Cistanche per tractar la inflamació i la malaltia renal: quina és la causa del paper patogènic de la inflamació en l'afectació renal en la cistinopatia?
Mar 13, 2022
Contacte:joanna.jia@wecistanche.com
La interacció entre la galectina-3 i la cistinosina descobreix un paper patogènic de la inflamació en l'afectació renal de la cistinosi
Tatiana Lobry1,2 et al
Inflamacióestà implicat en la patogènesi de molts trastorns. Tanmateix, sovint es desconeixen els mecanismes subjacents. Aquí, comprovem sicistinosi, la proteïna implicadacistinosi, és un regulador crític de la galectina-3, un membre de la família de proteïnes d'unió a la b-galactosidasa, durantinflamació. Cistinosiés un trastorn d'emmagatzematge lisosomal i, malgrat l'expressió omnipresent de la cistinosi, elronyóés l'òrgan principal afectat per la malaltia.Cistinosis'ha trobat que millora la localització lisosomal i la degradació de la galectina-3. En Ctns–/–ratolins, un model de ratolícistinosi, la galectina-3 està sobreexpressada alronyó. L'absència de galectina-3 en ratolins cistinòtics millora la funció i l'estructura renal patològica i disminueix la infiltració de macròfags/monòcits al ronyó del Ctns.–/–Gal3–/–ratolins en comparació amb Ctns–/– ratolins. Aquestes dades suggereixen fortament que la galectina-3 intervéinflamacióinvolucrat enronyóprogressió de la malaltia en la cistinosi. A més, es va trobar que la galectina -3 interacciona amb la proteïna monocit quimioattractant de la citocina proinflamatòria-1, que estimula el reclutament de monòcits/macròfags i va demostrar que augmentava significativament en el sèrum de ratolins Ctns–/–. i també pacients ambcistinosi. Així, les nostres troballes destaquen un nou paper de la interacció de la cistinosi i la galectina-3 en la inflamació i proporcionen una explicació mecanicista addicional per a laronyómalaltia de la cistinosi. Això pot conduir a la identificació de nous objectius de fàrmacs per retardarcistinosiprogressió.
PARAULES CLAU:malaltia renal crònica; cistinosi; galectina-3;inflamació; proteïna quimioatraient monòcits-1
cistanche pot tractar la malaltia renal crònica i la cistinosi
La causa principal de la inflamació és que l'òxid nítric pot provocar la producció de cèl·lules inflamatòries.Cistancheés una valuosa medicina herbal xinesa. Els seus ingredients actius poden inhibir la secreció d'òxid nítric i tenen un paper important en la prevenció i el tractament de la inflamació i la malaltia renal.
Declaració translacional
Malgrat el tractament, els pacients encara progressen cap a la insuficiència renal terminal. En aquest estudi, vam demostrar que l'absència decistinosiprovoca una degradació lisosomal de la galectina-3 (Gal-3), que condueix ainflamaciói la progressió demalaltia renal crònicaencistinosi. Aquestes troballes obren noves perspectives sobre dianes terapèutiques potencials que podrien limitar o retardar la degeneració renal en pacients ambcistinosi. Com a tal, els fàrmacs antiinflamatoris i els inhibidors de Gal-3 com els antiinflamatoris no esteroides o la indometacina poden millorar la patogènesi renal en la cistinosi.
Inflamacióés una resposta aguda normal d'un organisme a una lesió o infecció,1però crònicainflamaciós'associa amb danys als teixits. En el cas de malalties cròniques, com la diabetis, els teixits danyats activen el sistema immunitari, provocant una resposta inflamatòria contínua i, finalment, la degeneració dels teixits.2 Les citocines són moduladors clauinflamaciói són capaços d'activar o resoldre elinflamacióprocés.3 En pacients ambmalaltia renal crònica(CKD), concentració plasmàtica elevada de citocines (interleucina [IL]-6 i factor de necrosi tumoral-a) iinflamacióEls marcadors (proteïna C-reactiva, IL-6, hialurona i neopterina) s'associen amb la progressió cap a la malaltia renal en fase terminal.4 Entendre els mediadors específics que desencadenen respostes inflamatòries facilita el descobriment de dianes farmacològiques adequades per prevenir danys degeneratius. .
Cistinosiés una malaltia metabòlica autosòmica recessiva que pertany a la família dels trastorns d'emmagatzematge lisosomal i es caracteritza per l'acumulació de cistina a tots els òrgans.5 El gen defectuós encistinosi, CTNS, codifica el cotransportador lisosomal de cistina/protons, la cistinosi.6,7 Tot i que CTNS s'expressa de manera omnipresent, elronyóés el primer òrgan afectat en persones ambcistinosi. Els pacients solen presentar en el seu primer any de vida la síndrome de Fanconi, caracteritzada per alteracions greus de líquids i electròlits, creixement deficient i raquitisme.8Posteriorment es desenvolupa la ERC, que progressa cap a una malaltia renal terminal i requereixronyótrasplantament. L'acumulació de cistina a tots els teixits eventualment condueix a una disfunció multiorgànica; els pacients experimenten fotofòbia i ceguesa, hipotiroïdisme, hipogonadisme, diabetis, miopatia i deteriorament del sistema nerviós central.9 Al fons C57BL/6, un model de ratolí eliminador (Ctns–/–) 10 replica el fenotip renal dels pacients cistinotics,11 així com la deposició de cristalls de cistina a la còrnia12i disfunció de la tiroide.13
