Kumar et al., 2010). A Drosophila, dues vies de senyalització principals, és a dir, les vies de Toll i de deficiència immune (Imd), estan implicades en les respostes immunitàries innates (Lu et al., 2020; Myllymakiet al., 2014; Valanne et al., 2011). En particular, la via Drosophila Toll comparteix similituds amb les vies del receptor de la interleucina-1 de mamífers (IL{-1R) i MyD88-depenent del receptor Toll (TLR), mentre que la via Imd és similar. a la via del receptor del factor de necrosi tumoral (TNFR) i a la via TLR dependent de TRIF en mamífers (Imler, 2014; Myllymaki et al., 2014; Valanne et al., 2011). Aquestes dues vies controlen l'expressió de pèptids antimicrobians (AMP) mitjançant l'activació de factors de transcripció NF-KB (Imler, 2014; Myllymaki et al., 2014; Valanne et al., 2011).bioflavonoidesLa via de senyalització Imd normalment s'activa per infecció bacteriana gramnegativa i dóna lloc a l'expressió d'un altre conjunt d'AMP, com Attacin, Cecropin i Diptericin (Kleino i Silverman, 2014; Myllymaki et al., 2014). L'expressió d'aquests AMP requereix el receptor de la proteïna de reconeixement de peptidoglicans (PGRP)-LC a la via Imd i la ruptura depenent del senyal i la translocació nuclear de Relish, un factor de transcripció de la família NF-kB (Kleino i Silverman, 2014; Myllymaki et al., 2014). Un estudi recent va demostrar que la formació d'amiloide és necessària per a l'activació de la via Drosophila Imd després del reconeixement de peptidoglicans bacterians (Kleino et al., 2017). Tanmateix, encara es desconeix en gran mesura si aquest condensat Imd està implicat en altres processos biològics, com ara el manteniment de l'homeòstasi intestinal i la regulació de l'envelliment.

En el present estudi, hem utilitzat mosques de la fruita i ratolins com a models animals per investigar el paper dels TF en el control de la integritat intestinal i l'envelliment. Vam demostrar que els TF retarden la sobreproliferació de les cèl·lules mare intestinals, protegeixen contra la disbiosi del microbioma intestinal i impedeixen l'activació de la via de senyalització Imd, allargant així la vida útil de la Drosophila. Estudis mecànics addicionals van indicar que els TF contribueixen negativament a la senyalització d'Imd poden ser mitjançant el bloqueig de la condensació d'Imd en lloc de la seva ubiqüitinació. A més, vam trobar que els TF són molt efectius per prevenir la colitis induïda per DSS en ratolins. En conjunt, els nostres resultats revelen un paper potencial dels TF en la modulació del comportament de l'Imd, que podria ser el factor clau en les seves contribucions positives a l'homeòstasi intestinal i l'extensió de la vida útil.

RESULTATS

La suplementació dietètica de teaflavines allarga la vida útil de la Drosophila

Per examinar si les teaflavines (TF) afecten l'envelliment i la vida útil a Drosophila, vam criar mosques femelles w'118 amb aliments de cria estàndard que es van complementar amb TF d'1 mg/ml o 2,5 mg/ml i vam realitzar assajos de vida útil tal com es va descriure anteriorment (Ji et al. .,2019). Les mosques alimentades amb una dieta complementada amb un volum igual de dissolvent de TF (H2O) es van considerar controls. Com es mostra a la figura 1A, l'addició a la dieta d'una concentració relativament baixa de TF (1 mg/mL) va allargar lleugerament la vida útil de la mosca de la fruita i una concentració elevada de TF (2, 5 mg/mL) va tenir un efecte significativament positiu en l'extensió de la vida útil. En particular, l'absorció a llarg termini d'eleves concentracions de TF (2, 5 mg/mL) va donar lloc a aproximadament 8 dies d'elevació de la vida mitjana de les mosques femelles (figura 1B), cosa que suggereix un paper beneficiós de TFsin en la regulació de la longevitat a Drosophila. Es van obtenir resultats similars quan vam provar els efectes potencials de TF addicionals sobre la vida útil de les mosques masculines w'*'''8 (figures S1A i S1B).

Figura 2. Les teaflavines eviten la disfunció intestinal d'inici de l'edat i la disbiosi de la microbiota a Drosophila

(A i B) Smurftest va analitzar la pèrdua d'integritat intestinal a les edats de 10 dies, 30 dies, 40 dies i 50 dies de dones adultes de 18 anys. A (A) es van mostrar exemples de no Barrufets i Barrufets. Es van analitzar els percentatges de Barrufet en diferents grups indicats i es van mostrar a (B).

(C) Es van analitzar i mostrar les abundàncies bacterianes guardades per qPCR del gen rRNA 16S en fitxers w18 femenins de diferents grups indicats.

(DF) Es va realitzar la seqüenciació del gen 16S del rRNA bacterià comensal. Es van analitzar i presentar les proporcions de tàxons bacterians (D), un mapa tèrmic dels principals tàxons microbians (F) i l'abundància relativa de Gammaproteobacteria (F).

Figura 2. Continuació

(G i H) Es van disseccionar les tripes de les mosques femelles indicades alimentades amb TF de 2, 5 mg/ml o sense TF com a control als 10 dies i 40 dies d'edat. Les imatges de diapositives de l'intestí mitjà es van capturar mitjançant microscòpia de fluorescència per a senyals GFP (G). L'anàlisi estadística que mostra els percentatges de cèl·lules positives GFP es mostra a (H).

