Contacte:joanna.jia@wecistanche.com/ WhatsApp: 008618081934791

La deficiència del factor de transcripció mitocondrial A dirigit a l'epiteli renal provoca un esgotament mitocondrial progressiu associat a la malaltia quística greu--Part I

Ken Ishii^1,2,11 et al

La funció mitocondrial anormal és una característica ben reconeguda de les agudes i les cròniquesronyó malalties. Per conèixer el paper dels mitocondrisronyóhomeòstasi i patogènesi, ens vam dirigir al factor de transcripció mitocondrial A (TFAM), una proteïna necessària per a la replicació i transcripció de l'ADN mitocondrial que té un paper fonamental en el manteniment de la massa i la funció mitocondrial. Examinar les conseqüències de la interrupció de la funció mitocondrial aronyócèl·lules epitelials, vam inactivar TFAM a l'homeobox relacionat amb sine oculis 2-expressantronyócèl·lules progenitores. La deficiència de TFAM va provocar una disminució significativa de l'expressió gènica mitocondrial, l'esgotament mitocondrial, la inhibició de la maduració de la nefrona i el desenvolupament d'una malaltia quística postnatal severa, que va provocar una mort prematura. Això es va associar amb una morfologia mitocondrial anormal, una reducció del consum d'oxigen i un augment del flux glicolític. A més, vam trobar que l'expressió de TFAM es va reduir en murí i humàronyons poliquístics, que va anar acompanyada d'esgotament mitocondrial. Així, les nostres dades suggereixen que la desregulació de l'expressió de TFAM i l'esgotament mitocondrial són característiques moleculars deronyómalaltia quística que pot contribuir a la seva patogènesi.

PARAULES CLAU: glucòlisi; desenvolupament renal; mitocondris;malaltia poliquística del ronyó; TFAM

cistancheés bo permalaltia poliquística del ronyó

Declaració translacional

Hem utilitzat la genètica del ratolí per entendre el paper de la disfunció mitocondrialronyóhomeòstasi. La inactivació del factor de transcripció mitocondrial A (TFAM) a les cèl·lules progenitores epitelials homeobox 2 relacionades amb sine oculis va donar lloc arenalfracàsa causa de greusronyó poliquístic malaltia. Els nostres resultats demostren que la disfunció mitocondrial progressiva s'associa amb una diferenciació epitelial defectuosa irenalcistogènesi. A més, vam establir que l'expressió de TFAM i el nombre mitocondrial es van reduir en humansronyó poliquísticteixit. Els nostres estudis suggereixen que les estratègies terapèutiques, que tenen com a objectiu millorar la salut mitocondrial, poden ser beneficioses en el tractament de pacients amb autosòmica dominant.ronyó poliquísticmalaltia.

La disfunció mitocondrial (mt) és una característica patològica ben reconeguda deronyó malaltiesi pot desencadenar lesions cel·lulars, inflamació i fibrosi.1 En elronyó, les cèl·lules epitelials tubulars depenen molt del trifosfat d'adenosina (ATP) generat a partir de la fosforilació oxidativa (OXPHOS) perquè realitzen múltiples funcions de transport epitelial que consumeixen energia. Per tant, el sosteniment de la producció eficient d'ATP mt és essencial per a la funció renal normal i l'homeòstasi sistèmica d'electròlits. A més, les evidències recents indiquen que els mitocondris tenen un paper important en la regulació gènica, la senyalització cel·lular i la diferenciació cel·lular mitjançant la generació de metabòlits intermediaris i espècies reactives d'oxigen (ROS).2 Malgrat aquests avenços, el paper de la senyalització mt en la patogènesironyómalaltiesno s'entén bé.

