Els pacients amb cirurgia vascular amb proporcions elevades de neutròfils a limfòcits tenen l'expressió d'ARN del complement de neutròfils regulada a la baixa
Nov 24, 2023
L'elevada proporció de neutròfils a limfòcits (NLR) en pacients sotmesos a cirurgia vascular electiva (EVS) ha augmentat la mortalitat independentment dels resultats quirúrgics perioperatoris. Per entendre per què la NLR alta s'associa amb una mortalitat més alta, vam investigar l'expressió del transcriptoma de neutròfils i limfòcits en pacients sotmesos a EVS. Es van recollir mostres de sang de pacients sotmesos a EVS i donants sans per al càlcul de NLR. Les mostres d'ARN es van aïllar dels neutròfils i els limfòcits dels pacients i es van dividir en NLR_Baix (<3) and NLR_High (≥3) groups (n = 6 each). Paired samples with the highest RNA integrity number (mean = 9.8 ± 0.4) were sequenced and analyzed for differential expression. Normalized data were inputted for downstream analysis using iPathwayGuide (AdvaitaBio) and gene set enrichment analysis using GenePattern and MSigDB (Broad Institute). There was no clinical difference between the patient groups about clinical diagnosis, age, sex, history of hypertension, lipid abnormalities, diabetes mellitus, smoking, or statin use. The mean NLR was 4.37 ± 0.27 SEM in the NLR_High and 1.88 ± 0.16 for the NLR_Low groups. Significantly differentially expressed gene sets identified in the RNA sequence data were enriched highly (P = 1E-24) in the humoral immunity and complement systems. Neutrophils from NLR_High patients downregulated complement genes (C1QA, C1QB, C1QC, C1S, C2, CR2, C3AR1, C3, C8G, and C9 and complement regulatory genes CD59, SERPING1, C4BPA, CFH, and CFI). Downregulation of gene expressions of humoral immunity and complement within the neutrophils are associated with elevated NLR. It remains to be determined whether and how these changes contribute to increased late mortality previously observed in patients undergoing EVS.
Beneficis de cistanche per a homes enforteixen el sistema immunitari
Introducció
Les malalties cardiovasculars (ECV) són una de les principals causes de mort a tot el món. Es deu, en gran part, a l'aterogènesi i l'aterosclerosi que, a més de la genètica i la dieta individuals, estan mediades per mecanismes inflamatoris i immunitaris.1-3 Recentment, el recompte diferencial de leucòcits (neutròfils i limfòcits) s'ha posat de manifest. per predir els resultats cardiovasculars (CV). La proporció del recompte absolut de neutròfils a limfòcits (NLR) s'ha reconegut com a predictor de la mortalitat total en diversos estudis petits d'intervencions coronàries agudes, hipertensió arterial, 7,8 i insuficiència cardíaca.9
Taula 1. Característiques clíniques dels pacients amb cirurgia vascular electiva examinats per RNA-seq
Investigacions anteriors també han demostrat que la NLR és un predictor de resultats a llarg termini en pacients amb malaltia vascular perifèrica.10-13 Els nostres estudis retrospectius de poblacions de pacients de cirurgia vascular donen suport a aquesta conclusió. En 1 estudi de 108 pacients amb reparació electiva d'aneurisma aòrtic abdominal endovascular, no hi va haver cap diferència en la mortalitat postoperatòria de 30-dia entre un NLR de<4 and an NLR of >4 (P = .507). However, the 1-year, 3-year, and 5-year mortality between the groups were 4.2% vs 28.1%, 15.1% vs 64.9%, and 24% vs 90%, respectively.14 In a second study of 290 asymptomatic patients undergoing prophylactic carotid endarterectomy, the risk for stroke was noted to be significantly higher (P < .0001) in patients with an NLR of >3 (n=116 pacients, 42,6% de risc d'ictus) que aquells amb un NLR de<3 (n = 174 patients, 9.3% stroke risk).15 In a third study with 488 patients who underwent percutaneous interventions of femoropopliteal arteries, the 30-day mortality rates increased significantly (P = .005) with increasing NLR (1.4%, 4.3%, and 7.0% for low [<3], mid [3-4], and high [>4] grups NLR, respectivament).16 Els pacients amb un NLR preoperatori més baix van aconseguir una supervivència sense amputacions significativament més gran al 4-any de seguiment (NLR baix 65,5%, NLR mitjà, 37,5% i NLR alt, 17,6). % [P <.0001]).16
En aquest estudi, hem realitzat la seqüenciació d'ARN (ARN-seq) de neutròfils i limfòcits de pacients qualificats per a la reparació de cirurgia vascular electiva (EVS) per determinar mecanismes potencials per a un NLR elevat. Els estudis van examinar si hi ha una base molecular per a un NLR elevat. Les nostres investigacions revelen que els pacients amb NLR elevat que tenien reparació d'EVS es distingeixen per una baixada molt significativa dels gens de la immunoglobulina i del complement en els neutròfils.
