Wnt1 exògena prevé la lesió renal aguda i la seva progressió posterior a la malaltia renal crònica

Contacte: Audrey Hu Whatsapp/hp: 0086 13880143964 Correu electrònic:audrey.hu@wecistanche.com

Xue Hong^1†, Yanni Zhou^2†, Dedong Wang^3†, Fuping Lyu⁴, Tianjun Guan³, Youhua Liu^1,5i Liangxiang Xiao^3*

¹Laboratori Estatal Clau d'Investigació de Falla Orgànica, Centre Nacional d'Investigació Clínica de Malalties Renals, Divisió de Nefrologia, Hospital Nanfang, Universitat Mèdica del Sud, Guangzhou, Xina,²Departament de Nefrologia, Hospital de Xiamen Afiliat a la Universitat de Medicina Xinesa de Beijing, Xiamen, Xina,³Departament de Nefrologia, Hospital Zhongshan Afiliat a la Universitat de Xiamen, Xiamen, Xina,⁴Departament d'endocrinologia i diabetis, el primer hospital afiliat de la Universitat de Xiamen, Xiamen, Xina,⁵Departament de Patologia, Facultat de Medicina de la Universitat de Pittsburgh, Pittsburgh, PA, Estats Units

Els estudis suggereixen que els agonistes de Wnt/-catenina són beneficiosos en el tractament delesió renal aguda(AKI); no obstant això, segueix sense tenir en compte el seu paper en la prevenció de l'IRA i la seva progressió cap a la malaltia renal crònica (ERC). En aquest estudi, la insignació renal de Wnt/-catenina es va activar per la sobreexpressió de Wnt1 exògena o bé es va inhibir per l'administració amb ICG-001, una petita molècula inhibidora de la senyalització de -catenina, abans que els ratolins van ser sotmesos a una lesió per isquèmia/reperfusió (IRI) per induir AKI i CKD posterior. Els nostres resultats van mostrar que l'expressió in vivo de Wnt1 exògena abans dels ratolins protegits per IR contra AKI i va impedir la progressió d'AKI a CKD en ratolins, demostrat tant per anàlisis bioquímiques de sang com histològiques renals. En canvi, el pretractament de l'ICG-001 abans de la IR no va tenir cap efecte sobre la senyalització renal de Wnt/-catenina o la progressió d'AKI a CKD. Mecànicament, l'expressió in vivo de Wnt1 exògena abans de la IR va suprimir l'expressió de proteïnes proapoptòtiques en ratolins AKI i va reduir les respostes inflamatòries tant en ratolins AKI com CKD. A més, Wnt1 exògena va inhibir l'apoptosi de cèl·lules tubulars induïda pel tractament amb hipòxia-reoxigenació (H/R) in vitro. Per concloure, el present estudi proporciona proves per donar suport a l'efecte preventiu de l'activació de Wnt/-catenina sobre l'AKI relacionada amb IR i la seva progressió posterior a la CKD.

Paraules clau: dany renal agut, malaltia renal crònica, Wnt1, -catenina, lesió per isquèmia-reperfusió

El tractament delesió renal aguda(AKI): cistanche

INTRODUCCIÓ

Lesió renal aguda (IRA)és una condició clínica a causa d'una pèrdua ràpida de la funció renal per diverses lesions, com ara fàrmacs, isquèmia, sèpsia i toxines (Chawla i Kimmel, 2012; Scholz et al., 2021). L'IRA s'associa amb una alta incidència de morbiditat i mortalitat, responsable d'aproximadament 2 milions de morts cada any a tot el món (Belayev i Palevsky, 2014). En particular, l'AKI és un predictor independent ben reconegut per al desenvolupament de la malaltia renal crònica (ERC) o la malaltia renal en fase terminal (ESRD), que han suposat una gran càrrega econòmica per al sistema sanitari (Leung et al., 2013; Belayev i Palevsky, 2014; Kurzhagenet al., 2020). Malauradament, no hi ha medicaments efectius per a la prevenció i el tractament de l'IRA.

