per a més informació:ali.ma@wecistanche.com

Identificació i verificació de la proteïna 1 d'adhesió cel·lular vascular com a hubgene relacionat amb el sistema immunitari associat a la lesió tubulointersticial en la malaltia renal diabètica

Yan Jia, et al

RESUM

Malaltia renal diabètica(DKD) és la principal causa demalaltia renal crònica(ERC) i malaltia renal terminal (ESRD), però la patogènesi no s'entén completament. La lesió tubulointersticial té un paper crític en el desenvolupament i la progressió de la DKD(malaltia renal diabètica). El present estudi pretenia investigar el perfil de la infiltració de cèl·lules immunitàries tubulointersticials i revelar els mecanismes subjacents entre la lesió de les cèl·lules tubulars i la inflamació intersticial en DKD.(malaltia renal diabètica)utilitzant estratègies bioinformàtiques. En primer lloc, l'anàlisi xCell va identificar cèl·lules immunitàries que mostraven canvis significatius en el DKD(malaltia renal diabètica)tubulointerstitium, incloent cèl·lules CD4 més T regulades, cèl·lules Th2, cèl·lules CD8 més T, macròfags M1, cèl·lules dendrítiques activades (DC) i DC convencionals, així com Tregs regulats a la baixa. En segon lloc, es va identificar la piroptosi com la forma principal de mort cel·lular en comparació amb altres formes de mort cel·lular programada. La proteïna 1 d'adhesió de cèl·lules vasculars (VCAM1) es va identificar com el gen central de millor classificació. L'anàlisi de correlació va mostrar que VCAM1 estava significativament correlacionat positivament amb la piroptosi i les cèl·lules immunitàries infiltrades al tubulointerstici. La regulació de VCAM1 al tubulointerstici DKD es va verificar encara més a la cohort del Banc d'ADNc renal europeu i es va observar que es correlacionava negativament amb la taxa de filtració glomerular (GFR). El nostre estudi in vitro va validar l'augment de l'expressió de VCAM1 a les cèl·lules HK-2 en condicions de diabetis, i la inhibició de la piroptosi per part del disulfiram va disminuir l'expressió de VCAM1, l'alliberament de citocines inflamatòries i la fibrosi. En conclusió, el nostre estudi va identificar l'expressió de VCAM1 regulada a les cèl·lules tubulars renals, que podrien interactuar amb cèl·lules immunitàries infiltrades, promovent així la fibrosi. El fàrmac disulfiram aprovat per la FDA podria millorar la fibrosi en DKD(malaltia renal diabètica)dirigint-se a la piroptosi tubular i l'expressió de VCAM1.

PARAULES CLAU:DKD; tubulointerstici; cèl·lules immunitàries; piroptosi; VCAM1; disulfiram

Cistanche pot tractarMalaltia renal diabètica

Feu clic a Cistanche per a malaltia renal

Introducció

Malaltia renal diabètica(DKD), una de les complicacions comunes de la diabetis, és la principal causa de malaltia renal crònica (ERC) i malaltia renal en fase terminal (ESRD) en molts països desenvolupats i en desenvolupament [1,2]. Segons un informe de la Xina Kidney Disease Network (CK NET), DKD(malaltia renal diabètica)representa el 26,70 per cent de tots els casos d'ERC i imposa una gran càrrega mèdica i econòmica [2]. La patogènesi de la DKD és complexa i implica multitud de vies diferents. Aclarir les característiques patològiques i la patogènesi de la DKD ajudarà a millorar la gestió clínica i identificar noves dianes terapèutiques.

Tot i que el dany glomerular és la principal característica patològica de la DKD(malaltia renal diabètica), l'evidència creixent ha revelat recentment que la patologia tubulointersticial [3,4], com l'atròfia tubular, la fibrosi intersticial i les cèl·lules immunitàries intersticials infiltrades, té un paper crític en el desenvolupament i la progressió de la DKD.(malaltia renal diabètica)[5–7]. L'anàlisi bioinformàtica representa un mètode eficaç per processar grans quantitats de dades en un temps extremadament curt i proporciona informació valuosa sobre la malaltia. Tanmateix, els estudis bioinformàtics que investiguen l'expressió gènica tubulointersticial i la infiltració de cèl·lules immunitàries en DKD són relativament rars.