Per investigar la funció mt arenalhomeòstasi i patogènesi, ens vam dirigir al factor de transcripció mitocondrial A (TFAM). TFAM és un factor codificat nuclear essencial per a la funció mt, el manteniment del nombre de còpies mt i l'estabilitat estructural de l'ADN mt perquè regula la replicació i transcripció del genoma mt mitjançant la flexió de l'ADN del promotor3,4. L'ADN mt de mamífers conté 37 gens, 13. dels quals codifiquen subunitats proteiques del complex de la cadena respiratòria, 22 codifiquen ARN de transferència i 2 ARN ribosòmics.3 Així, TFAM està directament implicat en la regulació del transport d'electrons mt i en la síntesi d'ATP mitjançant la transcripció de gens com el citocrom b codificat mitocondrial ( MT-CYB), la subunitat 1 de la citocrom c oxidasa codificada mitocondrialment (MT-CO1) i la subunitat 6 de membrana ATP sintasa codificada mitocondrialment (MTATP6).3,5 Sense TFAM, les cèl·lules perden la seva capacitat de produir ATP mitjançant OXPHOS, no poden generar quantitats significatives de mt. Els estudis genètics han demostrat que TFAM és essencial per a l'embriogènesi normal perquè la inactivació global de Tfam homozigot va donar lloc a una inactivació intrauterina. la letalitat el dia 10,5 embrionari, mentre que la deficiència heterozigota, tot i que va reduir el nombre de còpies de mt en un 40% i va provocar una deficiència de la cadena respiratòria, no va conduir a la letalitat embrionària.6 Per tant, l'orientació genètica de TFAM és una estratègia experimental útil per examinar el paper. de la disfunció progressiva de la mt en la diferenciació cel·lular i l'homeòstasi dels teixits. La inactivació condicional específica del tipus cel·lular de Tfam va suggerir que la generació d'OXPHOS i/o mt ROS és fonamental per a la diferenciació cel·lular, la funció i la fisiologia normal.6–10

Es poden presentar trastorns primaris de mt deguts a mutacions del gen nuclear o mtronyó malaltiamés comunament es manifesta com a lesió tubulointersticial o disfunció tubular aïllada.11,12 Encara que està implicada en la patogènesi de certes malalties humanes com els trastorns neurodegeneratius,13 mutacions específiques en TFAM causenrenalmalaltia no s'ha informat. Més recentment, la reducció de l'expressió de TFAM s'ha relacionat amb la crònicaronyómalaltia. La pèrdua de la integritat de la mt a causa de la inactivació de Tfam va causar malaltia tubulointersticial irenal fracàsen ratolins, que es va deure en part a l'activació de la GMP-AMP sintasa cíclica (cGAS) induïda per l'estrès de l'ADN mt, estimulador dels gens d'interferó (STING) de les respostes inflamatòries depenents.14

Aquí informem que els ratolins amb inactivació condicional de Tfam a l'homeobox 2 (SIX2) relacionat amb sine oculis, que expressen cèl·lules progenitores de nefrona15, desenvolupen una malaltia quística severa i moren prematurament a causa derenalfracàscom a ratolins joves.Tfam^-/- Els ratolins es van caracteritzar per defectes en la maduració de la nefrona, que es va associar amb l'esgotament de la mt, una reducció d'OXPHOS i un canvi metabòlic cap a la glucòlisi enTfam^-/- renalepiteli. Donada la gravetat de la malaltia quística aTfam^-/- ratolins, vam analitzar 2 models de ratolíronyó poliquísticmalaltia(PKD), que resulten de mutacions en qualsevol de les policistines-1 (PKD(malaltia poliquística del ronyó)1) o cistina-1 (Cys1), així com teixits humans de pacients amb malaltia renal poliquística autosòmica dominant (ADPKD). Ho establimTfam^-/- està desregulat en quists tant de PKD murina com humana(malaltia poliquística del ronyó), teixits. En conjunt, els nostres estudis suggereixen que la desregulació de TFAM i l'esgotament de mt són trets característics derenalmalalties quístiques i poden tenir un paper contributiu en la seva patogènesi.