En el present estudi, revelem un nou paper percistinosieninflamaciómitjançant la seva interacció amb Gal-3. Gal-3 és un membre de la família de proteïnes d'unió a lectines i b-galactòsids 21 i està implicat en múltiples funcions biològiques, incloentinflamació.22En el context deronyómalalties, es va demostrar que la inhibició de Gal-3 redueix l'expressió del marcador proinflamatori i la fibrosi renal i evita la disminució de la taxa de filtració glomerular en models d'hiperaldosteronisme, hipertensió o obesitat.23–26Aquí aportem la prova que, encistinosi, l'absència decistinosicondueix a la sobreexpressió de Gal-3ronyons, millorant la infiltració de macròfags i la progressió de la CKD. A més, identifiquem la proteïna quimioatraient-1 de monòcits (MCP-1) com a mediador potencial, revelant nous objectius genètics per a la teràpia farmacològica. RESULTATS Gal-3 interacciona amb la cistinosi mitjançant el seu domini de reconeixement de carbohidrats Per identificar una interacció específica socis que utilitzen espectrometria de masses quantitativa, caní Madin-DarbyronyóLes cèl·lules (MDCK) es van transduir amb una construcció lentiviral per expressar de manera estable la proteïna de fusió cistinosi-proteïna fluorescent FL (GFP) verda. A més de les 9 subunitats de H+ adenosina trifosfatasa de tipus vacuolar publicades anteriorment,19Gal-3 es va identificar com una de les proteïnes que interactuavencistinosi(Figura 1a). Aquesta interacció es va confirmar encara més per co-immunoprecipitació seguida de Western blotting (figura 1b i c). A més, vam mostrar aquesta interacció entre Gal-3 icistinosiva ser mediat pel domini de reconeixement de carbohidrats Gal-3 (CRD) localitzat a la cua C-terminal de la proteïna. La interacció va ser inhibida pel tiodigalactoside, un potent inhibidor de les interaccions galectina-hidrats de carboni (figura 1d). Com totes les galectines, Gal-3 té afinitat per les proteïnes glicosilades,21 per la qual cosa és probable que la interacció amb Gal-3 es produeixi a través de la part glicosilada de la cistinosi situada a la cua N-terminal intralisosomal de la proteïna.27
La cistinosina millora la localització i la degradació lisosomals de Gal-3
Per verificar la possible localització lisosomal de Gal-3 quan s'interacciona ambcistinosi, vam demostrar que Gal-3, com la catepsina D (una proteasa intralisosomal), estava protegida de la digestió per la proteasa K, mentre que ambdues proteïnes es van digerir quan els lisosomes es van permeabilitzar amb Tritó X- 100 (figura 2a i suplementari). Figura S1). Es van obtenir dades similars en lisosomes aïllats del fetge de ratolí, confirmant la localització lisosomal de Gal -3 in vivo (figura 2b i c). A causa de l'absència d'un anticòs fiable per detectarcistinosi, es va realitzar una immunotinciócistinosi- Línies cel·lulars MDCK que expressen GFP amb un anticòs anti-Gal-3. Va confirmar la presència de Gal-3 al lumen dels lisosomes, mentre que la cistinosi-GFP i Lamp{-2 (una proteïna transmembrana lisosomal) només es van trobar a la membrana de les vesícules (figura 2d).
Per investigar sicistinosinaestava implicat en el tràfic de Gal-3, vam analitzar la dinàmica de tots doscistinosii Gal-3-vesícules positives mitjançant microscòpia de fluorescència FL de reflexió interna total de cèl·lules vives de doble color en fibroblasts embrionaris de ratolí (MEF) de tipus salvatge (WT) i Ctns–/–ratolins que expressen tant CTNS-DsRed com Gal-3-GFP. La nostra anàlisi ho va confirmarcistinosii Gal-3 es sotmeten a una veritable colocalització en Ctns–/– MEF, tal com es valida per la distribució espaciotemporal similar d'aquestes molècules a la zona de microscòpia de fluorescència FL de reflexió interna total (figura 2e). Les dades dels MEF WT eren similars (dades no mostrades). A més, quan es van analitzar els MEF transfectats només amb Gal- 3-GFP, es va trobar Gal-3-GFP al citoplasma i no es va observar cap estructura vesicular diferent, al contrari de la co-transfecció amb CTNS-DsRed ( dades no mostrades).
Aquestes dades es van confirmar a les cèl·lules 293T, en les quals es va observar un fort senyal de GFP al citoplasma en cèl·lules que expressaven només Gal-3-GFP, mentre que en cèl·lules que expressaven tant Gal{-3-GFP comcistinosina-DsRed, Gal-3-GFP es va localitzar principalment dins dels lisosomes que expressaven la cistinosi-DsRed (figura 3a). A més, quantificació de l'expressió de la proteïna Gal-3 en cèl·lules transfectades només amb Gal{-3-GFP o Gal{- 3-GFP i CTNS-DsRed, i Gal{-3-GFP i DsRed com a control, va mostrar significativament menys proteïnes Gal-3-GFP a les cèl·lules co-transfectades amb CTNS-DsRed en comparació amb les cèl·lules transfectades amb Gal{-3-GFP sol o co-transfectades amb DsRed (figura 3b). En conjunt, aquests resultats suggereixen quecistinosinamillora la localització lisosomal i la degradació de Gal-3. Es va demostrar que la cistinosina està implicada en la CMA.28 La proteïna de xoc tèrmic de 70 kDa (Hsc70) participa en la CMA ajudant al desplegament i la translocació de proteïnes del substrat a través de la membrana cap al lumen lisosomal d'una manera dependent de LAMP2A.29,30 Perquè Gal{ Es va proposar que {8}} fos degradat per CMA,31 vam investigar la localització de Gal-3 en relació amb Hsc70 en MEF cistinòtics. L'anàlisi de microscòpia confocal va confirmar la colocalització de Gal-3-GFP a Hsc70- estructures positives tant en WT (dades no mostrades) com en Ctns–/–cèl·lules (figura 3c), donant suport a la cotransportació de Gal-3 amb Hsc70 i suggerint que la internalització lisosomal però no el reconeixement de Gal{-3 per part de la chaperona és defectuosa encistinosi.
Gal-3 està implicat en la inflamació del ronyó en Ctns–/–ratolins
Per estudiar el paper de Gal-3 acistinosiin vivo, vam generar un model de ratolí de doble eliminació deficient en tots doscistinosinai Gal-3 (Ctns–/–Gal-3–/–ratolins). WT, Ctns–/–i Gal-3–/–Els ratolins es van utilitzar com a subjectes de control. A les C57BL/6 Ctns–/–ratolins, les anomalies renals apareixen al voltant dels 10 mesos d'edat.11 Per tant, els estudis es van realitzar entre els 8 i els 9 mesos, quanronyóes comencen a detectar anomalies, i als 12 o 15 mesos quan les anomalies renals han progressat. Com que es va trobar que el contingut de cistina era diferent en Ctns masculins i femenins–/– ronyons, es van analitzar per separat. Si el contingut de cistina augmenta amb l'edat en ambdós genotips, no es va observar cap diferència significativa en els ronyons masculins i femenins entre els ratolins Ctns–/– Gal-3–/– i els Ctns.–/– ratolins de 8 a 9 mesos i de 12 a 15 mesos d'edat (figura 4a).