Beneficis de cistanche: enforteix el sistema immunitari
Mètodes
Pacients
Blood samples were collected from candidate patients for EVS procedures and healthy volunteers for NLR calculation and RNA sequence studies of neutrophils and lymphocytes. In screening patients for participation, any individual with an active local or systemic infection or obvious inflammatory disease was excluded from participation. Peripheral blood collection was approved by the institutional review board of University Hospitals Cleveland Medical Center (#01-06-02). Informed consent was obtained from each patient and healthy volunteer. All patients for EVS seen in the outpatient department were eligible. Patients in the study were characterized for the type of vascular surgery, age, sex, hypertension (blood pressure >130/80 mm Hg), diabetes mellitus (fasting blood glucose >100 mg/dL), estat de tabaquisme, tractament amb estatines, antecedents mèdics de malaltia pulmonar obstructiva crònica, càncer, malaltia renal crònica, malaltia de l'artèria coronària (CAD), malaltia arterial perifèrica, malaltia cerebrovascular i insuficiència cardíaca crònica. Tots els pacients tenien un recompte de sang complet amb recompte de glòbuls blancs diferencial. Els pacients es van dividir en NLR baix (NLR_Baix [<3]) and high NLR (NLR_High [≥3]) groups (n = 6 each) and healthy volunteers aged 18 to 71 years (n = 6). Eleven of 12 patients' blood was drawn before surgery. One patient had blood drawn 4 months after surgery.
Separació de sang
Es va recollir sang sencera (20 ml per pacient) en tubs vacutainer de 10 ml anticoagulats amb EDTA i la sang es va separar en una hora després de la recollida. Les poblacions de cèl·lules de neutròfils i limfòcits es van aïllar cadascuna de 8 ml de sang mitjançant kits d'aïllament de cèl·lules humanes directes EasySep (STEMCELL Technologies, Vancouver, Canadà) i l'imant Big Easy EasySep (STEMCELL Technologies, Vancouver, Canadà) segons els protocols del fabricant. L'imant es va refredar amb gel abans, i les cèl·lules sanguínies i els reactius es van barrejar suaument invertint el tub en lloc de pipetejar. Les proporcions de reactius també es van ajustar de la manera següent per optimitzar la recuperació: es van afegir 400 ml de barreja d'anticossos, 400 ml de perles magnètiques i 4 ml de solució salina tamponada amb fosfat a la sang abans de la primera separació, seguit de 200 ml d'anticossos. mescla i 400 ml de perles abans de la segona separació i 200 ml de perles abans de la tercera i última separació. Es va extreure una petita alíquota de 200 ml dels volums de recuperació finals per al recompte de cèl·lules i la preparació de portaobjectes. La resta del volum de recuperació es va centrifugar a 1000 revolucions per minut durant 7 minuts per sedimentar les cèl·lules.
Figura 1. Transcriptoma complet de l'ARN de neutròfils i limfòcits recollits de pacients amb NLR, alt (NLR_Alt), baix (NLR_Baix) o control (NLR_Control) . El codi de lletra "N" o "L" al nom de la mostra significa que els neutròfils o els limfòcits eren la font de l'ARN. Hi havia 6 pacients dins de cada categoria. Blau=nivell d'expressió reduït; vermell=alt nivell d'expressió.
Recompte de cèl·lules i preparació de portaobjectes
Les cèl·lules resuspeses en solució salina tamponada amb fosfat es van repartir en alícuotes, es van barrejar amb blau de tripà i es van comptar manualment amb un hemocitòmetre. Normalment, es van aïllar de 9 × 106 a 15 × 106 neutròfils i de 3 × 106 a 10 × 106 limfòcits per mostra. Les diapositives de les cèl·lules aïllades es van preparar amb una citocentrífuga, es van girar a 600 revolucions per minut durant 3 minuts i després es van tenyir amb una tinció de Wright-Giemsa. La puresa de cada població cel·lular es va determinar mitjançant un recompte manual, en el qual es van distingir almenys 1000 cèl·lules per diapositiva. La puresa mitjana de les separacions de neutròfils i limfòcits per recompte de cèl·lules va ser del 98,3% i del 96,2%, respectivament. La citometria de flux es va realitzar en 1 parell de mostres de neutròfils i limfòcits i va indicar un 90, 6% i un 92, 2% de puresa, respectivament. Les altres cèl·lules de la preparació de neutròfils es van dividir en limfòcits (4%), monòcits (2%), eosinòfils (2,3%) i basòfils (0,3%). En la preparació de limfòcits, la resta de cèl·lules eren neutròfils (1,2%), monòcits (1,4%), eosinòfils (1,2%) i basòfils (1,8%). Les dades de seqüència d'ARN a granel de totes les mostres individuals també es van utilitzar per determinar l'abast de la contaminació de monòcits a les preparacions cel·lulars determinant si els neutròfils o els limfòcits de NLR_Alt o NLR_Les mostres baixes havien augmentat significativament el CD14. , CD68, CD83 o CD163. De manera independent, les dades d'ARN-seq es van introduir per estimar la proporció de cèl·lules immunitàries i cancerígenes (EPIC), un programa dissenyat per estimar la proporció de cèl·lules immunitàries i cancerígenes a les dades d'expressió gènica a granel.17 El perfil de referència utilitzat va ser proporcionat per EPIC per a cèl·lules immunitàries que circulen per la sang i conté el perfil de cèl·lules B, cèl·lules T CD4 i CD8, monòcits, neutròfils i cèl·lules assassines naturals. La sortida informada es dóna com a fraccions cel·lulars per mostra.
Figura 2. Gens expressats de manera significativament diferencial a partir de neutròfils i limfòcits. (A) El nombre de gens expressats de manera significativament diferent en neutròfils (blau) i limfòcits (taronja). (B) La trama d'anàlisi de components principals de gens expressats de manera significativament diferenciada en neutròfils (verd i morat) i limfòcits (vermell i blau) a NLR_Alt (cercles) i NLR_Baix (quadrats). (C) Un mapa de calor de gens expressats de manera significativament diferenciada a partir d'ARN de neutròfils NLR_Alt vs NLR_Baix. (D) Un mapa tèrmic de gens expressats de manera significativament diferent a partir d'ARN limfòcits NLR_Alt vs NLR_Baix.