L'objectiu de l'estudi era descriure les característiques de la DKD(malaltia renal diabètica)infiltració de cèl·lules immunitàries tubulointersticials i identificar alguns gens immunològics i inflamatoris clau per proporcionar noves idees sobre la patogènesi i la teràpia de la DKD. Primer, un conjunt de dades de microarrays tubulointersticials de DKD(malaltia renal diabètica)es va descarregar de la base de dades Gene Expression Omnibus (GEO). Utilitzant xCell [8], una eina basada en web que realitza una anàlisi d'enriquiment de tipus cel·lular de dades d'expressió gènica per a 64 tipus de cèl·lules immunes i estromals, primer vam investigar les diferències en la infiltració de cèl·lules immunitàries entre els teixits renals d'individus amb DKD.(malaltia renal diabètica)i controls normals. En segon lloc, es va examinar una llista de gens expressats de manera diferencial (DEG) relacionats amb el sistema immunitari, entre els quals el gen millor classificat, la proteïna d'adhesió de cèl·lules vasculars 1 (VCAM1), es va identificar com a gen central immune en DKD.(malaltia renal diabètica). A continuació, es van obtenir conjunts de gens associats a diverses formes de mort cel·lular a partir de GeneCards i es va avaluar la piroptosi com a forma principal de mort cel·lular mitjançant anàlisis de variació de conjunt de gens (GSVA) ​​i anàlisi d'enriquiment de conjunt de gens (GSEA). A més, una anàlisi de correlació va demostrar que VCAM1 es va correlacionar positivament amb la infiltració de cèl·lules immunitàries tubulointersticials i la piroptosi. L'expressió regulada de VCAM1 al tubulointerstici DKD es va verificar més a la cohort del Banc Europeu d'ADNc renal (ERCB) i es va observar que es correlacionava negativament amb la funció renal en pacients amb DKD. Un estudi in vitro va validar l'augment de l'expressió de VCAM1 en cèl·lules HK-2 cultivades en condicions de diabetis, i la inhibició de la piroptosi pel fàrmac disulfiram aprovat per la FDA va disminuir l'expressió de VCAM1, l'alliberament de citocines inflamatòries i la fibrosi. Per tant, la piroptosi tubular i l'expressió VCAM1 regulada poden ser objectius per a la immunoteràpia de DKD.

Mètodes

Dades de microarrays

El conjunt de dades d'expressió gènica humana GSE30529 es va descarregar del National Center for Biotechnology Information (NCBI) Gene Expression Omnibus (GEO, base de dades. GSE30529 (GPL571 [HG U133A_2] Affymetrix Human Genome U133A 2.0 Array) ) constava de 10 DKD(malaltia renal diabètica)mostres de túbuls i 12 mostres de control

Tractament de dades

Les dades en brut del conjunt de dades GSE30529 es van descarregar i processar mitjançant el paquet Limma i el paquet Oligo, respectivament [9,10]. El processament de dades va incloure la correcció de fons, la normalització i el càlcul d'expressions. Quan es van assignar diverses sondes a un símbol gènic, es va calcular el nivell d'expressió mitjà de les sondes i es va considerar com el nivell d'expressió gènica d'aquest gen. Es van eliminar les sondes que no es van mapar als gens.

Cistanche pot tractarMalaltia renal diabètica

Anàlisi de cèl·lules immunitàries i estromals

Hem aplicat un nou mètode basat en la signatura gènica, xCell [8], per estimar la puntuació d'enriquiment del tipus cel·lular i determinar el perfil de les cèl·lules immunitàries infiltrades al tubulointerstici de pacients amb DKD.(malaltia renal diabètica). xCell és un mètode per a l'anàlisi d'enriquiment de tipus cel·lular mitjançant l'anàlisi d'enriquiment de conjunt de gens d'una sola mostra (ssGSEA) que calcula les puntuacions d'enriquiment de 64 tipus de cèl·lules, inclosos 34 tipus de cèl·lules immunitàries, 30 tipus de cèl·lules estromals i altres cèl·lules. Supera àmpliament altres anàlisis in silico (inclòs CIBERSORT) en abastar més tipus de cèl·lules immunitàries i emprar una tècnica de compensació de desbordament per reduir les dependències entre tipus cel·lulars estretament relacionats. Els 34 tipus de cèl·lules immunitàries es van classificar en nou grups, incloent subpoblacions de cèl·lules CD4 més T, subpoblacions de cèl·lules CD8 més T, cèl·lules T gamma delta (cèl·lules T δ), cèl·lules NK, cèl·lules NKT, subpoblacions de cèl·lules B, subpoblacions de monòcits/macròfags, subpoblacions de cèl·lules dendrítiques (DC) i subpoblacions de granulòcits.