(I) Es van recollir les tripes de les mosques femelles indicades i es van sotmetre a assaigs d'immunotinció utilitzant anticossos contra la histona fosforilada 3 (pH3). A B, C, H i, les dades s'analitzen mitjançant la prova de Student de dues cues i es mostren com a mitjans ± SEM.NS, no significatiu,*p<><0.001. see="" also="" figure="">

Se sap que els ETF tenen un sabor amarg i els aliments amargs solen evitar-se tant pels consumidors, com ara les mosques de la fruita i els mamífers (Yamazaki et al., 2014; Yang et al., 2018). Aleshores vam intentar dilucidar si els TF poden afectar la ingesta d'aliments de Drosophila, perquè estudis anteriors han demostrat que la restricció alimentària condueix a una vida útil allargada tant en vertebrats com en invertebrats (Hudry et al., 2019; Kapahi et al., 2017; Moger-Reischer et al., 2017; ., 2020). Per fer-ho, primer vam realitzar l'assaig de cafeteria, un enfocament àmpliament utilitzat per mesurar directament i amb precisió la velocitat d'alimentació fent ús d'un alimentador capil·lar que conté un medi líquid, tal com es va descriure anteriorment (Ja et al., 2007). Tal com es mostra a les figures 1C i S1C, la suplementació dietètica de TF (1 mg/mL i 2, 5 mg/mL, respectivament) gairebé no va alterar el consum d'aliments de les mosques provades. Per confirmar-ho encara més, vam utilitzar la fluoresceïna com a traçador d'aliments (Rera et al., 2012; Wang et al., 2005) i vam realitzar un assaig d'alimentació natural (Danilov et al., 2015). Com es mostra a les figures 1D i S1D, no vam poder observar cap correlació entre la suplementació de TF i els nivells de ingesta d'aliments. En conjunt, els nostres resultats van suggerir que els papers beneficiosos dels TF per allargar la vida útil poden no ser deguts a la restricció dietètica a Drosophila.

Els TF addicionals són prescindibles per afectar l'homeòstasi energètica de Drosophila

S'ha suggerit que els polifenols del te negre exerceixen un efecte positiu en la prevenció de l'obesitat mitjançant la inhibició de la digestió, l'absorció i la ingesta de lípids i sacàrids, reduint així la ingesta de calories (Cameron et al., 2008). A continuació, vam intentar dilucidar si l'extensió de la vida útil de LDrosophila regulada per TF es deu a alteracions en l'absorció de nutrients i l'emmagatzematge d'energia. Per fer-ho, primer vam examinar els nivells de triacilglicèrid (TAG), un dels metabòlits lipídics més detectats (Tennessen et al., 2014), en mosques femelles al llarg de tota la seva vida, tal com s'ha descrit anteriorment (Fan et al., 2017).comprar cistancheCom es mostra a la figura 1E, el tractament dels TF gairebé no va afectar l'abundància global de TAG en diferents punts d'edat. Quan vam detectar més continguts de glicogen i quantificar els hidrats de carboni circulants (glucosa i trehalosa) mitjançant el kit d'hexoquinasa (Li et al., 2018; Ten-nessen et al., 2014), els resultats van mostrar que no hi havia alteracions òbvies entre mostres amb o sense tractament amb TF (figures 1F-1H). Cal destacar que es van obtenir resultats consistents quan vam examinar fenotips metabòlics que utilitzaven w118 masculí com a models animals (figures S1E-S1H). Col·lectivament, aquestes dades suggereixen que la suplementació dietètica de TF és prescindible per a la regulació de l'homeòstasi dels carbohidrats i l'energia al llarg de la vida útil de Drosophila.

Vam investigar més la cinètica de la senescència natural de Drosophila sota la intervenció de TFs dietètics mitjançant la realització de proves ràpides iteratives de geotaxi negativa (RING) tal com es va descriure anteriorment (Dilliane et al., 2017; Staats et al., 2018). Tal com es mostra a les figures 1l, 1J, S1l i S1J, els índexs d'escalada d'edat (40 dies) w1118 (tant en dones com en homes) en els grups de suplementació de TF es van millorar notablement (un augment de gairebé un 12 per cent en les dones i gairebé un 18 per cent d'elevació en els homes). ) en comparació amb els grups control, cosa que suggereix que els TF milloren potencialment l'escalada i les activitats locomotores de Drosophila.

Les teaflavines eviten les fuites intestinals d'inici de l'edat i la disbiosi de la microbiota

Estudis anteriors han demostrat que les activitats locomotores i la vida útil de la mosca de la fruita estan molt relacionades amb l'estat de salut de l'hoste, com ara el sexe, la dieta, l'edat i el genotip (Caruso et al., 2013; Heintz i Mair, 2014). Recentment, diverses línies d'evidència han demostrat que la preservació de l'homeòstasi de senyalització d'Imd intestinal millora la integritat intestinal evitant la sobreproliferació de les cèl·lules precursores i ISC i retardant la disfunció epitelial intestinal d'inici de l'edat, que al seu torn contribueix positivament a la salut de l'organisme (Clark et al. , 2015; Guo et al., 2014). A Drosophila, una vida útil escurçada està estretament associada amb la disfunció de la barrera epitelial intestinal, i el desenvolupament de la integritat d'aquesta barrera durant l'envelliment dóna lloc a una prolongació de la vida útil (Clark et al., 2015; Guoet al., 2014; Jet al., 2019). Així, hem intentat determinar si els TF alteren la integritat de l'intestí mitjançant l'assaig Smurf, un mètode que s'ha descrit anteriorment (Clark et al., 2015; Rera et al., 2011). Com es mostra a la figura 2A, les mosques de la fruita provades en què els colorants blaus estaven restringits al tracte digestiu es van anomenar no Barrufets (tauler esquerre a la figura 2A). Si s'observessin colorants blaus