ARN-seq i anàlisi estadística
Els mètodes detallats per a l'extracció i la seqüenciació d'ARN es presenten als mètodes suplementaris. Es va avaluar la qualitat de les lectures de seqüenciació i l'adaptador es va retallar amb TrimGalore! (Babraham Institute), un script d'embolcall per a FastQC i CutAdapt. Les lectures que passaven el control de qualitat es van alinear amb el genoma de referència humà GRCH38 mitjançant el programari d'alineador STAR. Les lectures alineades es van processar mitjançant Cufflinks versió 2.2.1 per a l'anàlisi d'expressió diferencial mitjançant l'anotació del gen GENCODE per a GRCh38 i les dades d'expressió a nivell gènic es van informar en fragments per transcripció de quilobase per milió de lectures mapejades. valor P de tall de la taxa de descobriment<.05, after the Benjamini-Hochberg correction for multiple testing. Normalized fold-change and P values for all expressed genes were then used as input for downstream analysis using iPathwayGuide (AdvaitaBio) and gene set enrichment analysis (GSEA) using GenePattern and MSigDB (Broad Institute). Additional figures including heat maps and scatterplots were generated in R and ClustVis.
Resultats
Característiques del pacient
Es van escollir sis parells de mostres de pacients entre 7 NLR_Alt i 9 NLR_Baix en funció de la qualitat més alta de l'ARN del parell avaluat pel nombre d'integritat de l'ARN (RIN) (Taula 1). ). També es van examinar sis controls de 8 donants sans. En els pacients inclosos a l'estudi, la mitjana ± desviació estàndard NLR per a NLR_Alt va ser de 4,37 ± 0,66 versus per a NLR_Baix, 1,87 ± 0. 39 (P <.0001). La mitjana ± desviació estàndard de l'edat dels pacients va ser de 61,0 ± 17,0 anys per a NLR_Alt i de 64,5 ± 7,5 anys per a NLR_Baix (P= 0,68). Tots els pacients menys 1 tenien malaltia aneurisma aòrtica, 9 eren toràcics/toracoabdominals i 2 abdominals. Els dos pacients amb aneurisma aòrtic abdominal estaven al grup NLR_Baix. Onze dels 12 pacients tenien antecedents d'hipertensió. Quatre de cada 6 pacients dels grups NLR_Alt o NLR_Baix tenien antecedents mèdics d'anormalitats lipídiques. Quatre pacients del grup NLR_Alt i 3 pacients del grup NLR_Baix eren antics fumadors. Un pacient del grup NLR_Low era un fumador actiu. Cinc pacients del grup NLR_Alt i 4 del grup NLR_Baix estaven prenent estatines. Només 3 pacients dels dos grups eren diabètics. Un pacient de cada grup tenia antecedents de CAD i 2 pacients del grup NLR_Baix tenien malaltia de l'artèria perifèrica.
Figura 3. Les dades d'ARN-seq en aquesta investigació es van utilitzar com a mitjà independent per determinar altres contaminacions cel·lulars en les preparacions de neutròfils i limfòcits. Només es mostren les dades dels neutròfils. Es va realitzar una anàlisi EPIC per estimar la proporció de cèl·lules immunitàries i cancerígenes a les dades d'expressió gènica a granel. Aquesta anàlisi va obtenir el percentatge de neutròfils, monòcits, cèl·lules B, cèl·lules T CD4, cèl·lules T CD8, cèl·lules assassines naturals (NK) i altres cèl·lules en la preparació de neutròfils.
Transcriptoma sencer
Hem observat diferències globals en tot el transcriptoma en comparar els perfils d'expressió gènica entre neutròfils i limfòcits (figura 1). Aquesta troballa no va ser sorprenent, ja que l'expressió gènica específica del tipus de cèl·lula s'havia caracteritzat prèviament com a diferent.19 A la secció de neutròfils, entre els pacients de NLR_Alt, NLR_Baix i NLR{{ 4}}Grups de control, hi havia molts gens regulats que clarament no estaven regulats a la secció de limfòcits i viceversa. A tot el nivell del transcriptoma, les diferències específiques de les cèl·lules entre neutròfils i limfòcits eren diferents i dominants, independentment de la NLR o si era un pacient o control. Tanmateix, en un examen més atent, van començar a aparèixer diferències. Una gràfica d'anàlisi de components principals va mostrar que el control NLR_de neutròfils o limfòcits es solapava amb NLR_Alt i NLR_Baix a ambdues cèl·lules (figura suplementària 1). A continuació, les investigacions van intentar trobar diferències addicionals entre els grups NLR_Alt i NLR_Baix en els gens expressats de manera significativament diferent. Es va observar que es van observar 900 (74,5%) gens expressats de manera significativa de manera diferent en neutròfils en grups NLR_Alt vs NLR_Baix (figura 2A). En comparació, els limfòcits només tenien 190 (15, 7%) gens expressats de manera significativament diferent. Un gràfic d'anàlisi de components principals de NLR_Gens alts versus NLR_Gens baixos en neutròfils i limfòcits va revelar que el grup de gens NLR{_Alt vs NLR_Baix en el els neutròfils es van segregar en dues àrees diferents, mentre que els gens dels limfòcits NLR_Alt i NLR_Baix es van solapar (figura 2B). De nou, igual que amb totes les dades del transcriptoma, el control NLR_es superposava amb els gens NRL_Alt i NLR_Baix expressats de manera significativament diferent tant en neutròfils com en limfòcits (figura suplementària 2). La majoria dels gens expressats de manera significativament diferenciada a NLR_Alt de neutròfils es van regular a la baixa de NLR_Baix (figura 2C). Un nombre similar, però molt menor, de gens es va reduir a la NLR_Alta quantitat de limfòcits que la dels neutròfils (figura 2D). Aquestes dades van suggerir que els nivells de NLR estaven associats principalment amb l'expressió gènica alterada en neutròfils. A més, s'havia de comparar amb pacients del seu grup de malaltia NLR_Baix, no NLR-Control, perquè el primer grup es va separar clarament del NLR_Alt però no NLR_Control ( Figura 2B; figura suplementària 2).