Anàlisis d'enriquiment del conjunt de gens (GSEA) i anàlisis de variació del conjunt de gens (GSVA)

Utilitzant els conjunts de gens distintius com a conjunt de gens de referència, vam realitzar anàlisis de variació del conjunt de gens (GSVA) ​​entre DKD(malaltia renal diabètica) and control tissues using the GSVA Bioconductor package [11]. The thresholds were set to enrichment score change > 1.0, p-value < 0.05 and t value >2. Es van identificar tant vies regulades a l'alça com a baixes. GSEA es va realitzar amb l'aplicació d'escriptori GSEA [12] i una taxa de descoberta falsa (FDR)<0.25 and="" p-value=""><0.05 were="" set="" as="" the="">

Construcció de conjunts de gens que representen diverses formes de mort cel·lular i anàlisi d'enriquiment

Els conjunts de gens que representen diverses formes de mort cel·lular es van construir cercant les paraules clau "piroptosi", "necrosi", "necroptosi", "apoptosi", "ferroptosi" i "autofàgia" a la base de dades de GeneCards (https://www.genecards). .org/). Es van eliminar els gens que no codificaven proteïnes. Els conjunts de gens es mostren a la taula S2. A continuació, es va realitzar el conjunt de gens GSEA mitjançant l'aplicació d'escriptori GSEA per avaluar la forma de mort cel·lular al tubulointerstici. Hem realitzat les anàlisis de correlació de Pearson per explorar la relació entre les vies de mort cel·lular fonamentals i les cèl·lules immunitàries infiltrades al tubulointerstici.

Anàlisi de DEG i cribratge de gens hub immune

DEG entre pacients amb DKD(malaltia renal diabètica)i es van identificar controls saludables mitjançant el paquet "Limma" [13] al programari R. Un valor P ajustat<0.05 and="" log="" fold="" change="" (fc)="" ≥="" 1="" were="" set="" as="" the="" thresholds.="" a="" list="" of="" 1793="" immune-related="" genes="" was="" down-loaded="" from="" immport="" shared="" data="" (https://www.="" immport.org/shared/genelists),="" and="" shared="" genes="" from="" the="" two="" datasets="" (degs="" and="" immunerelevant="" gene="" list)="" were="" determined="" by="" constructing="" a="" venn="" diagram="" to="" identify="" immune-related="" hub="" genes.="" an="" analysis="" of="" the="" functional="" interactions="" between="" proteins="" might="" provide="" insights="" into="" the="" mechanisms="" of="" dkd="">(malaltia renal diabètica). En el present estudi, les xarxes d'interacció proteïna-proteïna (PPI) de noranta-quatre gens compartits es van generar mitjançant la base de dades STRING (https://string-db.org/) i es van visualitzar amb el programari Cytoscape (versió 3.7.1, http ://www.cytoscape.org/). Una puntuació d'interacció superior a 0,4 (confiança mitjana) es va considerar estadísticament significativa. CytoHubba, un connector de Cytoscape, es va utilitzar per explorar els gens del centre de la xarxa PPI [14]. Entre ells, VCAM1 va ser el gen millor classificat. Les anàlisis d'enriquiment dels trenta gens del centre immune identificats anteriorment es van realitzar mitjançant l'eina en línia Metascape [15]. A més, es van identificar els mòduls dominants a la xarxa PPI mitjançant el connector MCODE (versió 1.4.2, http://apps.cytoscape.org/apps/ MCODE) al programari Cytoscape.