cistancheés bo permalaltia poliquística del ronyó

RESULTATS

La inactivació de Tfam a les cèl·lules del llinatge SIX2 provoca una malaltia quística greu que resulta enrenalfracàsPer tal d'investigar la funció mt alrenalepiteli, vam inactivar Tfam en SIS2-cèl·lules progenitores que expressen, que donen lloc a tots els segments de nefrona, excepte el conducte col·lector (CD).15 Per a això, vam creuar l'al·lel Tfam floxed amb ratolins transgènics de cromosomes artificials bacterians que expressen una proteïna fluorescent verda millorada/proteïna de fusió de la recombinasa Cre (eGFP/Cre) sota control transcripcional del promotor Six2 (figura 1a).Sis2-eGFP/Cretg/^{tg plus}; Tfam^fl/fl) a partir d'aquí es coneix com a Sis2-Tfam^-/- mutants. Sis2-Tfam^-/- Els ratolins van néixer amb les proporcions mendelianes esperades i no es van distingir dels controls de camada Cre per inspecció visual al néixer. Tanmateix, les diferències de pes corporal entre Sis2-Tfam^-/- Els mutants i els controls de parella Cre es van fer evidents el dia postnatal (P) 14 (5,7 més -0,3 g per als mutants vs. 7,5 més -0,3 g per als controls, n=4 cadascun, P =0.004; Taula complementària S1). Sis2-Tfam^-/- Els ratolins mutants es van caracteritzar per augmentar-losronyonsen comparació amb els controls (ronyóràtio de pes corporal de l'1,45 per cent més -0,19 per cent per als mutants versus 0,60 per cent més - 0,02 per cent per al control, n {{8} } cadascun, P < 0,001;="" figura="" 1b,="" taula="" suplementària="" s1)="" i="" va="" morir="" entre="" els="" 20="" i="" els="" 30="" anys="" (figura="" 1b).="" es="" va="" associar="" amb="" la="" letalitat="" juvenil="" de="" la="" cohort="">renalfracàsd'una malaltia quística greu amb nivells de nitrogen ureic en sang de 68,40 més -5,32 mg/dl per als ratolins mutants versus 16.8 2.0 mg/dl per als controls ( n= 6 i 7, respectivament; P <0,0001; figura="" 1b="" i="" c).="" a="" més,="" six2-tfam/mutants="" van="" desenvolupar="" una="" albuminúria="" important="" (proporció="" d'albúmina/creatinina="" d'orina="" 43,58="" més="" -362,475,18="" mg/g="" en="" six{2-tfam/mutants="" enfront="" de="" 3,39="" mg/g="" en="" controls="" a="" p14,="" n="6" i="" 10="" respectivament;="" p=""><0,0001). això="" és="" coherent="" amb="" el="" patró="" d'expressió="" de="" la="" recombinasa="" cre="" a="" les="" cèl·lules="" progenitores="" de="" la="" nefrona="" six2,="" que="" donen="" lloc="" a="" un="" mesènquima="" derivat="" del="">renaltúbuls i podòcits.15 A diferència de Sis2-Tfam^-/- mutants, els ratolins amb deficiència heterozigota de Tfam a les cèl·lules progenitores SIX2 es van desenvolupar amb normalitat, eren fèrtils i no es van desenvolupar obertament.ronyómalaltia(Figura suplementària S1).