cistanche tubulosa: millora el sistema immunitari
Abans d'investigar l'expressió diferencial dels gens i l'enriquiment del conjunt de gens, estudis addicionals van caracteritzar el grau de contaminació de monòcits en la preparació de neutròfils. Utilitzant les dades d'ARN-seq, vam observar que l'expressió dels marcadors de monòcits CD14, CD68, CD83 i CD163 en NLR_High vs NLR_Baix neutròfils o preparacions de limfòcits no eren significativament diferents. L'anàlisi EPIC de les dades d'ARN-seq dels neutròfils va mostrar que les cèl·lules no immunes ("altres cèl·lules") i les cèl·lules T CD4 eren els principals contaminants en les preparacions de neutròfils (figura 3). A excepció de les cèl·lules T CD4 i B de NLR{{10}}baix, cap de les altres cèl·lules contaminants va ser significativament diferent en els neutròfils NLR_baix i en els neutròfils alts de la NLR_ . En la preparació de neutròfils, la contaminació de monòcits per anàlisi EPIC va ser només del 0,17% ± 0.05% per al NLR_Baixa enfront del 0,1% ± 0,033% per a el NLR_Altes preparacions (P=.12). Aquest valor indica que la contaminació de monòcits va ser un ordre de magnitud inferior quan es va determinar mitjançant l'anàlisi de dades d'ARN-seq versus citometria de flux.
Figura 4. Gràfic de bombolles de dispersió de categories de conjunt de gens GO expressades significativament per a processos biològics entre NLR_Alt i NLR_Baix. La proporció de k: K a l'abscissa és el nombre de gens que s'expressen de manera significativament diferent (k) en comparació amb el nombre total de gens de la categoria (K). L'ordenada és la significació de l'enriquiment expressada com a logaritme (valor P). (A) Conjunts de gens GO derivats de l'ARN-seq de neutròfils que comparen NLR_Alt amb NLR_Baix. (B) Conjunts de gens GO derivats de l'ARN-seq de limfòcits. Els conjunts de gens a la cantonada inferior esquerra d'ambdues trames són els menys significatius. Els conjunts de gens a la cantonada superior dreta d'ambdues trames són els més significatius.
Figura 4 (continuació)
Per examinar la naturalesa dels gens expressats de manera diferencial, vam realitzar una GSEA amb categories d'ontologia gènica (GO) per a processos biològics utilitzant els conjunts de gens expressats de manera significativament diferencial entre NLR_Alt i NLR_Baix. Els resultats es mostren als gràfics de bombolles de dispersió (figura 4). La segregació dels conjunts de gens a la part superior dreta de cadascuna de les parcel·les mostra (1) un alt percentatge dels gens dels conjunts de gens que es modifiquen significativament i (2) un alt grau de significació per a l'enriquiment del conjunt de gens. A la nostra mostra, els diagrames de bombolles de dispersió van mostrar l'enriquiment de les categories GO de resposta humoral i de complement de manera independent tant per als neutròfils com per als limfòcits. En els neutròfils, els conjunts de gens per a la via clàssica d'activació del complement, la regulació de la cascada d'activació de proteïnes i la resposta immune humoral mediada per la immunoglobulina circulant van ser els més significatius amb el percentatge més alt de membres del conjunt de gens canviat significativament (figura 4A). Independentment, també es va observar que els conjunts de gens idèntics als limfòcits tenien una proporció elevada de gens canviats significativament i un grau d'importància com en els estudis de neutròfils (figura 4B).
Taula 2. Conjunts de gens d'immunologia en neutròfils i limfòcits
La taula 2 enumera els conjunts de gens d'immunologia que han canviat més significativament en neutròfils (taula 2, panell A) i limfòcits (taula 2, panell B). Aquest estudi va comparar l'expressió gènica en neutròfils o limfòcits entre mostres NLR_Altes i NLR_Mostres baixes. Les mostres de control de NLR_sanos no es van comparar, ja que els seus nivells d'expressió es solapaven amb les mostres de pacients de NLR_alt i NLR_baix tant a tot el transcriptoma com a conjunts de gens expressats de manera significativament diferent. A més, les mostres de control NLR_sanes no es van coincidir en edat, malaltia i estat quirúrgic (figures suplementàries 1 i 2). Tant en neutròfils (taula 2) com en limfòcits (taula 2), les dades van indicar que l'expressió dels conjunts de gens relacionats amb el sistema immunitari era molt diferent quan es va comparar NLR_Alt amb NLR_Baix. . A l'ARN seq, cada tipus de cèl·lula té les mateixes troballes que l'altre tipus de cèl·lula. En ambdós panells, els nivells de significació dels principals conjunts de gens es van maximitzar a P < 1E-24. Aquestes dades eren molt significatives, independentment de si es va examinar el neutròfil o el limfòcit. Per centrar-se en l'àrea de contingut molt important d'aquesta investigació d'ARN-seq, es va examinar l'expressió gènica de la immunoglobulina expressada de manera significativament diferent. En primer lloc, un gràfic d'anàlisi de components principals dels gens dels neutròfils va mostrar que per a NLR_Alt vs NLR_Baix, els gens d'immunoglobulina expressats de manera significativament diferenciada es van segregar en 2 grups (figura suplementària 3A). Alternativament, els gens dels limfòcits de NLR_Alt vs NLR_Baix sobre solapat (figura suplementària 3A). A continuació, es va comparar un mapa de calor combinat de l'expressió gènica relacionada amb la immunitat entre NLR_Alt amb NLR_Baix en neutròfils i limfòcits (figura 5). En general, quan s'examina tot el mapa de calor, hi ha una regulació a la baixa òbvia de tota la família de gens d'immunoglobulines al grup de neutròfils NLR_Alt en comparació amb el de NLR_Baix. La majoria dels gens (69/156, 44%) estaven relacionats amb la immunoglobulina. Només 12 dels 156 (7,7%) gens estaven relacionats amb el complement: C1QA, C1QB, Serping1, C2, C2R, C4BPA, C3AR1, CR1, CR1L, CFH, CFD i CD59. Al grup dels limfòcits, també hi va haver una regulació a la baixa de la majoria dels gens d'immunoglobulines a la categoria NLR_Alta.