Verificació de VCAM1 i anàlisi de correlació amb la funció renal

L'expressió diferencial de VCAM1 al tubulointerstici de pacients amb DKD(malaltia renal diabètica)es va validar a la cohort ERCB (31 controls sans i 17 pacients amb DKD). A continuació, vam utilitzar la base de dades en línia Nephroseq v5 (http://v5.nephroseq.org), una plataforma integrada de mineria de dades per a conjunts de dades d'expressió gènica de malalties renals, per validar la correlació entre l'expressió de VCAM1 i els trets clínics dels pacients amb DKD mitjançant Anàlisi de correlació de Pearson a ERCB. Un valor p de<0.05 was="" considered="" statistically="">

Tinció d'immunofluorescència per a VCAM1

Seccions de ronyó en parafina d'un pacient diagnosticat clinicopatològicament de DKD(malaltia renal diabètica)es van tacar amb VCAM1. Això va ser aprovat pel Comitè d'Ètica de la Recerca del Primer Hospital de la Universitat de Pequín (Nº 20171280). La unió inespecífica es va bloquejar amb un 3 per cent de BSA després de la fixació i el tractament tèrmic per a la recuperació d'antigen. A continuació, es van incubar seccions de ronyó amb un anticòs primari contra VCAM1 (Abcam, ab134047, 1:200) durant la nit a 4 graus. L'anticòs secundari marcat amb Cy3-es va obtenir de Jackson ImmunoResearch. El teixit renal adjacent al tumor de mostres de nefrectomia es va utilitzar com a control normal. Les imatges representatives es van capturar amb una càmera Leica DFC 7000 T mitjançant el programari Leica Application Suite V4.7.1.

Cultiu cel·lular

Les cèl·lules del ronyó humà 2 (HK-2), una línia de cèl·lules epitelials tubulars proximals del ronyó humà, es van cultivar en DMEM (11885084, Gibco, EUA) complementat amb un 10% de sèrum fetal boví (10099141 C, Gibco, EUA) i 1 per cent de penicil·lina/estreptomicina (10378016, Gibco, EUA) a 37 graus amb un 5 per cent de CO2. Es va utilitzar glucosa alta (30 mM D-glucosa, G8644, Sigma) [16] i TNF (40 ng/ml, 300–01A, PeproTech) [17] per induir lesions de cèl·lules HK{-2 in vitro. El disulfiram (DSL, 0, 3 μM [18,19], NSC190940, Selleck), un inhibidor de la formació de porus, es va afegir 3 hores abans de la inducció de la lesió de cèl·lules HK-2.

Western blot

La proteïna total es va extreure de cèl·lules HK{{0}} mitjançant tampó RIPA (Sigma, R0278) i la concentració de proteïnes es va determinar mitjançant un kit d'assaig de proteïnes Pierce BCA (Thermo Fisher Scientific, 23227). A continuació, es van separar les proteïnes desnaturalitzades mitjançant electroforesi en gel de dodecil sulfat-poliacrilamida (SDS-PAGE) i després es van transferir elèctricament a membranes de difluorur de polivinilidè (Millipore, IPVH00010). Les membranes es van bloquejar durant 60 minuts amb un 5% de llet sense greix dissolta en solució salina tamponada amb Tris que contenia un 0,1% de Tween 20 (TBST). Les taques es van incubar amb els següents anticossos primaris rellevants durant la nit a 4 graus: GSDMD (Abcam, ab209845, 1:1000), VCAM1 (Abcam, ab134047, 1:2000) i tubulina (ZSBio, TA{20}}, 1). : 5000). La incubació amb una dilució 1:1000 de l'anticòs secundari conjugat amb HRP es va dur a terme durant 1 hora a temperatura ambient. Després de cinc rentats amb TBST, les membranes es van incubar amb el substrat de quimioluminescència (Millipore, WBKLS0100) durant 5 minuts i les imatges es van capturar mitjançant un sistema Image Quant LAS 4000 Mini (GE Healthcare). L'anàlisi semicuantitativa es va realitzar mitjançant el programari ImageJ (Media Cybernetics, Silver Spring, MD).