La funció renal es va avaluar en sèrum i orina i no es va observar cap diferència significativa entre WT i Ctns–/–ratolins de 8 a 9 mesos (dades no mostrades), però de 12 a 15 mesos, Ctns–/–els ratolins van mostrar nivells de creatinina sèrica i urea significativament més alts en comparació amb els ratolins WT. Curiosament, Ctns–/–Gal-3–/–els ratolins van mostrar una funció renal millorada en comparació amb Ctns–/–ratolins de 12 a 15 mesos, amb menor creatinina sèrica (P <{2}}.05) i urea (P <0,05; Taula 1).
Estudis histològics de ratolí de 8- a 9-mes i de 12- a 15-mesronyóles seccions van revelar la presència d'anomalies greus a Ctns–/– ronyons, incloent atròfia tubular, glomèruls retraïts i infiltrats mononuclears. L'anàlisi a cegues de les seccions de ronyó va variar l'extensió del dany cortical d'1 (estructura de teixit conservada) a 6. La puntuació mitjana de Ctns–/–els ratolins tenien 2,64 - 0,36 als 9 mesos d'edat (n=7) i 4,12 0,37 als 12 a 15 mesos d'edat (n=16). Als ronyons de Ctns–/–Gal-3–/–ratolins de la mateixa edat, aquestes anomalies eren significativament menys extenses: 1.62 - 0.11 als 9 mesos (n ¼ 21; P <0.{05, mann-whitney="" t-="" prova)="" i="" 3.04="" -="" 0.22="" entre="" 12="" i="" 15="" mesos="" (n="" ¼="" 33;="" p=""><0, 05,="" prova="" t="" de="" mann-whitney)="" (figura="" 4b="" i="" figura="" suplementària="" s2).="" a="" més,="" es="" va="" assignar="" un="" percentatge="" d'atròfia="" tubular="" a="" cada="" teixit="" i="" la="" mitjana="" de="">–/–ratolins i Ctns–/–Gal-3–/–els ratolins eren el 66 per cent i el 42 per cent, respectivament, entre 12 i 15 mesos (P ¼ 0.01). A més, una diferència sorprenent entre Ctns–/–i Ctns–/– Gal-3–/– ronyóseccions va ser la presència de pocs infiltrats mononuclears a la Ctns–/–Gal-3–/–seccions, mentre que es van observar constantment infiltrats pesats a les Ctns–/– ronyó(Figura 4b).
Hem caracteritzat els infiltrats mononuclears observats mitjançant l'examen histològic en Ctns d'{0}} a 9-mesos.–/– ronyonscom a macròfags/monòcits mitjançant la co-immunotinció amb CD68 i CD45 i amb CD68 i classe II d'histocompatibilitat principal (figura suplementària S3), però no amb CD68 i CD163, cosa que suggereix que aquests macròfags tenen un perfil proinflamatori M1-.32 ,33 La quantificació de cèl·lules CD68- positives va revelar significativament menys macròfags/monòcits a WT, Gal-3–/–, i Ctns–/–Gal-3–/– ronyonsen comparació amb Ctns–/– ronyons(Figura 4c), confirmant les dades histològiques (Figura 4b).
En conjunt, aquestes troballes suggereixen que Gal-3 està implicat en el reclutament de macròfags/monòcits en cistinòticsronyonsi que la seva absència millora la malaltia renal enCtns–/–ratolins. Per això suggereix queinflamacióés responsable, almenys en part, del deteriorament renal en Ctns–/– ratolins.
Els ronyons amb deficiència de Ctns presenten una sobreexpressió de Gal-3
Mitjançant l'anàlisi Western blot, vam trobar que l'expressió Gal-3 va augmentar significativamentronyonsde 12-mesos d'antiguitat Ctns–/–ratolins en comparació amb ratolins WT (figura 5a i b). Per investigar si aquesta expressió augmentada de Gal-3 és específica de Ctns–/– ronyons, vam quantificar l'expressió Gal-3 als nivells de transcripció i proteïnaronyonsde ratolins amb ERC induïda per una operació estàndard de nefrectomia 2-etapa subtotal i dels animals que van ser sotmesos a una operació simulada. WT i Ctns–/–Els ratolins es van utilitzar com a subjectes de control. Les transcripcions Gal-3 van augmentar significativament en Ctns–/– i ronyons simulats, però van augmentar molt en ERCronyonsen comparació amb els ratolins WT (figura 5c). En canvi, a nivell de proteïnes, Gal-3 només es va detectar en Ctns–/–ronyons, cosa que suggereix fortament que només Ctns–/–els ronyons no van poder degradar la proteïna Gal-3 (figura 5d). Tinció immunofluorescent de Gal-3 al muríronyóals 8 a 9 mesos també va demostrar una sobreexpressió de Gal-3 a la Ctns–/– ronyonsen comparació amb WTronyons(Figura 5e). A més, Gal-3 va ser expressat pels macròfags CD68+, així com per les cèl·lules renals en Ctns–/– ronyonsde 8 a 9 mesos (figura suplementària S4). En conjunt, aquestes dades són coherents amb la disminució de la degradació de Gal-3 en absència decistinosicom es va demostrar in vitro (figura 3a i b), que condueix a l'acumulació de proteïna Gal-3 a Ctns–/– ronyons.