Els conjunts de gens de complement en neutròfils i limfòcits es detallen a la taula 3. Tant en neutròfils (taula 3) com en limfòcits (taula 3), l'expressió de gens en 3 conjunts de gens relacionats amb el sistema del complement eren molt diferents (P < 1E{{ 5}}) quan es van comparar mostres NLR_Altes amb mostres NLR_Baixes. Aquesta observació era la mateixa tant si la comparació era entre l'ARN de neutròfils o limfòcits. Els 3 conjunts de gens inclouen l'activació del complement, la via clàssica d'activació del complement i la regulació de l'activació del complement. Un gràfic d'anàlisi de components principals dels gens dels neutròfils va tornar a demostrar que per a NLR_Alt vs NLR_Baix, els gens del complement expressats de manera significativament diferenciada es van segregar en 2 grups (figura suplementària 3B). Alternativament, els gens de limfòcits de NLR_Alt vs NLR_Baix solapament (figura suplementària 3B).
Figura 5. Mapa tèrmic de gens expressats de manera significativament diferencial en el conjunt de gens de la immunoglobulina en neutròfils (esquerra) i limfòcits (dreta). Els gens enumerats a la dreta de cada mapa tèrmic són els membres de la immunoglobulina
A la figura 6 es mostra un mapa de calor dels neutròfils i l'expressió de limfòcits d'un conjunt de gens relacionats amb el complement que compara NLR_Alt amb NLR_Baix. NLR_Alta població. En aquest conjunt de gens, similar als conjunts de gens d'immunoglobulina, la majoria dels gens (69/ 86, 80%) estaven relacionats amb la immunoglobulina. Només 12 de 86 (14%) eren components del complement i gens reguladors (C1QA, C1QB, SERPING1, C2, CR2, C4BPA, C3AR1, CR1, CR1L, CD59, CFH i CFD). En el grup de limfòcits en general, hi havia menys expressions de gens del complement, i els gens d'immunoglobulines estaven lleugerament més regulats al grup NLR_Alt. Com que hi ha una major comprensió dels gens del sistema del complement en comparació amb els gens dels sistemes d'immunoglobulines, l'atenció es va centrar en el sistema del complement com a candidat potencial per a gens objectiu relacionats amb NLR alt i baix. Es va preparar un mapa de calor compost que comparava NLR_Alt amb NLR_Baix que mostrava l'expressió del sistema del complement i gens relacionats tant en mostres de neutròfils com de limfòcits (figura 7). En la seva major part, el limfòcit no és un sistema cel·lular reservori del sistema del complement. La majoria dels gens del complement no estan regulats en els limfòcits. Només C1S, CR2, C5, C8G, C5 i CFB estaven presents amb una diferència d'expressió entre els limfòcits NLR_Alt i NLR_Baix (figura 7). El CD81 dels limfòcits és una tetraspanina de cèl·lules B. Les expressions C1S i C8G semblen ser significativament més altes en els limfòcits NLR_Altes que les dels limfòcits NLR_Baixes, similars a KLKB1, el gen de la precalicreïna plasmàtica.
En canvi, en els neutròfils, NLR_High va mostrar una regulació a la baixa dels gens dels components del complement C1QA, C1QB, C1QC, SERPING1, C1R, C4BPA, C3 i C3AR1, i els seus gens reguladors (inhibidors) del complement CD59, CFB i CFI. . Només els gens C2 i CFD es van regular a l'alça en pacients amb NLR_Alt_N. CD59 i C9 estan relativament regulats a l'alça en els neutròfils NLR_Baix_N en comparació amb els de NLR_Alt_N. FGFR4 és un receptor del factor de creixement. La CFH estava present, però semblava no estar influenciada per NLR_alt o NLR_baix dels neutròfils. S'expressa més en els limfòcits.