Figura 1|La inactivació de Tfam a les cèl·lules del llinatge SIX2 provoca una malaltia quística greu i una insuficiència renal. ( a ) Un esquema que il·lustra l'enfocament experimental i la ubicació de les seqüències dirigides dins de l'al·lel floxed Tfam. Anàlisi de la reacció en cadena de la polimerasa de l'ADN renal genòmic total aïllat del control de la camada (Cre) i Six2-Tfam^-/-ratolins a l'edat del dia postnatal (P) 7; l'al·lel floxed Tfam no recombinant es denota per 2-lox (2); l'al·lel recombinat per 1-lox, l'al·lel de tipus salvatge per wt; þ o - indiquen la presència o absència del transgen Six2-eGFP/Cre. (b) Panells esquerre, fotografies de ronyons del control Cre i Six2-Tfam^-/- ratolins als 20 anys. El pes del ronyó (KW) s'expressa com a percentatge del pes corporal (PC) (n= 4–14). Panells de la dreta, nivells de nitrogen ureic en sang (BUN) a Cre Littermate Control (co) i Six2-Tfam^-/-ratolins a l'edat P7 (n=7 i 6, respectivament) i corbes de supervivència de Kaplan-Meier per al control Cre i Six2-Tfam^-/- ratolins en comparació amb la prova de rang logarítmic (n=10–13). (c) Imatges representatives de seccions de ronyó fixades amb formalina i incrustades en parafina del control Cre i Six2-Tfam^-/-ratolins d'edat P7 i P29 tenyits amb hematoxilina i eosina (H&E) i analitzats per immunohistoquímica per a l'actina del múscul llis (ACTA2) i l'antigen de diferenciació de clústers (CD) 31. Els signes numèrics representen estructures quístiques i els asteriscs representen els glomèruls. Barres d'¼ d'1 mm per a seccions transversals senceres del ronyó, 100 mm per a imatges H&E d'alta potència i 50 mm per a imatges IHC. Les dades s'expressen com a més mitjà - SEM i es van analitzar mitjançant la 2-prova t de Student amb cua. ***P <0,001. per="" optimitzar="" la="" visualització="" d'aquesta="" imatge,="" consulteu="" la="" versió="" en="" línia="" d'aquest="" article="" a="">

L'anàlisi de Sis2-Tfam^-/- els ratolins, que també expressaven l'al·lel reporter ROSA26-ACTB-tdTomato, -eGFP Cre, aquí denominat Six2-mT/mG;Tfam^-/- ratolins, cosa que indica que la gran majoria de les estructures quístiques enTfam^-/- els ronyons es van derivar de cèl·lules amb antecedents d'expressió Six2-eGFP/Cre (figura suplementària S2). Quistes en sis2-Tfam^-/- ronyonsva mostrar evidències de proliferació, tal com ho demostra la presència de cèl·lules epitelials de revestiment de quists Ki67-positives (de mitjana un 40 per cent de totes les cèl·lules epitelials de revestiment de quists), mentre que les cèl·lules positives per a la caspasa escindida 3 no es van detectar dins dels quists (figura suplementària S3). ). Aquestes troballes són coherents amb l'augment dels nivells de cinasa regulada per senyal extracel·lular fosforilada (p-ERK) i b-catenina a Six2-Tfam^-/- teixit renal (figura suplementària S3). En conjunt, les nostres dades indiquen que Sis2-Tfam^-/- els ronyons presenten característiques moleculars que s'associen amb freqüènciarenalmalalties quístiques.

Figura 3 |Tfam^-/-els quists no expressen marcadors comuns específics del segment de nefrona. (a) Imatges representatives de seccions de ronyó incrustades en parafina fixades en formalina de Six 2-mT/mG;Tfam^-/-mice at age postnatal day (P) 14 stained for enhanced green fluorescent protein (eGFP), megalin, uromodulin, thiazide-sensitive sodium chloride cotransporter (NCC), and aquaporin 2 (AQP2) by immunofluorescence (IF). 4',6-diamidino-2-phenylindole was used for nuclear staining (blue fluorescence). Arrows depict tubular structures expressing respective nephron segment-specific markers. Nephron segment marker expression was assessed in cysts with a maximal diameter of >50 mm. (b) Imatges representatives de seccions de ronyó fixades amb formalina i incrustades en parafina de Six 2-mT/mG;Tfam^-/-ratolins a l'edat de P14 tenyits per a eGFP i uromodulina per IF. Els asteriscs representen quists amb uromodulina intraluminal. La presència d'uromodulina intraluminal es va examinar en quists amb un diàmetre màxim de 50-100μm o en quists de més de 100 mm de diàmetre màxim. Barres=(a,b) 100 mm. Per optimitzar la visualització d'aquesta imatge, consulteu la versió en línia d'aquest article awww.kidney-international.org.