L'absència de cistinosina condueix a un augment de la MCP-1 sèrica mitjançant la regulació positiva de Gal-3
Gal-3 regulainflamacióa través de diferents mecanismes.34 Així, per obtenir més coneixements sobre el mecanisme encistinosi, vam investigar l'expressió de diferents citocines proinflamatòries o antiinflamatòries en el sèrum de 12- a 15-WT d'un mes, Ctns–/–, Gal-3–/–, i Ctns–/–Gal- 3–/–ratolins. Es van mesurar sis nivells de citocines mitjançant una matriu de perles citomètriques de ratolí, MCP-1, interferó-g, factor de necrosi tumoral i IL-10, IL-6 i IL-12p70. Només l'expressió de MCP-1 va augmentar significativament en el sèrum de ratolins Ctns–/– en comparació amb els ratolins WT i Gal{-3–/– i també amb els ratolins Ctns–/–Gal-3–/–ratolins, els nivells sèrics de MCP-1 eren comparables als ratolins WT (figura 6a). La MCP-1 és produïda per diferents tipus de cèl·lules, la principal font de MCP-1 són els macròfags i els monòcits,35 i actua com a quimioattractant per als monòcits i els macròfags regulant la seva migració i infiltració. En canvi, a la mateixa edat, es va trobar que l'expressió Gal-3 era similar al sèrum de ratolins Ctns–/– (44,33 9,81 ng/ml; n ¼ 5) i ratolins WT (40.{{12} },41 ng/ml; n ¼ 7).
La relació entre Gal-3 i MCP-1 es va investigar més a fons mitjançant la coimmunoprecipitació mitjançant Gal-3–GFP i MCP{-1–DsRed– o Gal-3– GFP i CTNS-DsRed: (com a control positiu) que expressen cèl·lules 293T. Es va observar la interacció entre Gal-3 i MCP-1 (figura 6b), cosa que suggereix una inducció directa de MCP-1 per Gal-3. La incubació amb N-Acetil-D-lactosamina (LacNAc), un inhibidor de Gal-3 CRD, va demostrar que, en contrast ambcistinosinainteracció, el CRD no participa en la interacció entre Gal-3 i MCP-1 (figura 6c).
Per avaluar si aquesta troballa és rellevant en humans, hem mesurat els nivells de Gal-3 i MCP{-1 en pacients ambcistinosique no estaven sotmesos a teràpia immunosupressora ni prenen medicaments antiinflamatoris. Tot i que es va trobar que el nivell de Gal-3 va augmentar lleugerament en el sèrum de pacients amb cistinosi en comparació amb donants sans, la diferència no va ser significativa (Figura 6e), confirmant els nostres resultats obtinguts en Ctns.–/–ratolins. Només 2 pacients tenien un nivell elevat de Gal-3 (25,34 i 39,54 ng/ml); es van considerar atípics i, per tant, no es van incloure a la figura 6e. En canvi, utilitzant un assaig immunosorbent lligat a enzims dirigit contra MCP-1 humà (Figura 6d), es va trobar que els nivells sèrics de MCP-1 augmentaven significativament en pacients ambcistinosi(252,1 - 18,4 pg/ml; n ¼ 19; rang d'edat d'1 a 23 anys) malgrat el tractament amb cisteamina en comparació amb subjectes de control sans (166,9 -13,5 pg/ml; n ¼ 1) 0; rang d'edat 8-63 anys) (P <0,001). no="" s'ha="" trobat="" cap="" correlació="" entre="" l'edat="" i="" el="" nivell="" de="" mcp-="" 1="" en="" ambdós="" pacients="">cistinosii donants sans (dades no mostrades).
Cistanchetéantiinflamatoripropietats
DISCUSSIÓ
Tot i que la cistina s'acumula a tots els teixits en pacients afectatscistinosi, els ronyons són els òrgans més vulnerables als danys. Per tant, creiem que l'acumulació de cistina no és l'únic responsable de la degeneració renal. A continuació, descrivim un nou paper per acistinosinaen el reglament deinflamacióimplicats en la progressió de la malaltia renal crònicacistinosi. Aquest estudi pot explicar per què els pacients evolucionen cap a una insuficiència renal terminal malgrat que es sotmeten a una teràpia amb cisteamina.
L'estudi dels socis moleculars de la cistinosi va revelar una interacció directa amb Gal-3, que es pot inhibir mitjançant inhibidors de Gal-3 CRD. Estudis recents van demostrar que Gal-3 podria interactuar amb glicans situats a la llum lisosomal després d'un dany lisosomal com l'acumulació de cristalls.36 En el nostre estudi, la interacció entre Gal-3 icistinosinaes va estudiar en cèl·lules sanes que expressavencistinosinai, per tant, no acumular cisteïna ni cristalls de cistina. A més, la sobreexpressió tant de Gal-3 com de cistinosina a les cèl·lules sanes va modificar la localització subcel·lular de Gal-3, que després es va localitzar als lisosomes, en comparació amb la sobreexpressió de Gal-3 només, que es trobava al citoplasma. Aquests resultats suggereixen fortament que la interacció entre Gal-3 i la cistinosina s'està produint independentment del dany lisosomal i que la cistinosina és activament responsable de la localització lisosomal de Gal-3. Anteriorment, s'ha demostrat que Gal-3 es degrada mitjançant proteòlisi dependent del lisosomal en absència d'Abl i Arg, 2 tirosina cinases.31
A més, ho vam demostrarcistinosii Gal-3 es co-localitzen en estructures vesiculars dinàmiques i es mobilitzen junts d'una manera espaciotemporal.Cistinosinaanteriorment s'ha associat amb els mecanismes de tràfic del lisosomal LAMP2A, l'únic receptor CMA conegut, que està mallocalitzat encistinosi.28Anteriorment, s'ha demostrat que la degradació de Gal-3 estava mediada per CMA.31L'anàlisi de microscòpia confocal va confirmar la colocalització de Gal-3 a les estructures positives Hsc70-en ambdues Ctn–/– i cèl·lules WT, que donen suport a la cotransportació de Gal-3 amb Hsc70 per a la seva presentació al lisosoma i la degradació per CMA ja que Hsc70 ajuda a la translocació de proteïnes del substrat a través de la membrana cap al lumen lisosomal.29,30Una possible interpretació dels nostres resultats és aquestacistinosinaregula el tràfic i el lliurament de Gal-3 als lisosomes actius per CMA per a la seva degradació.