Beneficis de cistanche per a homes enforteixen el sistema immunitari
Feu clic aquí per veure els productes Cistanche Enhance Immunity
【Demanar més】 Correu electrònic:cindy.xue@wecistanche.com / Whats App: 0086 18599088692 / Wechat: 18599088692
Discussió
El NLR del recompte diferencial de leucòcits s'ha convertit en un marcador senzill i àmpliament utilitzat per reconèixer possibles resultats nocius en una àmplia gamma de trastorns, com ara ECV, tumors sòlids i trastorns inflamatoris com el lupus eritematós sistèmic i l'esclerosi sistèmica. En les nostres pròpies investigacions retrospectives sobre pacients amb ECV ateroscleròtica, vam observar que els pacients amb un NLR elevat tenen una taxa de mortalitat tardana més alta després de la reparació electiva de l'aneurisma aòrtic, una taxa més alta d'ictus tardà/mort després d'una endarterectomia caròtida profilàctica i una disminució de la supervivència sense amputacions després revascularització femoral-poplítia electiva si el seu NLR està elevat.14-16 Les investigacions actuals es van iniciar per trobar una base mecanicista per a un NLR elevat. limfoma, tumors sòlids múltiples i trastorns inflamatoris com el lupus eritematós sistèmic i l'esclerosi sistèmica. En les nostres pròpies investigacions retrospectives sobre pacients amb ECV ateroscleròtica, vam observar que els pacients amb un NLR elevat tenen una taxa de mortalitat tardana més alta després de la reparació electiva de l'aneurisma aòrtic, una taxa més alta d'ictus tardà/mort després d'una endarterectomia caròtida profilàctica i una disminució de la supervivència sense amputacions després revascularització femoral-poplítia electiva si el seu NLR està elevat.14-16 Les investigacions actuals es van iniciar per trobar una base mecanicista per a un NLR elevat.
Taula 3. Conjunts de gens complementàries en neutròfils i limfòcits
Per desenvolupar un enfocament imparcial pel que fa als mecanismes d'efectes diferencials de la NLR sobre els resultats CV, vam realitzar RNA-seq tant en neutròfils com en limfòcits dels mateixos pacients. Per a aquest estudi, es van recollir prospectivament tots els pacients amb malaltia aòrtica i es van agrupar en categories NLR segons els seus resultats. Les 6 mostres finals de cadascun dels 2 tipus de cèl·lules es van seleccionar pel nivell més alt del seu RIN en l'ARN preparat de les mostres de neutròfils i limfòcits aparellats sense tenir en compte el sexe, l'edat o les condicions mèdiques anteriors. Com es pot veure a la taula 1, els pacients dels grups NLR_Alt i NLR_Baix eren força similars i només es distingien pel seu NLR.
La qualitat de l'ARN utilitzat en aquest estudi es mostra pel RIN i la segregació completa del patró d'expressió gènica entre neutròfils i limfòcits en tots els grups de pacients recollits (NLR alt, NLR baix i controls) (Figura 1). Una gràfica d'anàlisi de components principals mostra que les dades de control de NLR_eren irrellevants en aquesta investigació perquè la NLR dels pacients es solapava amb la NLR_Alta i NLR_Baixa en les poblacions de neutròfils i limfòcits dels pacients. . L'anàlisi GSEA va proporcionar una gran visió de quins conjunts de gens es van enriquir en els conjunts de gens GO dels processos biològics, i el diagrama de bombolles de dispersió ho va demostrar clarament mitjançant la representació de la significació del registre respecte a la relació entre el nombre de gens alterats sobre el nombre total de gens. en els conjunts de gens. Quan es va revisar, els conjunts de gens que es separen de tota la llista eren els de la immunitat humoral (immunoglobulina) i el sistema de complement (taules 2 i 3) basats en la relació i la importància estadística en un enfocament de descobriment imparcial.
El gran nombre de gens d'immunoglobulines de la immunitat humoral implicats és difícil de treballar perquè les diferències importants entre aquests gens no són ben conegudes. Alternativament, se sap molt més sobre el sistema del complement, i l'enfocament en el sistema de complement clàssic que és activat per la immunoglobulina és un objectiu reconeixible per a la inflamació i la malaltia relacionada amb les immunoglobulines. Les nostres dades suggereixen que els gens clàssics dels components del complement C1QA, C1QB, C1R, CR1, C1S, SERPING1, C2, C4BPA, C3 C3AR1, C8G, C9 i diversos gens reguladors (CD59, CFB CFI i CFH) estan regulats a la baixa en els neutròfils dels pacients. amb NLR elevat (figura 7). Aquestes troballes són sorprenents per 3 raons. En primer lloc, els gens implicats són els majoritàriament de la via clàssica del complement. En segon lloc, en pacients amb NLR alt, aquests gens del complement estan, en la seva majoria, regulats a la baixa en comparació amb els dels pacients amb NLR baix. Finalment, s'expressa més F12 en neutròfils de NLR_Alt que els de NLR_Mostres baixes. Les formes enzimàtiques del producte proteic de F12 (factor XII [FXII]) activen la via clàssica del complement i els neutròfils.20 Per contra, el PLG, el gen del plasminogen i activador de FXII, està regulat a la baixa en limfòcits i neutròfils de pacients dins de NLR{ {21}}Alt, cosa que suggereix que l'activació de FXII en si pot ser un regulador de l'activació del complement.
A més, s'ha demostrat que el sistema de complement clàssic està implicat en la CVD accelerada. El component del complement 1q (C1q) és el factor inicial de la via del complement, que té un paper important tant en el sistema immunitari innat com en el adquirit.21 S'ha demostrat que el C1q té un doble paper, efectes positius i negatius sobre l'aterosclerosi.22 En el sistema immunitari clàssic. via del complement, C1q té un paper protector en l'aterosclerosi en fase inicial mitjançant la regulació del senyal molecular dels macròfags mitjançant una via independent del complement, la modulació de l'absorció de lipoproteïnes aterogèniques, la mediació de cèl·lules apoptòtiques i l'eliminació de restes cel·lulars.23,24 Un estudi recent de Jia. et al23 indica que la reducció de la C1q sèrica s'associa amb la CAD. Un altre estudi de Guo et al24 indica que l'augment de l'activitat de C1q s'associa amb la CAD. Finalment, estudis recents indiquen que els pacients amb diabetis amb C1q reduït han escurçat la supervivència.25 Aquestes dades indiquen que l'examen del sistema del complement pot ser important per entendre la patogènesi de les ECV mediada per la inflamació.