Figura 3. Continuació

(EG) Les tripes es van aïllar dels fitxers w1118 femenins alimentats amb TF de 2, 5 mg / ml o sense TF com a basal als 10 dies, 30 dies, 40 dies i 50 dies d'edat, respectivament. L'ARN total es va extreure i es va sotmetre a anàlisis aRT-PCR. Es van analitzar i mostrar els nivells d'expressió d'ARNm de diptericina (F), attacina (F) i cecropina A1 (G). A EG, les dades s'analitzen mitjançant la prova t de Student de dues cues i es mostren com a mitjans ± SEM.NS, no significatius, *p<><><0.001. see="" also="" figure="">

sortint de les entranyes a l'abdomen, els hostes es van comptar com a Barrufet (tauler dret a la figura 2A). D'acord amb les troballes anteriors (Clark et al., 2015), les proporcions de Barrufet van augmentar gradualment durant l'envelliment (figura 2B). Curiosament, les proporcions d'adults Barrufets es van reduir molt en els grups alimentats amb TF en comparació amb els controls coincidents per edat en ambdues dones (del 8,2% al 3,7%, del 19,4% al 15,6% i del 35,4% al 27,1% per als grups). a les edats de 30 dies, 40 dies i 50 dies, respectivament, Figura 2B) i adults masculins (del 2,7% al 0,9%, del 6,9% al 0,9% i del 8,3% al 2,7% als 30 anys). dies, 40 dies i 50 dies, respectivament, figura S2A), que indica que els TF poden prevenir la disfunció de la barrera intestinal en les mosques de la fruita envellides. Cal destacar que vam observar una disminució més gran dels percentatges de Barrufets en els homes (reduït gairebé un 65,8 per cent, 86,9 per cent i un 67,4 per cent a les edats de 30 dies, 40 dies i 50 dies, respectivament) que els d'edat. - femelles igualades (reduïdes gairebé un 54,1 per cent, un 19,5 per cent i un 23,3 per cent a les edats de 30 dies, 40 dies i 50 dies, respectivament), la qual cosa implica que els TF podrien tenir un millor paper a l'hora de reduir les fuites intestinals en mosques masculines.

Estudis anteriors han suggerit que la disfunció de la barrera intestinal que s'inicia amb l'edat sovint es correlaciona amb la disbiosi de la microbiota intestinal (Clark et al., 2015; Guo et al., 2014). Així, vam examinar la composició bacteriana comensal intestinal després de la suplementació de TF. Primer vam utilitzar cebadors universals i vam realitzar experiments quantitatius de PCR per quantificar els nivells del gen 16S rRNA bacterià. Com es mostra a la figura 2C, en talls envellits, la població bacteriana total dels grups d'intervenció de TF va mostrar una reducció sorprenent (gairebé un 45 per cent -55 per cent) en comparació amb els controls, cosa que suggereix que la suplementació amb TF probablement impedeix l'expansió de la microbiota durant l'envelliment. . A continuació, vam realitzar metagenòmica per examinar en detall les alteracions de la comunitat microbiana intestinal causades per la suplementació dietètica amb TF. Tal com es mostra a les figures 2D -2F, la proporció de Gammaproteobacteria, l'expansió dels quals es va trobar que estava estretament associada amb la fallada de la barrera intestinal (Clark et al., 2015), es va reduir òbviament per la suplementació de TF en intestins envellits ( una reducció de gairebé un 7%), el que implica que els TF contribueixen positivament a l'homeòstasi de la microbiota intestinal durant l'envelliment a Drosophila.

Les teaflavines milloren l'homeòstasi proliferativa intestinal a Drosophila

We further examined the intestinal integrity of flies that were treated with or without TFs. First, we employed the widely-used P{Esg-Gal4}/P{Uasp-GFP};{Tub-Gal80*s}strain(referred to as esgts>GFP), en què les cèl·lules mare intestinals (ISC) i les cèl·lules progenitores es van etiquetar amb GFP. Tal com es mostra a les figures 2G i 2H, el nombre de cèl·lules positives per a GFP als grups d'intervenció de TF als 40 dies (es van comptar 20 tripes) va ser molt menor (gairebé el 29,7 per cent) que en els controls coincidents per edat (gairebé el 47,6 per cent i Es van comptar 19 tripes), cosa que suggereix que els TF podrien inhibir la sobreproliferació d'ISC a l'inici de l'edat. A més, vam realitzar experiments d'immunotinció utilitzant anticossos contra Phospho-Histone 3 (pH3), un marcador específic per a cèl·lules mitòtiques dels teixits intestinals. Vam observar menys cèl·lules pH3-positives a l'intestí d'adults envellits amb suplements de TF (el nombre mitjà era de 20, 6) que en els dels controls (el nombre mitjà era de 39, 5, figura 2). En conjunt, els nostres resultats suggereixen que la suplementació dietètica amb TF millora l'homeòstasi proliferativa intestinal i prevé la displàsia de la microbiota d'inici de l'edat, retardant així l'envelliment de la Drosophila.