cistancheés bo perronyó

La maduració de la nefrona és defectuosa a Six2-Tfam^-/-ratolins

Com que poden passar fins a diverses setmanes abans que els ratolins amb inactivació de Tfam específica del teixit desenvolupin una patologia,17 a continuació vam examinar el curs temporal derenaldesenvolupament de la malaltia a Sis2-Tfam^-/-ratolins. Vam recollir ronyons de ratolins control i mutants a les edats P{0}}, P7 i P14 i vam utilitzar mètodes histològics, tinció d'immunofluorescència (IF) i anàlisi de l'expressió gènica en el seu conjunt.ronyóextractes per a la valoració. La tinció IF de SIX2 i E-cadherina a l'edat P0 va demostrar que els ronyons de control i Six2-Tfam^-/-eren histològicament semblants. La formació d'estructures de zones nefrogèniques corticals, com el mesènquima de la tapa SIX2+, les puntes ureteres que expressen E-cadherina i les estructures de nefrona naixents com ararenalles vesícules i els cossos en forma de coma i S no es van bloquejar a Sis2-Tfam^-/-ronyons (figura 2a). Aquestes troballes histològiques eren coherents amb els nivells d'expressió dels gens que codifiquen marcadors nefrogènics. Sis2, caixa aparellada 2 (Pax2), proteïna homeobox LIM 1 (Lhx1) i els nivells d'ARNm del factor de transcripció 1 de tipus spalt (Sall1) no eren significativament diferents entre el control i Six2-Tfam^-/- ratolins en totalronyóhomogeneïtzades de P0ronyons(Figura 2b). Això va suggerir que la inactivació de TFAM en els progenitors de la nefrona SIX2 no va afectar significativament la formació d'estructures nefrogèniques.

Tot i que la formació de l'estructura de la nefrona naixent no es va inhibir, la tinció amb blau alcià/àcid periòdic-Schiff i lectina de tetragonolobus de lotus va indicar una maduració terminal defectuosa de la nefrona a Six2-Tfam^-/-ratolins a l'edat P{{0}}. El blau alcià/àcid periòdic-Schiff, que tenyeix les membranes del soterrani tubular i la vora del pinzell, i la lectina de tetragonolobus de lotus, que identifica oligosacàrids específics a la vora del raspall de les cèl·lules del túbul proximal, es van reduir en els ronyons mutants. La figura 2c mostra la tinció de Schiff blau alcià/àcid periòdic als punts de temps P 0, P7 i P14. La histoquímica de la lectina de Lotus tetragonolobus i la tinció d'IF per a la proteïna del tumor 1 de Wilms als punts de temps P{{10}}, P7 i P14 es mostren a la figura suplementària S4. A l'edat P0, l'àrea relativa que es va tacar positivament amb la lectina de lotus tetragonolobus era del 2,10 per cent, 0,51 per cent i {{30}},39 per cent 0,1 per cent a l'edat P7 versus 6,25 per cent 0,28 per cent i 6,2 per cent 1,1 per cent per als controls, respectivament (n=3-4, P=0,0004 i 0,0007, respectivament; figura suplementària S4). En coherència amb aquestes troballes histològiques és la disminució significativa de l'expressió de gens que codifiquen marcadors específics del segment glomerular i nefrona podocina, nefrina, aquaporina 1 (Aqp1), cotransportador de fosfat de sodi 2a (NaPi2a), uromodulina, cotransportador de clorur de sodi i potassi 2 ( Nkcc2) i cotransportador de clorur de sodi sensible a la tiazida (Ncc) a Six2-Tfam^-/-ratolins (figura 2b). En conjunt, aquestes dades suggereixen que Sis2-Tfam^-/- ronyonspresenten una reducció progressiva del nombre de segments de nefrona proximal madur i glomèruls.