Aïllament de l'ARN i anàlisi RT-PCR

L'ARN total es va extreure de cèl·lules HK-2 mitjançant un kit d'ARN total RNAsimple (Tiangen, DP419) segons les instruccions del fabricant i es va transcriure inversament a ADNc mitjançant un kit FastKing RT (Tiangen, KR116). La PCR quantitativa es va realitzar mitjançant un sistema de PCR en temps real StepOne (Applied Biosystems, EUA) amb mètodes de dos passos. Les seqüències dels primers utilitzats es mostren a la taula S4. L'expressió gènica comparada es va calcular mitjançant el mètode 2−ΔΔCt tal com es va descriure anteriorment.

Anàlisi estadística

Es va utilitzar el programari GraphPad Prism 6.0 per a les anàlisis estadístiques i les dades es presenten com a mitjanes ± SEM. Es va aplicar una prova t no aparellada de dues cues per a les comparacions entre dos grups. Les diferències al nivell P <0,05 es="" van="" considerar="" estadísticament="">

Cistanche pot tractarMalaltia renal diabètica

Resultats

L'evidència acumulada ha revelat recentment que la patologia tubulointersticial té un paper crític en el desenvolupament i la progressió de la DKD.(malaltia renal diabètica). L'objectiu de l'estudi era descriure les característiques de la DKD(malaltia renal diabètica)infiltració de cèl·lules immunitàries tubulointersticials i identificar alguns gens immunològics i inflamatoris clau per proporcionar noves idees sobre la patogènesi i la teràpia de la DKD. En aquest estudi, vam investigar el perfil de la infiltració de cèl·lules immunitàries tubulointersticials i vam identificar la piroptosi com la forma principal de mort cel·lular programada en DKD.(malaltia renal diabètica)utilitzant anàlisis bioinformàtiques. VCAM1 es va identificar com el gen principal relacionat amb el sistema immunitari i es va correlacionar positivament amb la piroptosi i les cèl·lules immunitàries infiltrades. A més, es va validar que l'expressió de VCAM1 s'elevava en cèl·lules tubulars renals cultivades en condicions de diabetis. El fàrmac aprovat per la FDA disulfiram va inhibir la piroptosi de cèl·lules tubulars renals i va disminuir l'expressió de VCAM1, els nivells de citocines inflamatòries i la fibrosi in vitro.

1. Fluxos de treball d'anàlisi bioinformàtica

Els passos principals del flux de treball es mostren a la figura 1. Primer vam avaluar la infiltració de cèl·lules immunitàries en teixits tubulointersticials de pacients amb DKD.(malaltia renal diabètica). Aleshores, es va descobrir la piroptosi, la principal forma de mort cel·lular al tubulointerstici, mitjançant GSEA i GSVA. A continuació, vam examinar una llista de gens estretament relacionats amb la infiltració de cèl·lules immunitàries i vam identificar gens centrals. Es va realitzar una anàlisi de correlació entre les cèl·lules immunitàries infiltrades, la piroptosi i el gen VCAM1 del centre superior. A més, es va realitzar la validació clínica i la validació d'immunotinció de VCAM1. Finalment, vam realitzar un estudi in vitro per validar els resultats de l'anàlisi bioinformàtica.

2. Anàlisis de deconvolució de cèl·lules immunitàries i estromals

Hem utilitzat xCell, que genera puntuacions d'enriquiment del tipus cel·lular mitjançant dades d'expressió gènica a granel, per determinar els tipus de cèl·lules potencialment implicades en la lesió tubulointersticial enmalaltia renal diabètica. Les puntuacions d'enriquiment de 64 tipus de cèl·lules, inclosos 34 tipus de cèl·lules immunes i 30 tipus de cèl·lules estromals i altres, es van obtenir per a cada mostra (figura 2 (a)). Es va il·lustrar el mapa de calor de 34 puntuacions d'enriquiment de cèl·lules immunitàries per identificar el paisatge immunitari del DKD(malaltia renal diabètica)tubulointerstici (figura 2 (b)). En comparació amb els controls normals, la majoria de les puntuacions d'enriquiment de cèl·lules T eren relativament més altes en pacients amb DKD.(malaltia renal diabètica), excepte CD4 més Tcm, Tregs, cèl·lules Th1, CD8 més cèl·lules T naïves i cèl·lules NKT. Les puntuacions d'enriquiment d'aDC i cDC van ser més altes en pacients amb DKD(malaltia renal diabètica)que en els controls, mentre que les puntuacions d'enriquiment de cèl·lules Pro-B eren més baixes en pacients amb DKD. Les puntuacions d'enriquiment de la majoria de subconjunts de monòcits/macròfags i granulòcits no eren significativament diferents entre DKD(malaltia renal diabètica)i teixits normals, excepte els macròfags i neutròfils M1, i els eosinòfils (taula 1).