Aquest nou camí decistinosinaLa localització i degradació lisosomal depenent de Gal-3 s'admet in vivo ja que els ratolins amb deficiència de Ctns presenten una sobreexpressió de Gal-3 dins delronyó. A més, mentre que l'augment de l'ARNm de Gal-3 estava limitat en Ctns–/–ronyons en comparació amb un altre model d'ERC, només es va detectar una gran quantitat de proteïna Gal-3 en Ctns–/– ronyons. Aquestes dades recolzen fermament la conclusió quecistinosinaestà implicat en la degradació de la proteïna Gal-3, que pot controlar la sobreexpressió de l'ARNm de Gal-3 en condicions d'estrès com la ERC.
Gal-3 té diverses funcions biològiques, incloses les funcions agudes i cròniquesinflamacióen atraure monòcits i macròfags.37,38En Ctns–/– ratolins, vam observar infiltrats mononuclears pesats principalment alronyócom s'ha descrit anteriorment,11,39que es van caracteritzar com a monòcits/macròfags. En canvi, els ronyons de la doble eliminatòria Ctns–/–Gal-3–/–els ratolins presentaven molt pocs infiltrats de monòcits/macròfags, cosa que suggereix fortament que Gal-3 està implicat eninflamacióen els ronyons de Ctns–/–ratolins. En el context de lesions repetitives dels teixits, Gal-3 pot desencadenar la transició a la crònicainflamaciói fibrosi.34D'acord amb aquestes troballes, les nostres dades demostren la implicació de Gal-3 en la progressió de la ERC encistinosi. De fet, el doble nocaut Ctns–/– Gal-3–/–els ratolins van mostrar millorronyófunció i estructura en comparació amb Ctns–/–ratolins. De la mateixa manera, els ratolins amb deficiència de Gal-3 presenten menys fibrosi renal a laronyóen comparació amb els ratolins WT després d'una obstrucció uretèrica unilateral,40 i els ratolins Gal-3 knockout sotmesos a una lesió per isquèmia-reperfusió tenien una millor funció renal en comparació amb els ratolins WT sotmesos a una lesió per isquèmia-reperfusió.41
Tot i que es va trobar una correlació entre els nivells de Gal-3 al plasma i el desenvolupament d'ERC,42 no es va observar cap diferència d'expressió de Gal-3 en el sèrum de ratolins i humans afectats percistinosii subjectes de control sans. En mesurar diferents nivells de citocines al sèrum, vam trobar un augment significatiu de MCP-1 en Ctns–/–ratolins, mentre que Ctns–/–Gal-3–/–els ratolins tenien nivells comparables als dels ratolins WT. MCP-1 és una citocina que es pot alliberar al sèrum i forma un gradient per atraure monòcits i macròfags al lloc de la lesió.35 L'augment de MCP-1 en els sèrums de Ctns.–/–ratolins en comparació amb Ctns–/–Gal-3–/–els ratolins eren independents de l'acumulació de cistina perquèronyóEl contingut de cistina era similar en ambdós genotips. A més, malgrat el tractament amb cisteamina que va permetre la sortida de la cistina dels lisosomes, es va trobar que la MCP-1 augmentava significativament en els sèrums de pacients ambcistinosien comparació amb els donants sans. Aquestes dades suggereixen fortament que l'absència decistinosina, més que l'acumulació de cistina, és responsable de l'augment de MCP-1 en sèrum. A més, vam mostrar una interacció directa entre Gal-3 i MCP-1, que va ser suggerida recentment per Gordon-Alonso et al.43 però que no es va estudiar més. El mecanisme d'activació de l'MCP-1 mediat per Gal-3 no es va estudiar aquí. Una hipòtesi és la presència d'un pèptid senyal a la MCP-1 humana, que es pot escindir per millorar la seva secreció.44 A més, la plasmina pot escindir l'extrem C-terminal de la MCP-1, la qual cosa augmenta el seu quimioattractant. A més, en correlació amb les nostres dades, la inhibició de MCP-1 en un model de ratolí de nefropatia diabètica va prevenir la infiltració de macròfags renals i va millorar la funció renal.46,47.cistinosi, les nostres dades suggereixen fermament que l'absència decistinosinacondueix a l'augment de Gal-3, que activa la mobilització de la sang MCP{-1, millorant la funció renalinflamaciói la progressió demalaltia renal crònica.
Aquestes troballes obren noves perspectives sobre dianes terapèutiques potencials que podrien limitar o retardar la degeneració renal en pacients ambcistinosi. De fet, s'ha trobat que els fàrmacs antiinflamatoris no esteroides com l'aspirina i la indometacina inhibeixen l'expressió de Gal-3 mitjançant la inhibició de la seva transcripció.48 La indometacina s'utilitza realment per regular la poliúria i la polidipsia encistinosi,49 i un estudi recent de 307 pacients europeus amb cistinosi va mostrar una millora del resultat renal en pacients tractats amb indometacina.50 A la llum del nostre estudi, l'ús d'indometacina o antiinflamatoris no esteroides per acistinosiels pacients poden ser reconsiderats.
MÈTODES
Experiments amb animals
El C57BL/6 Ctns–/–Els ratolins van ser proporcionats pel Dr. Antignac (Inserm U1163, París, França). C57BL/6 galectina-3 nul (Gal-3–/–) els ratolins van ser proporcionats pel Dr. Fu-Tong Liu (Universitat de Califòrnia, Davis) i el Dr. Jerrold M. Olefsky (Universitat de Califòrnia, San Diego). L'estratègia de cria per generar WT, Ctns–/–, Gal-3–/–, Ctns–/– i Gal- 3–/–Els ratolins es descriuen a Mètodes suplementaris.
Línies cel·lulars
l'embolic es va generar a partir de biòpsies de pell de nounats de WT i Ctns–/–ratolins. Les línies cel·lulars MEF, 293T i MDCK tipus II (ATCC, Manassas, VA) es van cultivar en el medi Eagle modificat de Dulbecco que contenia un 0 per cent de sèrum fetal de vedella o sèrum fetal de boví, 100 unitats/ml de penicil·lina, 0,1 mg/ml de estreptomicina. i L-glutamina 2 mM.