Com que l'activitat de Six2-eGFP/Cre dóna lloc a segments de nefrona derivats del mesenquima de la tapa amb deficiència de TFAM, vam predir que la maduració de les cèl·lules epitelials CD, que són derivades del brot uretèric, no es veuria afectada en Six{{2} }Tfam^-/-ronyons. D'acord amb aquesta noció és que la tinció amb aglutinina de Dolichos biflorus, que reacciona amb N-acetil-D-galactosa al túbul distal i al CD, va indicar una sobrerepresentació relativa de les estructures positives de l'aglutinina de Dolichos biflorus a Six2-Tfam^-/-ronyons. A l'edat P7, les àrees tacades positivament per a l'aglutinina de Dolichos biflorus comprenien el 13,91% 0,9% de l'àrea total de mutants enfront de l'1,93% 0,1% per al control (n ¼ 3, P ¼ { {10}}.0002; Figura suplementària S4). L'expressió d'ARNm de la subunitat alfa epitelial 1 del canal de sodi (Scnn1a) o aquaporina 2 (Aqp2), que s'expressen a les cèl·lules epitelials CD, no es va reduir significativament en comparació amb el control (figura 2b). En contrast amb Sis2-Tfam^-/-ronyons, inactivació de Tfam a les cèl·lules progenitores de l'homeobox B7 (HOXB7), que donen lloc a cèl·lules epitelials CD, donant lloc a la pèrdua d'expressió del marcador de nefrona CD i una dilatació tubular lleu però no cistogènesi (figura suplementària S5). En conjunt, les nostres dades indiquen que la pèrdua de la funció TFAM a les cèl·lules progenitores SIX2 no bloqueja el desenvolupament d'estructures de nefrona naixent, sinó que inhibeix la maduració terminal de la nefrona.

Tfam^-/-els quists són deficients en marcadors comuns del segment de nefrona

Caracteritzar l'origen histogenètic deTfam^-/- renalquists, vam realitzar anàlisis de FITfam^-/- ronyonsat age P14 and examined the expression of nephron segment markers megalin (proximal tubule), uromodulin (medullary thick ascending limb of Henle), thiazide sensitive sodium chloride cotransporter (distal tubule), and aquaporin 2 (CD). The majority of cysts with a maximal diameter of >50 mm did not express these segment-specific markers, indicating a lack of cellular differentiation (Figure 3a, Supplementary Figure S6). Furthermore, approximately 50% of cysts with a maximal diameter of >50 mm es van caracteritzar per dipòsits intraluminals d'uromodulina, que van suggerir l'origen a partir de segments de nefrona distals al túbul proximal i al bucle descendent de Henle (figura 3b).

Anormalitats progressives en la funció i la morfologia de la mtTfam^-/- cèl · lules epitelials

Per caracteritzar el curs temporal de les conseqüències metabòliques de la supressió de Tfam, primer vam examinar els nivells d'ARNm de Tfam i mt-Co1, mt-Cyb i mt-Atp6 regulats per TFAM aTfam^-/- ronyonsa les edats P0, P7 i P14. Com era d'esperar, els nivells d'ARNm de Tfam, mt-Co1, mt-Cyb i mt-Atp6 es van reduir significativament (figura 4a).Tfam^-/-les cèl·lules epitelials etiquetades amb eGFP (Sis {{{0}}mT/mG; Tfam / ratolins) van mostrar una reducció significativa de l'expressió de proteïna MT-CO1 (figura suplementària S7). El nombre de còpies d'ADN mt es va reduir en un 63 per cent, cosa que és coherent amb l'esgotament de mt, un segell distintiu de la deficiència de TFAM (figura 4a). En canvi, l'expressió dels gens nuclears que codifiquen el dinucleòtid de nicotinamida adenina: la subunitat central 3 de la ubiquinona oxidoreductasa (Ndufs3) i la subunitat de flavoproteïna A del complex de succinat deshidrogenasa (Sdha) no es va veure afectada a l'edat P0, però es va reduir a l'edat P7 i P14 (Figura 4a). Aquestes troballes de l'anàlisi del gen mt i de les proteïnes són coherents amb la pèrdua progressiva del nombre de còpies mt a Tfam / epiteli.