Figura 6. Mapa de calor de gens expressats de manera significativament diferencial en el conjunt de gens del complement en neutròfils (esquerra) i limfòcits (dreta). Els gens enumerats a la dreta de cada mapa tèrmic són els membres del conjunt de gens del complement. L'ARN prové de neutròfils o limfòcits recollits de pacients amb NLR alt (NLR_Alt) o baix (NLR_Baix). Es comparen sis mostres individuals de NLR_Alt amb 6 mostres individuals de NLR_Baix tant de neutròfils com de limfòcits.
Figura 7. Mapa de calor compost del complement i gens relacionats de neutròfils o limfòcits NLR_Alt o NLR_Baix. A cada categoria, el mapa de calor compost es va preparar a partir de 6 mostres individuals d'ARN-seq de cada tipus de cèl·lula.
Recently, a retrospective investigation of the data from the CANTOS, JUPITER, SPIRE-1, SPIRE-2, and CIRT trials on 60 087 patients was conducted to determine whether NLR predicts major adverse CV events and is modified by anti-inflammatory therapy.26 NLR modestly correlated (ie, r 2 ≤ 0.26) with interleukin 6, C-reactive protein, and fibrinogen levels but minimally with lipids.25 In all 5 trials, NLR predicted incident CV events and death in patients with NLR >3.08.26 Tot i que la disminució de lípids no va tenir cap impacte en la NLR, la teràpia antiinflamatòria amb canakinumab, un inhibidor de la interleucina 1 va reduir la NLR (p < 0,0001).26 Aquestes dades suggereixen que la NLR pot ser un marcador de ECV independentment dels lípids i del influència de les estatines. Aquesta anàlisi ad hoc de múltiples assaigs prospectius aleatoris suggereix que NLR pot ser un factor de risc independent de mortalitat en ECV.
Hi ha algunes limitacions en aquest estudi. Les nostres preparacions de neutròfils tenien un 4% de contaminació de limfòcits i 2% de monòcits per citometria de flux. Com que no se sap que els neutròfils sintetitzen immunoglobulina, els canvis en el gen de la immunoglobina dels neutròfils podrien provenir de la contaminació de cèl·lules B. A l'anàlisi EPIC, hi va haver un augment significatiu de la contaminació de cèl·lules B de les mostres NLR-Low. Aquesta observació suggereix que un augment del nivell de gens d'immunoglobulina a les mostres de neutròfils baixes de NLR_podria sorgir de la contaminació de cèl·lules B. Així, la reducció dels gens d'immunoglobulina a les mostres altes de NLR_podria ser deguda a l'augment de cèl·lules B a les mostres baixes de NLR_ i no necessàriament a nivells reduïts de gens d'immunoglobulines a les mostres de NLR_alts. De la mateixa manera, no se sap que els neutròfils siguin cèl·lules productores de complement. La contaminació del dos per cent amb monòcits podria ser la font dels gens del complement. Tanmateix, utilitzant les dades de la seq. d'ARN, vam observar que no hi ha cap diferència significativa en la contaminació de monòcits de les preparacions de neutròfils entre NLR_Baix i NLR_Alt. A més, la realització d'una anàlisi EPIC de les dades d'ARN-seq mostra que la contaminació de monòcits va ser<0.1% (<1:1000) of the neutrophil preparations, indicating that the RNA-seq was unlikely influenced by contaminating monocytes (Figure 3). The contaminating B cells in the NLR_Low samples do not influence the complement data observed. Finally, even now, it is not known that the changes we observed in complement and immunoglobulin genes are specific to vascular surgery patients with high NLR or older patients in general. NLR and genetic studies need to be performed on healthy age- and sex-matched patients without CVD.
Beneficis de cistanche per a homes enforteixen el sistema immunitari
En resum, el descobriment cardinal d'aquesta investigació és que, en estats alts de NLR, molts gens dels components del complement i alguns dels seus reguladors estan regulats a la baixa en els neutròfils. No està clar el significat general i l'estat d'activació dels gens del complement regulats a la baixa identificats. Com que els conjunts de gens del complement disminueixen de manera sorprenent, especulem que els individus amb NLR_supervivència postoperatòria alta i escurçada tenen una pèrdua dels principals mecanismes de protecció CV proporcionats pels sistemes de complement. Aquesta avaluació s'ha d'examinar de manera prospectiva en les investigacions clíniques del mecanisme o mecanismes subjacents per a aquest resultat.
Referències
1. Ross R. Aterosclerosi: una malaltia inflamatòria. N Engl J Med. 1999;340(2):115-126.
2. Getz GS. Sèrie de revisions temàtiques: el sistema immunitari i l'aterogènesi. Funció immune en aterogènesi. J Lipid Res. 2005;46(1):1-10.
3. Hansson GK, Hermansson A. The immune system in atherosclerosis. Nat Immunol. 2011;12(3):204-212.
4. Duffy BK, Gurm HS, Rajagopal V, Gupta R, Ellis SG, Bhatt DL. La utilitat d'una proporció elevada de neutròfils a limfòcits per predir la mortalitat a llarg termini després d'una intervenció coronària percutània. Am J Cardiol. 2006;97(7):993-996.