Les teaflavines modulen negativament els senyals Imd intestinals

Per explorar els mecanismes moleculars subjacents pels quals els TF contribueixen positivament a l'homeòstasi intestinal de Drosophila, vam realitzar anàlisis d'ARN-seq utilitzant mostres intestinals coincidents amb l'edat de dones adultes w1118 tractades amb o sense TF. Les anàlisis de fragments per quilobase per milió (FPKM) van suggerir que els patrons generals d'expressió gènica eren similars entre els dos grups experimentals (figura 3A). Tanmateix, una anàlisi d'expressió diferencial addicional va identificar un total de 229 gens expressats de manera diferencial, dels quals 99 estaven regulats i 126 estaven regulats a la baixa (figura 3B). Curiosament, l'anàlisi d'ontologia gènica d'aquests gens va revelar que la via de resposta immune estava molt alterada per la suplementació dietètica amb TF (figura 3C).

A Drosophila, s'ha demostrat que les vies de senyalització immune innates tenen un paper dominant en la regulació de l'homeòstasi intestinal i la longevitat (Clark et al, 2015; Guo et al, 2014). A continuació, ens vam centrar a examinar els patrons d'expressió dels pèptids antimicrobians (AMP) aigües avall dels senyals immunitaris innats. Com es mostra

Figura 4. Continuació

(D) Les proteïnes Imd purificades es van incubar amb diverses concentracions de TF (50 uM, 100 uM i 200 uM, respectivament) a temperatura ambient durant 5 min. A continuació, les mostres es van sotmetre a una anàlisi de l'espectre d'emissió de fluorescència mitjançant les longituds d'ona indicades (excitació a 430 nm, emissió de 450 nm a 550 nm amb una amplada de ranura de 5 nm). Es va utilitzar una mostra sense TF com a control de referència.

（E and F）Lysates of guts from NP11>Les mosques Myc-Imd es van preparar i incubar amb TF (100 μM) a temperatura ambient durant 30 min. Es van realitzar assajos SDD-AGE (panel superior en E) i SDS-PAGE (panel inferior en E) per analitzar els agregats de proteïnes Imd. La tubulina es va utilitzar com a control de càrrega.cistanchEs va realitzar una anàlisi de densitometria per quantificar els condensats d'Imd en diferents mostres, i els resultats es van mostrar a (F). (G) Un cromatograma representatiu de la mostra de TF.

(H i I) Les proteïnes Flag-Imd purificades es van incubar amb TFs, TF1, TF2a, TF2b o TF3 (100 μM per a cada mostra) o amb un volum igual de tampó (control) a temperatura ambient durant 30 min tal com s'indica. A continuació, les mostres es van sotmetre a assajos SDD-AGE (panel superior en H) i SDS-PAGE (panel inferior en H) per determinar els patrons d'agregació d'Imd. Es va realitzar una anàlisi de densitometria per quantificar els condensats d'Imd en diferents mostres i es va mostrar a (). A C, F i I, les dades s'analitzen mitjançant la prova de Student de dues cues i es mostren com a mitjanes ± SEM.***p< 0.001.="" see="" also="" figure="">

a la figura 3D, gens AMP governats per la via de la deficiència immune (Imd), incloent diptericina A (DptA), dip-tericina B (DptB), attacina A (AttA), cecropina A1 (CecA1), cecropina A2 (CecA2) i cecropin C (Cece), es va reduir significativament (en un 39,4 per cent, 72,3 per cent, 10,5 per cent, 86,5 per cent, 99,8 per cent i 36,1 per cent, respectivament) en els grups tractats amb TF en comparació amb els grups control. Per confirmar encara més els resultats obtinguts de l'anàlisi d'ARN-seq, vam dur a terme una reacció quantitativa en cadena de transcripció inversa-polimerasa (gRT-PCR) per quantificar els nivells d'expressió relativa dels gens AMP relacionats amb Imd en mostres d'intestí de Drosophila obtingudes en quatre punts d'edat diferents. inclosos 10 dies, 30 dies, 40 dies i 50 dies. Com es mostra a les figures 3E-3G, els nivells d'expressió d'ARNm de certs gens, com ara la diptericina, l'attacina i la cecropina A1, es van reduir significativament (en gairebé un 35,9 per cent -66,6 per cent) en TFs tractats tripes envellides. Col·lectivament, les nostres dades van revelar que els TF potencialment van antagonitzar l'activació de la via de senyalització Imd a les cèl·lules intestinals de Drosophila durant l'envelliment.

Les teaflavines són prescindibles per a la regulació transcripcional de la via Imd o la ubiqüitinació d'Imd

Vam intentar examinar l'associació entre TF i Imd i vam realitzar l'assaig de ressonància plasmònica superficial (SPR) tal com es va descriure anteriorment (Lan et al., 2020). Com es mostra a la figura 4A. Els TF van mostrar una afinitat d'unió moderada amb la proteïna Imd purificada a una constant Kp estimada de 8,078 uM. Aleshores tendim a determinar com els TF controlen la via de senyalització de l'Imd intestinal. A partir dels resultats de l'anàlisi del transcriptoma de les dades d'ARN-seq, vam trobar que els nivells d'expressió dels factors reguladors clau de la via de senyalització Imd, com ara PGRP-LC, Imd i Relish, no es van alterar amb prou feines pel tractament amb TF (figura S3A). ). A més, vam recollir mostres intestinals de mosques que van ser sotmeses a suplements dietètics amb o sense TF a diverses edats i vam realitzar experiments de qRT-PCR per detectar específicament els patrons d'expressió d'aquests gens. Tal com es mostra a la figura S3B, els nivells d'ARNm de certs gens, incloent-hi effete, faded, tak1, pgrp-Ica, uev1a, bendless, relish, imd, pgrp-sc2, tab2, ird5 Kenny i diap2, eren similars entre els grups de control. i grups d'intervenció de TF, cosa que suggereix que els TF no estan implicats en la regulació dels senyals Imd a nivell transcripcional.