A continuació, vam investigar els efectes metabòlics de la inactivació de Tfam a les cèl·lules epitelials del túbul proximal primària (PTEC) aïllades a l'edat P7.Tfam^-/- Els PTEC van mostrar reduccions significatives en les taxes de consum basal d'oxigen (40,77 4,10 per als mutants vs. 61,75 5,18 pmol/min/104 cèl·lules per als controls, n=3 cadascun, P =0.034), respiració lligada a ATP (33.11 3.91 per a mutants vs. 46.92 4.91 pmol/min/104 cèl·lules per a controls, n{{18} } cadascun, P=0.093), respiració màxima (116.8 14.19 per a mutants vs. 225.{5 13.55 pmol/min/104 cèl·lules per a controls, n{{{ 28}} cadascun, P=0,005) i capacitat respiratòria de recanvi (76,05 10,18 per als mutants vs. 163,7 8,61 pmol/min/104 cèl·lules per als controls , n =3 cadascun, P=0,003; Figura 4b).

Per caracteritzar encara més el grau d'esgotament i dany de la mt, vam examinarTfam^-/- ronyonsmitjançant microscòpia electrònica de transmissió i microscòpia d'il·luminació estructurada {{{0}}dimensional (3D SIM). A l'edat de 7 anys, els mitocondris presentaven formes irregulars i globus, que són coherents amb les troballes anteriors en ratolins eliminatoris de Tfam. L'anàlisi microscòpica electrònica de transmissió va indicar que les anomalies estructurals dels mitocondris, com ara l'augment de la mida i les crestas anormals, van progressar postnatalment perquè les diferències morfològiques entre els mutants i el control eren menys evidents a l'edat P0 i es van tornar més greus amb l'edat (figura 4c). ). La SIM 3D es va utilitzar per examinar el volum de mt i la mida de la xarxa en Sis2-mT/mG; Tfam / mutants en comparació amb ratolins control Six2-mT/mG a l'edat de 7 anys; El volum mt es va mesurar en seccions transversals de 5 a 8 túbuls per secció, examinant de 25 a 4 0 cèl·lules epitelials corticals positives per a eGFP tenyides per al canal 1 selectiu d'anions depenent del voltatge mitjançant tinció IF. Vam trobar que el volum total de mt per cèl·lula positiva eGFP va disminuir significativament (62,66 16,46 mm3/cel·la per als mutants vs. 177,4 30,17 mm3/cel·la per als controls, n ¼ 3 cadascun , P ¼ 0.0289) i es va associar amb un canvi en la proporció de volum total de mt per volum total de cel·la de 0,230 0,01 en controls a 0.{{ 33}},016 en Six2-Tfam / mutants (n ¼ 3 cadascun, P ¼ 0,0017; figura 4c). La mida màxima de la xarxa mt, que mesura la xarxa mt més gran trobada a totes les cèl·lules eGFP positives examinades, es va reduir en sis2-Tfam^-/- ronyons(143,2 23,2 mm3 per als mutants vs. 318,3 49,45 mm3 per als controls, n ¼ 3 cadascun, P ¼ 0,0327). En conjunt, les troballes ultraestructurals i SIM i les troballes de l'anàlisi de gens i proteïnes mt són coherents amb la pèrdua progressiva del nombre de còpies mt aTfam^-/- epiteli.

Cistancheés bo permalaltia poliquística del ronyó

La deficiència de TFAM desplaça el metabolisme epitelial renal cap a la glucòlisi

PTEC a laronyóutilitzen la b-oxidació d'àcids grassos i OXPHOS per a la generació d'ATP i són gluconeogenètics.18 Per obtenir informació addicional sobre les alteracions metabòliques associades a la inactivació de Tfam, vam realitzar una anàlisi de seqüenciació d'ARN deronyonsde Sis2-Tfam^-/-i els ratolins de control de camarada Cre a l'edat de 7 anys. Vam trobar que els gens reguladors clau implicats en la glucòlisi, com l'hexocinasa 2 (Hk2) i l'enolasa 2 (Eno2), estaven regulats. En canvi, l'expressió de la majoria de gens implicats en el cicle de l'àcid tricarboxílic es va reduir (per exemple, isocitrat deshidrogenasa 1 [Idh1]), així com l'expressió de gens implicats en la b-oxidació d'àcids grassos, com l'acetil-coenzim A aciltransferasa 1B ( Acaa1b), acil-coenzim A deshidrogenasa de cadena mitjana (Acadm) (figura 5a i b, figura suplementària S8). En consonància amb la disminució de l'expressió dels gens implicats en els gens d'oxidació del cicle de l'àcid tricarboxílic va ser l'acumulació de lípids neutres detectats per la tinció d'O vermell d'oli en congelats.ronyóseccions a P14 anys (figura 5c).