5. Tamhane UU, Aneja S, Montgomery D, Rogers EK, Eagle KA, Gurm HS. Associació entre la proporció de neutròfils a limfòcits a l'ingrés i els resultats en pacients amb síndrome coronària aguda. Am J Cardiol. 2008;102(6):653-657.
6. Gibson PH, Croal BL, Cuthbertson BH, et al. Relació preoperatòria de neutròfils-limfòcits i resultat de l'empelt de derivació de l'artèria coronària. Am Heart J. 2007;154(5):995-1002.
7. Fici F, Celik T, Balta S, et al. Efectes comparatius de nebivolol i metoprolol sobre l'amplada de distribució dels glòbuls vermells i la relació neutròfils/limfòcits en pacients amb hipertensió essencial recentment diagnosticada. J Cardiovasc Pharmacol. 2013;62(4):388-393.
8. Karaman M, Balta S, Ay SA, et al. Els efectes comparatius de valsartan i amlodipina sobre els nivells de vWf i la relació N/L en pacients amb hipertensió recentment diagnosticada. Clin Exp Hypertens. 2013;35(7):516-522.
9. Uthamalingam S, Patvardhan EA, Subramanian S, et al. Utilitat de la relació entre neutròfils i limfòcits per predir els resultats a llarg termini en la insuficiència cardíaca aguda descompensada. Am J Cardiol. 2011;107(3):433-438.
10. Bhat TM, Afari ME, Garcia LA. Proporció de limfòcits de neutròfils a la malaltia vascular perifèrica: una revisió. Expert Rev Cardiovasc Ther. 2016;14(7):871-875.
11. Bhutta H, Agha R, Wong J, Tang TY, Wilson YG, Walsh SR. La relació neutròfils-limfòcits prediu la supervivència a mitjà termini després de la cirurgia vascular major electiva: un estudi transversal. Vasc Endovasc Surg. 2011;45(3):227-231.
12. Appleton ND, Bailey DM, Morris-Stiff G, Lewis MH. La proporció de neutròfils a limfòcits prediu la mortalitat perioperatòria després de la reparació electiva oberta d'aneurismes aòrtics abdominals. Vasc Endovasc Surg. 2014;48(4):311-316.
13. Bath J, Smith JB, Kruse RL, Vogel TR. La relació neutròfils-limfòcits prediu la gravetat i el resultat de la malaltia després dels procediments de les extremitats inferiors. J Vasc Surg. 2020;72(2):622-631.
14. King AH, Schmaier AH, Harth KC, et al. La proporció elevada de neutròfils-limfòcits prediu la mortalitat després de la reparació electiva d'aneurisma endovascular. J Vasc Surg. 2020;72(1):129-137.
15. King AH, Kim AH, Kwan S, et al. Una proporció elevada de neutròfils a limfòcits s'associa amb pitjors resultats després de l'endorterectomia caròtida en pacients asimptomàtics. J Stroke Cerebrovasc Dis. 2021;30(12):106120.
16. King AH, Kwan S, Schmaier AH, et al. Una proporció elevada de neutròfils a limfòcits s'associa amb una disminució de la supervivència sense amputacions després de la revascularització percutània femoropoplítia. Int Angiol. 2021;40(5):442-449.
17. Racle J, de Jonge K, Baumgaertner P, Speiser DE, Gfeller D. Enumeració simultània de càncer i tipus de cèl·lules immunitàries a partir de dades d'expressió gènica tumoral a granel. Elife. 2017;6:e26476.
18. Trapnell C, Roberts A, Goff L, et al. Anàlisi diferencial d'expressió gènica i transcripció d'experiments d'ARN-seq amb TopHat i Cufflinks. Nat Protoc. 2012;7(3):562-578.
19. Palmer C, Diehn M, Alizadeh AA, Brown PO. Perfils d'expressió gènica específica de tipus cel·lular de leucòcits a la sang perifèrica humana. BMC Genòmica. 2006;7:115.
20. Stavrou EX, Fang C, Bane KL, et al. El factor XII i l'uPAR regulen les funcions dels neutròfils per influir en la cicatrització de ferides. J Clin Invest. 2018;128(3): 944-959.
21. Dunkelberger JR, Song WC. El complement i el seu paper en les respostes immunitàries innates i adaptatives. Res cel·lular 2010;20(1):34-50.
22. Speidl WS, Kastl SP, Huber K, Wojta J. Complement in atherosclerosis: friend or foe? J Tromb Haemost. 2011;9(3):428-440.
23. Jia Y, Wen W, Yang Y, et al. El paper clínic de la combinació sèrica C1q i hsCRP en la predicció de la malaltia de l'artèria coronària. Clin Biochem. 2021;93:50-58.
24. Guo S, Mao X, Li X, Ouyang H, Gao Y, Ming L. L'activitat C1q del complement sèric s'associa amb la malaltia de l'artèria coronària obstructiva. Front Cardiovasc Med. 2021;8:618173.
25. Cavusoglu E, Kassotis JT, Anwar A, et al. La utilitat del complement C1q per predir la mortalitat 10-any en homes amb diabetis mellitus referits a una angiografia coronària. Am J Cardiol. 2018;122(1):33-38.
26. Adamstein NH, MacFadyen JG, Rose LM, et al. La relació neutròfils-limfòcits i els esdeveniments ateroscleròtics incidents: anàlisis de cinc assaigs aleatoris contemporanis. Eur Heart J. 2021;42(9):896-903.