A continuació, vam examinar els perfils d'ubiquitinació d'Imd perquè estudis anteriors han suggerit que la ubiguitinació d'Imd és essencial per a la transducció del senyal aigües avall a la via Imd (Myllymaki et al., 2014; Zhou et al., 2005). Primer vam realitzar un assaig de canvi d'E1 in vitro i vam trobar que el tractament amb TF no té cap influència aparent en les reaccions enzimàtiques d'E1 i ubiquitina per formar E1/Ub conjugat (figura S4A). A més, vam transfectar cèl·lules de Drosophila S2 amb plasmidis que expressaven Imd etiquetats amb Flag juntament amb Ub etiquetats amb HA i després vam tractar les cèl·lules amb o sense TF. Altres assajos d'ubiqüitinació van suggerir que la suplementació de TF amb prou feines va afectar els nivells d'Imd ubiquitinada a les cèl·lules cultivades (figures S4B i S4C). Per determinar les relacions entre els TF i la ubiqüitinació d'Imd in vivo, hem utilitzat la mosca transgènica P {NP1-Gal4}/P{Uasp-Myc-Imd}; P{Tub-Gal80*} (anomenada NP1 * s > Myc-Imd), en què una proteïna Imd marcada amb Myc es va expressar molt a les cèl·lules intestinals (figura S4D). Els nostres experiments d'ubiqüitinació van demostrar que la suplementació dietètica amb TF era prescindible per modular la ubiqüitinació d'Imd als teixits intestinals (figures S4D i S4E). En conjunt, els nostres resultats van indicar que els TF governen negativament els senyals Imd de Drosophila al no afectar el patró d'ubiqüitinació d'Imd.

Les teaflavines impedeixen el muntatge de condensats Imd

Un estudi recent va suggerir que l'agregació d'Imd és essencial per a l'activació de gens aigües avall a la via Imd (Kleino et al., 2017). Aleshores vam intentar examinar si els TF regulen el procés de

Figura 5. Continuació

(F i G) Les femelles w18 (anomenades imd plus / plus), imd' heterozigots i homozigots mutants (conegudes com a imd plus /- i imd-/-, respectivament) es van criar aliments estàndard de Drosophila (anomenats Basal) o suplements dietètics amb 2, 5 mg/mL (conegut com a TF) i després es van sotmetre a un assaig de vida útil Es van analitzar i mostrar la corba de supervivència (F) i la longevitat mitjana (G).

A i F, es va utilitzar el test Log Rank per a l'anàlisi estadística. A BE, i, es va utilitzar la prova t de Student de dues cues per a l'anàlisi estadística, i les dades són sh com a mitjans ± SEM. NS, no significatiu, *p<0.05, **p="" <="" 0.01,=""><0.001. see="" also="" figure="">

Imd formació d'agregats. Primer, vam purificar les proteïnes Imd marcades amb Myc de cèl·lules S2 cultivades i vam incubar les proteïnes amb diferents concentracions de TF (figura 4B). Curiosament, vam trobar que els TF van impedir notablement l'agregació d'Imd (reduïda en un 81, 7 per cent -89, 7 per cent, figures 4B i 4C), tal com suggereixen els nostres assajos d'electroforesi en gel d'agarosa semidenaturant (SDD-AGE). Per confirmar aquesta troballa, vam realitzar assajos d'unió de tioflavina-T i vam obtenir resultats consistents (figura 4D). Finalment, vam plantejar mosques transgèniques NP1ts> Myc-Imd que van ser sotmeses a suplements dietètics amb o sense TF i vam recollir mostres intestinals d'adults grans. Els experiments SDD-AGE van suggerir que l'agregació d'Imd estava molt regulada a la baixa pels TF a les cèl·lules intestinals (disminuït un 16,7 per cent -22 per cent, figures 4E i 4F).

Per determinar com els TF contribueixen a controlar el conjunt de condensats Imd, vam sotmetre els TF a HPLCanal-ysis i vam trobar que contenien principalment quatre tipus de monòmers (figura 4G), és a dir, teaflavina (TF1), teaflavina 3-O-gallat ( TF2a), theaflavin 3'-O-gallate (TF2b) i theaflavin 3,3'-di-O-gallate (TF3), que eren coherents amb els informes anteriors (Li et al., 2013; Takemoto i Takemoto, 2018) . A continuació, vam incubar cadascuna d'aquestes substàncies químiques amb Imdprotein purificada i vam realitzar experiments SDD-AGE. Com es mostra a les figures 4H i 4l, el tractament de tots aquests monòmers TF va donar lloc a una reducció marcada (en un 59,5 per cent, 60,9 per cent, 58,4 per cent, 58,2 per cent. i 55,8 per cent per a TF, TF1, TF2a, TF2b i TF3, respectivament) els nivells agregats Imd. Col·lectivament, els nostres resultats van suggerir que els TF regulen negativament la via de senyalització de Drosophila Imd probablement controlant el comportament dels condensats d'Imd.