La reducció de l'expressió de TFAM en teixits PKD murins i humans s'associa amb l'esgotament de mt

Perquè Sis2-Tfam^-/- ronyonstenia una gran semblança amb la PKD(malaltia poliquística del ronyó) ronyons, a continuació vam avaluar si TFAM estava desregulat en PKD(malaltia poliquística del ronyó)teixits. Primer vam examinar l'expressió gènica regulada per TFAM i TFAM en 2 models de ratolí PKD genètics ben establerts. Els nivells d'ARNm de Tfam es van reduir significativament en homogeneïtats de ronyó sencers de Pkd^-/- i Cys^cpk/cpkratolins, que porten mutacions en PKD1(malaltia poliquística del ronyó)o Cys1. Això es va associar amb una disminució de l'expressió dels gens mt codificats per mitocondrial i nuclear, així com amb l'expressió gènica glicolítica desregulada. Similar a Six2-Tfam^-/-ronyons, PKD(malaltia poliquística del ronyó)^-/- i Cys^cpk/cpk ronyonses van caracteritzar per Eno2 i Hk2 elevats i van disminuir significativament els nivells de transcripció de fosfoglicerat cinasa (Pgk) 1, piruvat deshidrogenasa cinasa (Pdk) 1 i Pdk4 (figura 6a). L'expressió de la proteïna TFAM, tal com es va avaluar mitjançant la tinció d'IF, es va reduir a les cèl·lules epitelials de revestiment de quists en comparació amb les cèl·lules epitelials dels túbuls no quístics adjacents (figura 6b). Això es va associar amb una expressió reduïda de mt-Co1 i mt-Atp6 per hibridació in situ de fluorescència d'ARN (figura 6b, figura suplementària S9); El volum de mt, tal com determina la SIM 3D, es va reduir un 55 per cent en comparació amb les cèl·lules epitelials de túbuls adjacents no quístics o amb PTEC del control normal.ronyons. No es van trobar diferències de volum mt entre els PTEC de control normal i els PTEC de túbuls no quístics (figura 6c).

Examinar si la pèrdua d'expressió de TFAM és una característica molecular comuna de la PKD humana(malaltia poliquística del ronyó), vam analitzar mostres de nefrectomia de 5 pacients amb ADPKD mitjançant immunohistoquímica, tinció IF, hibridació in situ de fluorescència d'ARN i SIM 3D. Es va observar una expressió reduïda de TFAM en el 75,2% més el -7,5% derenalquists analitzats per immunohistoquímica. Això es va associar amb una disminució de l'expressió de MT-CO1 i MT-ATP6 per hibridació in situ de fluorescència d'ARN (figura 7a, figura suplementària S10); El volum de mt a les cèl·lules epitelials del revestiment del quist es va reduir aproximadament un 70 per cent, tal com es va avaluar amb 3D SIM (figura 7b). En conjunt, l'anàlisi de 2 PKD(malaltia poliquística del ronyó)Els models de ratolí i els teixits humans d'ADPKD van suggerir que la deficiència de TFAM i l'esgotament de mt són troballes habituals en PKD(malaltia poliquística del ronyó)teixits i és probable que afectin la patogènesirenalmalaltia quística.

el cistanche és bo permalaltia poliquística del ronyó

Discussió

Feu clic aquí per obtenir informació sobre la Part II (Discussió) d'aquest article.

Extret de: 'RonyóLa deficiència del factor de transcripció mitocondrial A dirigit a l'epiteli provoca un esgotament mitocondrial progressiu associada a una malaltia quística greu "per Ken Ishii1,2,11 et al.

---RonyóInternacional (2021) 99, 657–670