Anàlisi de co-immunoprecipitació i espectrometria de masses
Per estudiar les interaccions proteïna-proteïna, les cèl·lules MDCK es van transduir mitjançant l'esquelet del vector lentiviral pRRL.SIN.cPPT.PGK/WPRE per expressar-se de manera estable.cistinosina-GFP.51La co-immunoprecipitació es va realitzar tal com es descriu a Mètodes suplementaris. Les proteïnes co-immunoprecipitades es van resoldre mitjançant electroforesi en gel de dodecilsulfat de sodi-poliacrilamida (SDS-PAGE) i es van analitzar mitjançant espectrometria de masses, LTQ Orbitrap tal com ja s'ha descrit.19
Les cèl·lules 293T que expressaven Gal-3-GFP i MCP-1-DsRed o Gal-3-GFP i CTNS-DsRed es van utilitzar per a la coimmunoprecipitació tal com es descriu a Mètodes suplementaris. Les proteïnes co-immunoprecipitades es van resoldre mitjançant SDS-PAGE i es va detectar el MCP d'unió a Gal-3-1 mitjançant un anticòs anti-DsRed (Clontech Laboratories, Mountain View, CA).
Fraccionament subcel·lular
Es van obtenir vuit fetges de ratolins C57BL/6 i es van preparar tal com es va descriure anteriorment.52 Les condicions del gradient eren essencialment les mateixes que es descriuen a la publicació original,52 excepte que es va utilitzar Nycodenz en comptes de la metrizamida.
Tractaments amb gal-3-inhibidor i proteïnasa K
Lisats decistinosina-Les cèl·lules GFP MDCK i 293T que expressaven Gal-3–GFP i CTNS-DsRed o Gal{-3–GFP i MCP{-1–DsRed es van incubar amb o sense tiodigalactosid 5 mM o 5 mM de N -Acetil-D-lactosamina, respectivament, 2 inhibidors de Gal-3 CRD. Després de 30 minuts d'incubació a 4 - C amb agitació constant, els lisats es van incubar amb microperles anti-GFP de 50 ml i es va realitzar la immunoprecipitació tal com s'ha esmentat anteriorment. Les proteïnes precipitades es van resoldre mitjançant SDS-PAGE en gel al 10%.
Lisats decistinosinaLes cèl·lules GFP MDCK i les fraccions enriquides amb lisosomes de fetge de ratolí es van incubar amb o sense un 2% de Tritó X-100 durant 10 minuts a 4 - C i després es van incubar 30 minuts amb o sense 2,5 mg/ml i 25 mg. /ml proteinasa K, respectivament. Després de la inactivació de l'enzim amb fluorur de fenilmetilsulfonil 1 mM durant 5 minuts a 4 - C, les proteïnes es van resoldre mitjançant SDS-PAGE en gel al 10%.
Anàlisi d'immunofluorescència
Les cèl·lules MDCK fixes es van incubar amb anticossos anti-Làmp-2 (OriGeneTechnologies, Rockville, MD) i anti-Gal-3 (CedarlaneLaboratories, Burlington, Ontario, Canadà) 2 hores a temperatura ambient, seguida d'Alexa Fluor Anticòs secundari 555 (Invitrogen, Carlsbad, CA) durant 1 hora a temperatura ambient. Les imatges confocals es van prendre amb un microscopi Zeiss LSM 700 (Carl ZeissMicroscopy, Jena, Alemanya).
Cèl·lules 293T que expressen de manera transitòria Gal-3-GFP sol, Gal{-3-GFP i DsRed o Gal{-3-GFP icistinosina-DsRed es van cultivar en un cobreobjectes abans de ser muntats en un portaobjectes. Les cèl·lules es van fotografiar amb un instrument Keyence BZ-X700 (Keyence Corp., Osaka, Japó).
Arreglatronyóles seccions es van incubar durant la nit a 4 - C amb anticossos anti-CD68 (BioLegend, San Diego, CA) o anti-Gal-3 (BioLegend), seguit de l'anticòs secundari Alexa Fluor 488 (Invitrogen), 1 hora a temperatura ambient. Les imatges es van adquirir mitjançant un instrument Keyence BZ-X700. La quantificació de l'expressió CD68 es descriu a Mètodes suplementaris.
Els MEF que expressaven Gal-3-GFP es van tacar mitjançant un anticòs anti-Hsc70 (Enzo Life Sciences, Farmingdale, NY) i es van fer imatges tal com es va descriure anteriorment.53
Microscòpia de fluorescència FL de reflexió interna total
WT i Ctns–/–MEF que expressava Gal-3-GFP i CTNS-DsRed es van sembrar en un plat de fons de borosilicat de 4-cambra 35- mm (Cellvis, Mountain View, CA). Després de 2 dies en cultiu, els MEF es van analitzar mitjançant microscòpia de fluorescència FL de reflexió interna total, tal com es va descriure anteriorment.54i en Mètodes Suplementaris. Les imatges es van analitzar mitjançant el programari ImageJ.
Anàlisi de l'expressió Gal-3
Cèl·lules 293T que expressen Gal-3–GFP, Gal-3–GFP i DsRed, o Gal-3–GFP i CTNS-DsRed i explantadesronyonses van lisar en un tampó d'assaig de radioimmunoprecipitació que contenia un còctel d'inhibidors de proteïnases. Les proteïnes es van separar en un gel del 4% al 15% i es van revelar mitjançant anticossos anti-Gal-3 (Abcam, Cambridge, Regne Unit) o anti-gliceraldehid-3-fosfat deshidrogenasa (Cell Signaling Technology, Danvers, MA) .
Ronyonses van homogeneïtzar en tampó RLT que contenia b-mercaptoetanol mitjançant Precellys 24 (Bertin Instruments, Montigny-le-Bretonneux, França). Es va aïllar l'ARN i es va realitzar una reacció en cadena de la polimerasa digital de gotes específica de Gal-3 tal com es descriu a Mètodes suplementaris. L'expressió de transcripció de Gal-3 es va expressar com a proporció en comparació amb el control endogen 18S. Es va utilitzar un assaig immunoabsorbent lligat a enzims (Abcam) per detectar el nivell de Gal-3 en ratolins i sèrums humans, segons les instruccions del fabricant.