Les teaflavines allargan la vida útil de la Drosophila de manera dependent de l'Imd

To examine whether TFs prolong Drosophila lifespan depending on their regulatory role in Imd, we specifically knocked down Imd in gut tissues using the transgenic flies P{NP1-gal4)PITub-gal80*}/P{Uasp-imd-IR(KK)} (referred to as Imd RNAi). As shown in Figures 5A and 5B, dietary supplementation of TFs extended the lifespan of controls (elevation of nearly 7.2 days in the mean lifespan), whereas prevention of Imd expression in guts apparently reversed the lifespan extension caused by TFs. Consistent results were obtained when we utilized male Imd RNAi and control flies to perform lifespan assays (Figures S5A and S5B). Further qRT-PCR assays showed that the mRNA expression levels of AMP genes at ages of 10 days, 30 days, 40 days, and 50 days, including diptericin, attacin, and cecropin A1.hardly changed in the gut tissues of Imd RNAi flies(Figures 5C-5E), whereas additional TFs caused reductions of 31%-72.3% in mRNA abundances of these genes in samples from control groups. To confirm these results from Imd RNAi flies, we first performed lifespan assays using w18(control, referred to as imd+/+), imd' heterozygous (referred to as imd+/-), and homozygous(referred as imd-/-)mutant flies. We found that TFs addition extended lifespan and increased mean life longevity of imd+/-flies (elevation of nearly 6.2 days, Figures 5F and 5G). However, this lifespan extension effect by TFs was almost abolished in imd-/-flies (Figures 5F and 5G). Next, we performed lifespan assays utilizing Relish RNAi(NP1's>Relish RNAi and control(NP1ts>més )mosques. perquè Relish és el factor de transcripció clau responsable de les expressions gèniques AMP aigües avall d'Imd (Myllymaki et al., 2014). Tal com es mostra a Fiqures S5C i S5D. L'addició dietètica de TF va allargar notablement la longevitat de les mosques de control, i aquesta prolongació de la vida útil es va prevenir significativament a les mosques Relish RNAi. Col·lectivament, les nostres dades van indicar que la suplementació dietètica de TF contribueix positivament a la vida útil de Drosophila probablement depenent dels senyals intestinals Imd.

Per tal de veure si l'extensió de la vida útil de TFstill es produeix en un fons axènic, vam realitzar assajos de vida útil utilitzant femelles w1118 en condicions axèniques. Tal com es mostra a les figures S5E i S5F, l'addició de diferents concentracions de TF (1 mg/mL i 2, 5 mg/mL) gairebé no va afectar les proporcions de mortalitat i longevitat mitjana de la vida en adults w18. Com que les condicions de cria axèniques poden prevenir en gran mesura una microbiota abundant, restringint així els senyals Imd en els talls (Clarke al., 2015), les nostres dades suggereixen que els TF prolonguen la vida útil de Drosophila poden ser mitjançant la modulació dels senyals immunes innats regulats per la microbiota intestinal.

Figura 6. Les teaflavines alleugen la colitis induïda per DSS en ratolins CD-1

(A) El tractament amb TF no va afectar el consum d'aigua en diversos grups de ratolins CD-1.

(BD) L'administració per sonda de diverses concentracions de TF (1 mg/mL, 2,5 mg/mL i 5 mg/mL, respectivament) va millorar l'escurçament del còlon i l'ampliació de la melsa causada per DSS en ratolins CD-1. Es van mostrar imatges representatives (B) i anàlisis estadístiques del còlon (C) i la melsa (D). (E) L'administració de diverses concentracions de TF (1 mg/ml, 2, 5 mg/ml i 5 mg/ml, respectivament) va evitar la fuita intestinal induïda per DSS en ratolins CD-1. (F i G) Es van recollir els còlons dels grups indicats de ratolins. L'ARN total es va extreure i es va sotmetre a assaigs de qRT-PCR per detectar els nivells d'expressió d'ARNm de TNFa (F) i IL-6 (G).

(HL) Els còlons de diversos grups de ratolins es van recollir longitudinalment i es van sotmetre a assajos de tinció amb HE. Les mostres es van examinar per microscòpia i es van obtenir i mostrar imatges representatives de les mostres indicades (HL). Barres d'escala, 40 μm. (M-Q') Imatges SEM que mostren els microtricomes de còlons de diferents mostres indicades. Barres d'escala, 50 um (MQ) i 4 um (M'-Q').

A CG, les dades s'analitzen mitjançant la prova de Student de dues cues i es mostren com a mitjans ± SEM.NS, no significatiu, *p<><><0.001. see="" also="" figure="">

Les teaflavines alleugen la colitis induïda per DSS en ratolins CD-1

Per investigar més el paper potencial dels TF en el manteniment de l'homeòstasi intestinal en mamífers, es van utilitzar ratolins CD-1 per induir colitis per sulfat de dextran sòdic (DSS). Als ratolins se'ls va administrar intragàstricament diferents concentracions de TF (1 g/L, 2,5 g/L o 5 a/L) o aigua com a control durant quatre setmanes, seguit d'un tractament amb 2% de DSS en aigua potable durant 7 dies. Per veure si els TF afecten la quantitat de beguda de DSS en diferents grups de ratolins, vam controlar la beguda dels ratolins cada dia. Tal com es mostra a Fiqure6A, el tractament amb TF és prescindible per afectar el consum de begudes en ratolins amb colitis induïda per DSS, els ratolins tractats amb DSS presentaven síndrome de colitis amb diarrea i / o hematoquèzia, que es van prevenir mitjançant el tractament amb TF depenent de la dosi (figures S6A-S6E).cistanche AustràliaA més, la intervenció amb TF va rescatar la reducció de la longitud del còlon causada pel DSS i va millorar l'ampliació de la melsa (figures 6B-6D).