La senyalització Wnt/-catenina té un paper fonamental en la inorganogènesi, l'homeòstasi dels teixits i el desenvolupament de diverses malalties, incloses les malalties del ronyó (Soni, 2021). -La catenina té un doble paper en servir tant de proteïna estructural com de regulador de la transcripció (MacDonald et al., 2009). La -catenina unida a la membrana forma part del complex d'unió adherent i contribueix a la interacció cèl·lula-cèl·lula, mentre que la -catenina citosòlica és fosforilada per la glicogensintasa quinasa-3 (GSK{-3) i s'adreça a la ubiquitinació i la degradació del proteasomal. Tanmateix, aquesta degradació de la -catenina podria ser rescatada pels lligands Wnt, una família de glicoproteïnes secretades amb activitats biològiques diverses. La unió de la Wnt estabilitza la -catenina, que es trasllada al nucli i actua com a factor de transcripció per a la generació. En particular, la senyalització de Wnt/-catenina està relativament silenciada en els ronyons adults no lesionats, però es reactiva durant la lesió renal aguda i crònica (Huffstater et al., 2020). de la funció renal, mentre que l'activació sostinguda de Wnt/-catenina podria impulsar la progressió d'AKI a CKD (Xiao et al., 2016; Huffstater et al., 2020). Per tant, la senyalització de Wnt/-catenina és una arma de doble tall en la lesió renal i en garanteix una millor comprensió. En particular, segueix sent esquiva sobre el paper de l'activació de Wnt/-catenina en la prevenció de l'IRA i la seva progressió posterior AKI-CKD.

La lesió per isquèmia-reperfusió renal (IRI) es considera la principal causa d'IRA. Per tant, el model animal IRI renal s'ha utilitzat habitualment per a la investigació de l'IRA i la progressió d'AKI-CKD (Bonventre i Yang, 2011). S'han utilitzat tant enfocaments farmacològics com genètics per dilucidar el paper de l'activació de Wnt/-catenina en models IRI d'AKI i CKD, respectivament. Els inhibidors de liti i GSK-3 s'utilitzen habitualment per activar farmacològicament Wnt/-cateninsignaling en models preclínics d'IRA, però cal tenir en compte els seus efectes independents de la catenina (Bao et al., 2014). Modificacions genètiques de GSK{{9} }}, -catenina o lligands Wnt (Wnt1 i Wnt9a) s'han utilitzat per dilucidar el paper de l'activació de Wnt/-catenina en AKI i CKD (Bonventre i Yang, 2011; Bao et al., 2014; Zhou et al., 2013, 2018; Liuet al., 2020). No obstant això, els estudis sobre el paper de Wnt/-cateninsignaling en la prevenció de l'IRA són força limitats. El present estudi tenia com a objectiu dilucidar el paper de la senyalització Wnt/-catenina en la prevenció de l'IRA i la seva posterior progressió a CKD.

FIGURA 1|L'expressió in vivo de Wnt1 exògena abans que IR prevé l'AKI i activa la catenina renal en ratolins

(A)Grups de tractament del ratolí. Els ratolins es van tractar amb plasmidi pcDNA3 (IRI més pcDNA3) o PHA-Wnt1 (IRI més PHA-Wnt1) mitjançant injecció hidrodinàmica de la vena de la cua 2 dies abans de BIRI. Nivells de creatinina sèrica(B)i nivells de nitrogen ureic en sang (BUN).(C) es van mesurar. (D) Micrografies representatives de la morfologia renal a 1 dia després del BIRI. Les seccions de ronyó van ser sotmeses a una tinció d'àcid periòdic-Schiff. S'amplien les àrees de caixa. Les fletxes indiquen túbuls renals. Barra d'escala, 200 µm.(E, F)Anàlisi Western blot de -catenina activa en ronyons de ratolins. *P <0.05 versus="" controls="" simulats="" (n="5)." †p=""><0, 05="" versus="" iri="" injectat="" amb="" plasmidi="" pcdna3="" (n="">

Cistanche millora la funció renal

MATERIALS I MÈTODES

Estudi d'animals

Els ratolins mascles C57BL/6 amb un pes aproximat de 22 a 25 g es van comprar a Vital River Laboratory Animal Technology (Beijing, Xina) i es van mantenir a la instal·lació d'animals (temperatura: 22 ± 2 ◦ C, humitat: 60 ± 5 per cent, 12 h de fosc/cicle de llum). ) a la Southern Medical University (Guangzhou, Xina) amb aigua i aliments ad libitum. Els estudis en animals van ser aprovats pel Comitè d'ètica i benestar dels animals de la Southern Medical University. Tots els animals van ser tractats d'acord amb la Guia per a la cura i l'ús d'animals de laboratori.