Funció renal
Els nivells de fosfat sèric i d'orina, creatinina sèrica i urea es van estimar mitjançant el kit d'assaig de fosfats QuantiChrom, el kit de creatinina Quanti Chrom i el kit d'assaig d'urea QuantiChrom (BioassaySystems, Hayward, CA). Els nivells de proteïnes a l'orina es van mesurar mitjançant el kit d'assaig de proteïnes Pierce BCA (Rockford, IL).
Histologia
En el moment en què es van matar els ratolins,ronyonses van recollir, es van fixar en formalina i es van incrustar en parafina. Les seccions tacades amb hematoxilina i eosina van ser revisades de manera cega per la doctora Marie Claire Gubler tal com es descriu als mètodes suplementaris.
Mesura del contingut de cistina
La mesura de la cistina tissular es va realitzar mitjançant espectrometria de masses (LC-ESI-MS/MS) tal com es va descriure anteriorment.39
Nefrectomia estàndard i operació simulada
La CKD dels ratolins va ser induïda per l'operació de nefrectomia en fase 2-subtotal estàndard tal com es va descriure anteriorment.55,56El grup simulat de ratolins es va sotmetre al mateix procediment però sense tallar-ne capronyóteixit.
Nivell de citocines al sèrum
Per mesurar els nivells de citocines en sèrum de ratolí, un ratolíinflamacióLa matriu de perles citomètriques del kit (BD Biosciences, San Jose, CA) es va realitzar segons les instruccions del fabricant. La concentració de MCP-1 en sèrum humà es va determinar mitjançant un assaig immunoabsorbent lligat a enzims dirigit contra MCP-1 (Abcam, Cambridge, Regne Unit) segons les instruccions del fabricant.
Anàlisi estadística
Els valors s'expressen com a mitjana - SEM. La importància del resultat es va avaluar mitjançant la prova t de 2-cua no aparellada o la prova t de cua 2-no aparellada amb la correcció de Welch. Es van fer comparacions de grup de 3 condicions o més amb anàlisis paramètriques de variància, seguides de la prova de comparacions múltiples de Tukey per a comparacions per parelles. Les puntuacions histològiques es van comparar mitjançant la prova de Mann-Whitney. Les anàlisis es van realitzar mitjançant el programari Prism 6 (GraphPad, San Diego, CA). Un valor P inferior a 0,05 es va considerar significatiu.
Aprovació de l'estudi
Els experiments amb ratolins es van dur a terme d'acord amb els protocols del Comitè d'Ús Institucional d'Animals. L'ús de teixit humà en aquest estudi va ser aprovat per la Universitat de Califòrnia, San Diego, HumanResearch Protections Program.
DIVULGACIÓ
SC és membre del Consell Científic i membre del Patronat de lacistinosiFundació Recerca. SC és cofundador, accionista i membre tant del consell científic com del consell d'administració de GenStem TherapeuticsInc. Els termes d'aquest acord han estat revisats i aprovats per la Universitat de Califòrnia-San Diego d'acord amb les seves polítiques de conflicte d'interessos. Tots els altres autors no van declarar interessos en competència.
proporcionant el Gal-3–/–ratolins. Donem les gràcies a Lou Devanneaux i NicholeFlerchinger per la seva ajuda tècnica i a Elizabeth Souter per revisar el manuscrit. Agraïm a Christopher Alfonso de BDBioscience per proporcionar el ratolíinflamaciómatriu de perles citomètriques i per la seva ajuda en la interpretació dels resultats. Aquest treball va comptar amb el suport de les subvencions dels National Institutes of Health RO1-DK090058 i R01-DK110162, elCistinosiResearch Foundation i l'Institut de Medicina Regenerativa de Califòrnia (CIRM, CLIN-09230). TL compta amb el suport d'una beca de postgrau de Vaincre Les MaladiesLysosomales. AB i JZ compten amb el suport d'una beca de lacistinosiFundació Recerca. UCSD Neuroscience MicroscopyShared Facility va ser finançat per la subvenció P30-NS047101 de l'Institut Nacional de Trastorns Neurològics i Ictus (NINDS).
REFERÈNCIES
1. Medzhitov R. Origen i rols fisiològics deinflamació. Naturalesa. 2008;454:428–435.
2. Donar el MEU. Orientacióinflamacióen el tractament de la diabetis tipus 2. Diabetis Obes Metab. 2013;15(suppl 3):193–196.
3. Jaffer U, Wade RG, Gourlay T. Citocines en la síndrome de resposta inflamatòria sistèmica: una revisió. HSR Proc Cures Intensives Cardiovasc Anesth. 2010;2:161–175.
4. Pecoits-Filho R, Heimburger O, Barany P, et al. Associacions entre marcadors inflamatoris circulants i funció renal residual en pacients amb CRF. Sóc JRonyóDis. 2003;41:1212–1218.
5.Gahl WA, Thoene JG, Schneider JA.Cistinosi. N Engl J Med. 2002;347: 111–121.
6.Cherqui S, Kalatzis V, Trugnan G, Antignac C. The targeting ofcistinosinaa la membrana lisosomal requereix un senyal basat en tirosina i un nou motiu de classificació. J Biol Chem. 2001;276:13314–13321.
7. Kalatzis V, Cherqui S, Antignac C, Gasnier B.Cistinosina, la proteïna defectuosa encistinosi, és un transportador de cistina lisosomal impulsat per H( ). EMBO J. 2001;20:5940–5949.
8. Cherqui S, Courtoy PJ. La síndrome de Fanconi renal acistinosi: coneixements patògens i perspectives terapèutiques. Nat Rev Nephrol. 2017;13:115–131.
9. Nesterova G, Gahl W. Nefropàticcistinosi: complicacions tardanes d'una malaltia multisistèmica. Pediatr Nefrol. 2008;23:863–878.
10. Cherqui S, Sevin C, Hamard G, et al. Manca d'acumulació de cistina intralisosomal en ratolinscistinosina, la proteïna defectuosa encistinosi. Mol Cell Biol. 2002;22:7622–7632.