Després vam utilitzar dextran-4000-FITC (FITC-DX) per examinar la funció de barrera intestinal d'aquests ratolins. Com es mostra a la figura 6E, els ratolins dels grups tractats amb DSS van mostrar una alta concentració de FITC-DX a les mostres de sang, cosa que indica una fuita intestinal en aquests animals. Tanmateix, la intervenció amb TF va impedir significativament el transport de FITC-DX des dels òrgans digestius a la sistema circulatori (reduït en un 56,1 per cent -77,5 per cent, figura 6E). En particular, l'administració de TF no va alterar la permeabilitat intestinal dels ratolins en condicions normals (figura S6F). Com que la inflamació té un paper fonamental en el desenvolupament de la colitis del model de ratolí, vam realitzar experiments amb qRT-PCR, demostrant que el tractament amb TF va reduir significativament les expressions IL-6 i TNF als intestins dels ratolins tractats amb DSS (figures 6F i 6G).

Per analitzar més els canvis patològics al còlon, vam realitzar assajos de tinció d'hematoxilina-eosina (HE). Tal com es mostra a les figures 6H-6L i S6G-S6J, el dany epitelial greu induït per DSS es va millorar notablement amb el tractament amb TF de manera dependent de la dosi. Les imatges de microscòpia electrònica d'escaneig d'aquestes mostres intestinals van proporcionar resultats consistents (figures 6M-6Q' i S6K-S6N'). En conjunt, els nostres resultats van indicar que els TF tenen un paper beneficiós en la protecció de la funció de barrera intestinal tant en insectes com en mamífers.

DISCUSSIÓ

En aquest estudi, hem investigat les funcions fisiològiques dels TF en la modulació de l'homeòstasi i la longevitat intestinals i els mecanismes moleculars subjacents. Hem demostrat que la suplementació dietètica amb TF contribueix positivament a la prevenció de la disbiosi d'inici de l'edat de la microbiota intestinal i al retard de la disfunció epitelial intestinal, allargant així la vida útil de Drosophila. Els nostres estudis mecanicistes in vitro i in vivo van revelar que els TF probablement tenen un paper negatiu en el control de la via de senyalització d'Imd bloquejant la coalescència d'Imd. A més, vam trobar que la colitis induïda per DSS es pot alleujar de manera eficient mitjançant la suplementació de TF en ratolins CD-1. Els nostres resultats donen suport a la idea que els TF contribueixen avantatjosament a l'homeòstasi intestinal tant en invertebrats com en vertebrats.

La suplementació dietètica amb teaflavines allarga la vida útil de la Drosophila

El consum de te és popular a tot el món i només ocupa el segon lloc després del consum d'aigua (Rothenberg i Zhang, 2019). Nombrosos estudis s'han centrat en les funcions fisiològiques sovint mitjançant enfocaments experimentals i clínics (Cameron et al., 2008; Niu et al., 2013; Peng et al., 2009; Rothenberg i Zhang.2019; Spindleret al., 2013; Takemoto). i Takemoto, 2018; Unno et al., 2020; Zhou et al., 2020. S'ha demostrat àmpliament que el te beneficia la salut reduint els nivells de lípids i mitjançant efectes contra l'obesitat, i els principals compostos funcionals del te són les catequines, especialment galat d'epigalocatequina (EGCG) (Abbas i Wink, 2009; Modernelli et al., 2015; Niu et al., 2013; Wagner et al., 2015; Xiong et al., 2018). Estudis anteriors també han indicat que el te verd i El te negre pot augmentar la salut i la vida útil de les mosques de la fruita (Site al., 2011; Wagner et al., 2015), cucs (Fei et al., 2017; Xiong et al., 2018) i rates (Imran et al., 2018) .,2018; Niu et al.2013) i el principal mecanisme regulador és la prevenció efectiva de l'estrès oxidatiu mitjançant l'EGCG mitjançant la modulació de senyals ROS.avantatges de cistanche,Tanmateix, encara es desconeix en gran mesura si els TF, com a compostos "daurats" característics del te negre, tenen un paper en la regulació de l'envelliment i la vida útil. Aquest estudi proporciona proves convincents que indiquen que la intervenció dels TF és prescindible per afectar la ingesta d'aliments, i la captació a llarg termini de TF a través de la dieta allarga significativament la vida útil tant en mosques de la fruita masculines com femelles. Aquestes troballes proporcionen pautes per a estudis posteriors sobre les funcions dels TF en la longevitat dels mamífers.