Figura 2. Anàlisi de la infiltració de cèl·lules immunitàries per xCell al tubulointerstici de DKD(malaltia renal diabètica). ( a ) Comparació de les puntuacions cel·lulars de 64 tipus de cèl·lules al tubulointerstici entre DKD i control del teixit renal al conjunt de dades GSE30529. ( b ) El paisatge cel·lular del microambient immune a DKD(malaltia renal diabètica). El mapa de calor representa la puntuació d'enriquiment del tipus cel·lular de cada tipus de cèl·lula immune per a totes les mostres. DC, cèl·lula dendrítica; Tcm, cèl·lula T de memòria central; Tem, cèl·lula T de memòria efectiva; Cèl·lula T δ, cèl·lula T gamma delta.

3. GSVA i GSEA de conjunts de gens distintius

Hem realitzat GSVA i GSEA del conjunt de gens distintius al conjunt de dades GSE30529 per explorar els processos biològics a la DKD(malaltia renal diabètica)tubulointerstici. Les vies de senyalització "resposta interferó-alfa", "resposta interferó-gamma" i "complement" es van activar significativament en la patogènesi de la lesió tubulointersticial en pacients amb DKD (Figura 3 (a)) i es mostra un resum dels resultats de GSVA a la taula S1. A continuació, vam realitzar GSEA dels tres conjunts de gens i vam trobar que estaven enriquits positivament en el conjunt de dades. Les puntuacions d'enriquiment normalitzats (NES) van ser 1,89, 1,89 i 1,7{{10}}, amb valors p normalitzats (valors p NOM) de 0.000, 0,002 i 0,019, respectivament (figura 3 (bd)). Totes les vies significativament enriquides identificades mitjançant GSEA es mostren a la taula 2. Aquestes dades suggereixen que la resposta immune tubulointersticial té un paper important en la patogènesi de la DKD.(malaltia renal diabètica).

4. GSEA i GSVA de conjunts de gens associats a diverses formes de mort cel·lular

La mort cel·lular inclou piroptosi, necrosi, necroptosi, apoptosi, ferroptosi i autofàgia, que tenen diferents mecanismes fisiopatològics i vies de senyalització. S'ha informat que diverses formes de mort cel·lular programada estan associades amb respostes inflamatòries i immunes. Vam construir conjunts de gens de diversos tipus de mort cel·lular a partir de GeneCards (taula S2) i després vam realitzar tant GSEA com GSVA per explorar la implicació de la mort cel·lular en la inflamació tubulointersticial en pacients amb DKD.(malaltia renal diabètica). GSEA va demostrar que només els conjunts de gens de piroptosi es van enriquir significativament en pacients amb DKD(malaltia renal diabètica)en comparació amb els controls normals (NES=1.65, FDR q valor=0.023, FWER=0.013) (Figura 3(e)). Mentrestant, la puntuació GSVA per a la piroptosi va ser la més alta entre tots els diferents tipus de mort cel·lular analitzats (taula S3). A partir d'aquest resultat, la piroptosi podria tenir un paper en la patogènesi de lesions tubulointersticials en pacients amb DKD.(malaltia renal diabètica).

Figura 3. Anàlisis d'enriquiment del conjunt de gens (GSEA) i anàlisis de variació del conjunt de gens (GSVA). ( a ) Gràfic de barres dels resultats de GSVA de 50 conjunts de gens distintius. (b)-(d) Resultats de GSEA de "resposta d'interferó-alfa Hallmark_", "resposta d'interferó-gamma" de "Hallmark_" i "complement de Hallmark". (e) Resultat GSEA de la piroptosi.