11. Nevo N, Chol M, Bailleux A, et al. Fenotip renal de lacistinosiEl model de ratolí depèn del fons genètic. Trasplantament de Nephrol Dial. 2010;25:1059–1066.
12. Kalatzis V, Serratrice N, Hippert C, et al. Les anomalies oculars en acistinosimodel animal imite la patogènesi de la malaltia. Pediatr Res. 2007;62:156–162.
13. Guia Chevronnay HP, Janssens V, Van Der Smissen P, et al. Un model de ratolí suggereix dos mecanismes per a les alteracions de la tiroides en nenscistinosi: disminució de la síntesi de tiroglobulina a causa de l'estrès del reticle endoplasmàtic/resposta proteica desplegada i deteriorament del processament lisosomal. Endocrinologia. 2015;156:2349–2362.
14. Brodin-Sartorius A, Tete MJ, Niaudet P, et al. La teràpia amb cisteamina retarda la progressió de la nefropatiacistinosien adolescents tardans i adults.RonyóInt. 2012;81:179–189.
15. Cherqui S. Teràpia de cisteamina: un tractament percistinosi, no és una cura.RonyóInt. 2012;81:127–129.
16. Gahl WA, Balog JZ, Kleta R. Nephropathiccistinosien adults: història natural i efectes de la teràpia oral amb cisteamina. Ann Intern Med. 2007;147:242–250.
17. Cherqui S, Courtoy PJ. La síndrome de Fanconi renal acistinosi: coneixements patògens i perspectives terapèutiques. Nat Rev Nephrol. 2017;13:115–131.
18. Napolitano G, Johnson JL, He J, et al. El deteriorament de l'autofàgia mediada per chaperones condueix a defectes selectius de degradació lisosomal en la malaltia d'emmagatzematge lisosomalcistinosi. EMBO Mol Med. 2015;7:158–174.
19. Andrzejewska Z, Nevo N, Thomas L, et al.Cistinosinaés un component del complex vacuolar H-ATPasa-regulador-drap que controla l'objectiu dels mamífers de la senyalització del complex 1 de rapamicina. J Am Soc Nephrol. 2016;27: 1678–1688.
20. Rega LR, Polishchuk E, Montefusco S, et al. L'activació del factor de transcripció EB rescata anomalies lisosòmiques en cistinòticsronyócèl · lules.RonyóInt. 2016;89:862–873.
21. Dumic J, Dabelic S, Flogel M. Galectin-3: una història de final obert. Biochim Biophys Acta. 2006;1760:616–635.
22. Sciacchitano S, Lavra L, Morgante A, et al. Galectina-3: una molècula per a un alfabet de malalties, de la A a la Z. Int J Mol Sci. 2018;19(2).
23. Calvier L, Martinez-Martinez E, Miana M, et al. L'impacte de la inhibició de la galectina-3 en les lesions cardíaques i renals induïdes per l'aldosterona. Insuficiència cardíaca JACC. 2015;3:59–67.
24. Frenay AR, Yu L, van der Velde AR, et al. La inhibició farmacològica de la galectina-3 protegeix contra la nefropatia hipertensiva. Am J Physiol Renal Physiol. 2015;308:F500–F509.
25. Kolatsi-Joannou M, Price KL, Winyard PJ, Long DA. La pectina de cítrics modificada redueix l'expressió de galectina-3 i la gravetat de la malaltia en experiments agutsronyólesió. PloS One. 2011;6:e18683.
26. Martinez-Martinez E, Ibarrola J, Clavier L, et al. El bloqueig de la galectina-3 redueix la fibrosi renal en dos models experimentals normotensos de dany renal. PloS One. 2016;11:e0166272.
27. Nevo N, Thomas L, Chhuon C, et al. Impacte decistinosiglicosilació sobre l'estabilitat de proteïnes mitjançant marcatge d'isòtops estables dinàmics diferencials per aminoàcids en cultiu cel·lular (SILAC). Proteòmica de cèl·lules Mol. 2017;16:457–468.
28. Napolitano G, Johnson JL, He J, et al. El deteriorament de l'autofàgia mediada per chaperones condueix a defectes selectius de degradació lisosomal en la malaltia d'emmagatzematge lisosomalcistinosi. EMBO Mol Med. 2015;7:158–174.
29. Majeski AE, Dice JF. Mecanismes de l'autofàgia mediada per chaperones. Int J Biochem Cell Biol. 2004;36:2435–2444.
30. Xie W, Zhang L, Jiao H, et al. L'autofàgia mediada per chaperones prevé l'apoptosi degradant BBC3/PUMA. Autofàgia. 2015;11:1623–1635.
31. Li X, Ma Q, Wang J, et al. Les tirosina cinases c-Abl i Arg regulen la degradació lisosomal de l'oncoproteïna galectina-3. La mort cel·lular difereix. 2010;17:1277–1287.
32. Takeuchi H, Tanaka M, Tanaka A, et al. El predomini dels macròfags polaritzats M2-en el càncer de bufeta afecta l'angiogènesi, el grau del tumor i la invasivitat. Oncol Lett. 2016;11:3403–3408.
33.Chavez-Galan L, Olleros ML, Vesin D, Garcia I. Molt més que els macròfags M1 i M2, també hi ha macròfags CD169( ) i TCR( ). Front Immunol. 2015;6:263.
34. Henderson NC, Sethi T. La regulació deinflamacióper galectina-3. Immunologic Rev. 2009;230:160–171.
35. Deshmane SL, Kremlev S, Amini S, Sawaya BE. Proteïna quimioatraient monòcits-1 (MCP-1): una visió general. J Interferó Citocina Res. 2009;29:313–326.
36.Skowyra ML, Schlesinger PH, Naismith TV, Hanson PI. El reclutament activat de maquinària ESCRT promou la reparació endolisosomal. Ciència. 2018;360(6384).
37.MacKinnon AC, Farnworth SL, Hodkinson PS, et al. Regulació de l'activació alternativa dels macròfags per galectina-3. J Immunol. 2008;180: 2650–2658.
38. Sano H, Hsu DK, Yu L, et al. La galectina humana-3 és un nou quimioatractiu per als monòcits i els macròfags. J Immunol. 2000;165:2156–2164.