Les teaflavines milloren la disbiosi de la microbiota d'inici de l'edat i afavoreixen l'homeòstasi intestinal El desequilibri progressiu de l'homeòstasi proliferativa i la capacitat regenerativa és un segell distintiu de les malalties d'envelliment i d'inici de l'edat (Clark et al., 2015; Heintz i Mair, 2014; Maynard i Weinkove, Rera, 2018; et al. 2012). La inflamació crònica s'associa amb la pèrdua de l'homeòstasi i l'augment de la incidència de càncer en organismes envellits (Bartke et al., 2019; Kapahi et al., 2017; Xiao et al., 2020). Això és especialment significatiu en epiteli de barrera com l'epiteli intestinal (Guo et al., 2014; Maynard i Weinkove, 2018). Amb un model per al desenvolupament de la displàsia relacionada amb l'edat a l'intestí envellit, vam demostrar que la millora de les interaccions hoste-comensal en l'epiteli de la barrera de l'envelliment podria promoure la salut i la vida útil. Hem utilitzat una sèrie d'enfocaments no invasius per analitzar la funció intestinal i la dinàmica de la microbiota durant l'envelliment. En primer lloc, l'assaig Smurf va indicar un paper positiu dels TF en la regulació de la disfunció de la barrera epitelial durant l'envelliment. Aleshores, l'assaig d'immunotinció amb diverses mosques transgèniques va revelar que els TF retardaven la sobreproliferació d'ISC i la rotació de cèl·lules diferenciades. Finalment, la seqüenciació del microbioma va suggerir que els TF regulen a la baixa l'expansió d'inici de l'edat de la microflora comensal intestinal. Aquests resultats van indicar fortament que els TF tenen un paper clau en el retard del procés d'envelliment de l'hoste mantenint l'homeòstasi intestinal.

Les teaflavines alleugen les respostes immunes excessives a l'intestí mitjançant la regulació negativa de la senyalització Imd

S'ha suggerit que s'ha de mantenir el delicat equilibri entre la funció immune intestinal i la microbiota per garantir l'homeòstasi a llarg termini de l'epiteli de barrera (Guo et al., 2014; Maynard i Weinkove, 2018). Estudis anteriors també han demostrat que la inflamació excessiva crònica a l'intestí s'associa amb una disfunció relacionada amb l'edat en l'epiteli de barrera i és un segell distintiu de l'envelliment (Clark et al., 2015; Guo et al., 2014; Ji et al., 2019) . Així, mantenir una població comensal sana mitjançant la preservació de l'homeòstasi immune innata en aquests epitelis és un enfocament prometedor per promoure la salut i la longevitat (Bonfini et al., 2016; Broderick, 2016; Clark et al., 2015). Explorar els mecanismes moleculars mitjançant quins TF retarden l'envelliment, vam realitzar anàlisis d'ARN-seq mitjançant intestins dissecats amb o sense tractament amb TF. Les nostres dades van suggerir que el grup de gens altament expressats als intestins de les mosques de la fruita de control en comparació amb el dels animals tractats amb TF es va enriquir amb gens classificats com a gens de "resposta immune". Més anàlisis bioinformàtiques i assajos de get-PCR van revelar que l'expressió de gens AMP relacionats amb Imd es va inhibir dràsticament per l'addició de TF a la dieta. Els resultats dels experiments de ratolí CD-1 que utilitzen DSS per induir respostes immunes anormals als intestins van confirmar encara més la idea que els TF funcionen com a protectors contra la inflamació intestinal.

Les teaflavines suprimeixen els senyals determinant el conjunt amiloide d'Imd

Com regulen negativament els TF la via de senyalització Imd? A partir dels resultats de l'anàlisi del transcriptoma, vam trobar que els TF són prescindibles per a la regulació transcripcional dels factors clau de la via de senyalització Imd. D'interès, vam observar l'aparent afinitat d'unió dels TF amb la proteïna Imd purificada mitjançant un assaig SPR, cosa que va suggerir una probabilitat que els TF poguessin tenir un paper en el control del comportament de la proteïna Imd o el seu procés de modificació post-traduccional. Estudis anteriors han posat de relleu un paper fonamental de la ubiqüitinació en la transducció del senyal Imd (Kleino i Silverman, 2014; Myllymaki et al., 2014) i la prevenció de la ubiqüitinació d'Imd dóna com a resultat un tancament profund de la senyalització Imd (Myllymaki et al., 2014; Thevenon). et al., 2009). Tanmateix, els nostres assajos d'ubiquitinació in vitro i in vivo van demostrar que els TF amb prou feines afecten el patró d'ubiquitinació d'Imd. Un estudi recent ha demostrat que la formació d'amiloide és necessària per a l'activació de la via Drosophila Imd després del reconeixement de peptidoglicans bacterians (Kleino et al., 2017). Curiosament, els nostres assajos SDD-AGE i ThTbinding van suggerir que els TF impedeixen la coalescència d'Imd. La prevenció de l'agregació d'Imd mitjançant la derrocament o la mutació d'Imd a les cèl·lules intestinals aparentment va revertir els efectes beneficiosos dels TF sobre l'extensió de la vida útil. Per confirmar encara més la nostra troballa, seria interessant examinar si els TF ja no són més funcionals per allargar la vida útil dels volants de fruites quan el motiu críptic conservat RHIM (cRHIM, aminoàcids del 118 al 121h) de Imd es destrueix específicament, basat en la constatació que el crim a l'Imd és essencial per a la seva agregació i formació d'amiloide (Kleino et al., 2017). No obstant això, el nostre estudi destaca un paper fonamental dels TF en el control de l'homeòstasi intestinal i el procés d'envelliment, potser mitjançant la modulació de la coalescència Imd. Els estudis futurs haurien de centrar-se a explorar quins residus o regions d'Imd estan units per TF i com aquesta unió provoca la prevenció de la condensació d'Imd. A més, les nostres troballes al sistema de mamífers van indicar que els TF podrien protegir eficaçment el còlon contra la inflamació causada pel DSS químic verinós exògen, cosa que suggereix un paper regulador conservat dels TF en el manteniment de l'homeòstasi intestinal. Val la pena investigar si els TF tenen un paper en el govern de l'assemblatge de proteïnes en teixits de mamífers.

Aquest article s'ha extret de zhongwenxie@ahau.edu.cn