5. Correlació entre les puntuacions d'enriquiment de la piroptosi i la infiltració de cèl·lules immunitàries

Les puntuacions d'enriquiment de GSVA per a la piroptosi es van correlacionar amb la proporció d'infiltració de cèl·lules immunitàries realitzant l'anàlisi de correlació de Pearson per avaluar la correlació entre la piroptosi i la infiltració de cèl·lules immunitàries. Vam observar una correlació significativa entre 15 tipus de cèl·lules immunitàries i la piroptosi (figura 4), cosa que suggereix una estreta interacció entre les cèl·lules immunitàries i la piroptosi.

6. Descobriment de gens bàsics

Es va realitzar una anàlisi d'expressió diferencial per explorar encara més la relació entre les cèl·lules tubulars renals i les cèl·lules immunes intersticials. Es van identificar quatre-cents vuit DEG entre el DKD(malaltia renal diabètica)grup i el grup control, entre els quals 65 estaven regulats a la baixa i 343 regulats a l'alça (figura 5). Es va descarregar una llista de gens relacionats amb la immunitat per identificar els DEG relacionats amb la immunitat i es van adquirir noranta-quatre gens immunes de concentració a partir de dos conjunts de dades (DEG i la llista de gens relacionats amb la immunitat) mitjançant un diagrama de Venn (figura 6 (a)). L'anàlisi PPI d'aquests noranta-quatre gens immunes hub va revelar 97 nodes i 694 interaccions (figura S1). Els 30 nodes principals calculats per l'algorisme MCC es van identificar com a gens concentradors (figura 6 (b) i taula 3). A continuació, es va realitzar una anàlisi d'enriquiment dels gens hub. El "rebuig de l'al·lograft", la "resposta interferó-gamma", la "resposta inflamatòria", la "resposta interferó-alfa", la "transició epitelial-mesenquimal" i el "complement" van ser els ítems més enriquits en l'anàlisi del distintiu. "Artritis reumatoide", "interacció del receptor de citocines", "via de senyalització del receptor similar a Toll", "toss ferina" i "via de senyalització NF-kappa B" van ser els termes KEGG més enriquits. "Resposta cel·lular interferó gamma", "activitat de quimiocines", "adhesió cèl·lula-cèl·lula de leucòcits" i "regulació de la producció de citocines" van ser els termes GO més enriquits (figura 6 (c)). A més, el sistema de puntuació MCODE va ​​identificar dos clústers amb una puntuació superior o igual a 5. PTRPC, TRIM22, PSMB8, KNG1 i CXCL6 eren nodes concentradors amb graus de nodes més alts al mòdul 1 (Figura 6 (d)) i CD1C, EGF, FCER1G, CD3D i CD48 eren nodes concentradors del mòdul 2 (figura 6 (e)).

7. Correlació entre l'expressió de VCAM1 i les cèl·lules immunitàries infiltrades

Entre els gens centrals identificats, el gen més classificat, VCAM1, es va identificar com un gen central immune en DKD(malaltia renal diabètica). L'expressió de VCAM1 va augmentar significativament en pacients amb DKD(malaltia renal diabètica)(Figura 7 (a)). L'anàlisi de correlació va revelar que l'expressió de VCAM1 estava positivament correlacionada amb les cèl·lules CD4 més T (r=0,6877, P=0.0004), Cèl·lules de memòria CD4 més T (r=0,7102, P=0,0002), cèl·lules Th2 (r=0,7358, P <0,0001), cd8="" més="" tcm="" (r="" {{18="" }},6026,="" p="0,0030)," cèl·lules="" t="" δ="" (r="0,5864," p="0,0041)," cèl·lules="" nk="" (r="0,5692," p="0,0057)," macròfags="" (r="0,5068," p="0,0161)," macrofags="" m1="" (r="0,4441," p="0" .0384),="" adc="" (r="0.4814," p="0.0233)" i="" cdc="" (r="0.6562," p="0.0009)" però="" correlacionats="" negativament="" amb="" naïf="" cd8="" més="" cèl·lules="" t="" (r="-0,4909," p="0,0204)" i="" cèl·lules="" nkt="" (r="-0,5548," p="0,0074)" (figura="" 7="" (b)="">

8. Correlació entre l'expressió de VCAM1 i la piroptosi

L'anàlisi de correlació de Pearson es va realitzar per explorar si l'expressió de VCAM1 regulada a l'alça al tubulointerstici de pacients amb DKD(malaltia renal diabètica)està relacionada amb la piroptosi. L'expressió de VCAM1 estava estretament relacionada amb la piroptosi (r=0.6118, P=0.0025) (figura 7 (c)), cosa que indica que la piroptosi podria induir l'expressió de VCAM1.

9. Verificació, rellevància clínica i validació per immunofluorescència de l'expressió VCAM1

Hem realitzat una anàlisi rellevant de pacients amb DKD(malaltia renal diabètica)d'ERCB per validar el canvi en l'expressió VCAM1 al DKD(malaltia renal diabètica)tubulointerstici. De manera consistent, els nivells d'ARNm de VCAM1 van ser significativament més alts en pacients amb DKD(malaltia renal diabètica)(Figura 8 (a)). L'expressió de VCAM1 es va correlacionar negativament amb la taxa de filtració glomerular (GFR) (r=- 0.5920, P=0.0123) (Figura 8 (b)) i es va correlacionar positivament amb el sèrum nivells de creatinina (r=0.5189, P=0.0328) (figura 8 (c)). A més, vam realitzar una tinció d'immunofluorescència per a VCAM1 al teixit renal d'un pacient amb DKD.(malaltia renal diabètica)i va trobar que l'expressió de VCAM1 tubular renal estava significativament regulada en comparació amb la dels ronyons normals (figura 8 (d)).

10. DSL va inhibir la piroptosi de cèl·lules HK-2 induïda per HG, l'expressió de VCAM1 i la inflamació

Vam exposar cèl·lules HK-2 cultivades a glucosa alta (HG) i TNF- durant 48 h per determinar encara més la relació entre la piroptosi de cèl·lules tubulars, l'expressió de VCAM1 i la resposta immune tubulointersticial en individus amb DKD.(malaltia renal diabètica). Com que el nucli de la piroptosi cel·lular és la formació de porus de membrana induïda per GSDMD escindit, vam detectar els nivells del domini N-terminal de GSDMD (GSDMD-NT) i VCAM1 mitjançant western blotting. Tant HG com TNF van induir un augment significatiu del nivell de GSDMD-NT, cosa que indica l'aparició de piroptosi mediada per GSDMD (figura 9 (a)). L'expressió de VCAM1 es va incrementar de manera estadísticament significativa en els grups HG i TNF (figura 9 (b)). El disulfiram (DSL) és un inhibidor eficaç de la formació de porus GSDMD [18]. El pretractament amb DSL va alleujar l'augment dels nivells de GSDMD-NT, cosa que indica que es va suprimir la piroptosi cel·lular. Mentrestant, l'expressió de VCAM1 es va reduir en els grups HG i TNF pretractats amb DSL (figura 9 (ab)). A continuació, es va determinar el perfil de citocines inflamatòries mitjançant qPCR. Els resultats van mostrar que els nivells regulats a l'alça dels ARNm MCP-1, IL{-1 i IL{-18 induïts per HG es van reduir significativament després del pretractament DSL. Al grup TNF, el nivell d'IL-1 va disminuir significativament en el grup pretractat amb DSL, i els nivells de MCP{-1 i IL{-18 no van canviar significativament. No es van trobar canvis significatius en els nivells dels ARNm IL-6 i IL-8 en cap grup. És important destacar que els nivells d'ARNm de TGF- 1 també es van reduir als grups pretractats de DSL. Així, les cèl·lules tubulars piroptòtiques van augmentar l'expressió de VCAM1 en condicions de diabetis i un tractament que abrogava la piroptosi va inhibir l'expressió, la inflamació i la fibrosi de VCAM1 a les cèl·lules HK{30}}.

Cistanche pot tractarMalaltia renal diabètica

Feu clic aquí per a la part II

De: "Identificació i verificació de la proteïna d'adhesió de cèl·lules vasculars 1 com a gen central relacionat amb el sistema immunitari associat amb la lesió tubulointersticial en la malaltia renal diabètica" de Yan Jia, et al.

---BIOENGINEERED 2021, VOL. 12, NO. 1, 6655–6673