La inducció d'AKI i CKD en ratolins es va descriure en els nostres estudis anteriors (Xiao et al., 2016; Zhou et al., 2018). La lesió d'isquèmia/reperfusió renal bilateral (BIRI) s'ha utilitzat àmpliament per induir AKI en ratolins, mentre que augmenta la mortalitat durant la progressió d'AKI a CKD. Per tant, s'utilitza la isquèmia/reperfusió renal unilateral (UIRI) per a la investigació sobre la progressió de l'IRA a l'ERC. Breument, es va fer una incisió abdominal de la línia mitjana al ratolí sota anestèsia general i es van retallar els pedicles renals bilaterals o esquerres durant 30 minuts amb pinces de microaneurisma (element núm. 18051-35; Fine ScienceTools, Cambridge, Regne Unit). Durant la cirurgia, la temperatura corporal es va mantenir a uns 37-38 ◦ C mitjançant un sistema de calefacció controlat per temperatura.

Per avaluar l'efecte preventiu de l'activació de Wnt/-catenina sobre AKI, es va injectar als ratolins 1 mg/kg d'hemaglutinina (HA) amb un vector d'expressió Wnt1 (PHA-Wnt1, UpstateBiotechnology) o un vector buit (pcDNA3) 2 dies abans de BIRI utilitzant el sistema hidrodinàmic. tècnica de transferència de gens basada en la informació anterior (Xiao et al., 2016). Els teixits de sang i ronyó es van recollir 1 dia després del BIRI renal.

Per avaluar l'efecte de l'activació precoç de Wnt/-catenina en la progressió d'AKI a CKD, els ratolins van ser sotmesos a una injecció diària hidrodinàmica de la vena de la cua de plasmidis d'expressió Wnt1 a 1 mg/kg o a una injecció intraperitoneal diària d'ICG -001 ({{4 }}, Chembest, Xangai, Xina) a 5 mg/kg durant 3 dies abans de la UIRI. Els teixits de sang i ronyó es van recollir 11 dies després de la UIRI. En el nostre estudi preliminar, 2 dies d'injecció de Wnt1 podrien induir l'expressió de Wnt1 en ratolins AKI (dades no mostrades). Cal tenir en compte que es van triar 3 dies d'injecció de Wnt1 per assegurar i allargar l'expressió de Wnt1 durant la progressió d'AKI a CKD.

La lesió renal aguda (IRA) és una condició clínica deguda a una pèrdua ràpida de la funció renal

Cultiu i tractament cel·lular

La línia cel·lular epitelial tubular proximal humana (HKC-8) va ser proporcionada pel Dr. L. Racusen de la Universitat Johns Hopkins (Baltimore, MD, Estats Units). Els cultius cel·lulars es van realitzar tal com s'ha descrit anteriorment (Zhou et al., 2013). Les cèl·lules HKC-8 es van tractar amb Wnt1 recombinant humà (SRP4754; Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, Estats Units) a 100 ng/mL o ICG-001 (847591-62-2, Chembest, Xangai) , Xina) a 10 µM durant 4 h. A continuació, es van incubar les cèl·lules en una estació de treball d'hipòxia (X3-CK, Biospherix) a l'1% de pO2 durant 48 h. A continuació, es van tornar a oxigenar les cèl·lules durant 2 h abans de la recollida per a diverses anàlisis.

FIGURA 2|L'expressió in vivo de Wnt1 exògena abans de la IR redueix l'apoptosi de les cèl·lules tubulars i l'activació de NF-κB en ratolins AKI

(A) Les micrografies representatives mostren cèl·lules positives per a TUNEL en diferents grups tal com s'indica. Les fletxes indiquen tinció positiva. Barra d'escala, 100 µm.(B)La presentació gràfica mostra el camp d'alta potència (HPF) de cèl·lules positives TUNEL en diferents grups tal com s'indica.(C–F)Les anàlisis representatives de Western blot mostren l'expressió renal de FasL, p53 i Bax en diferents grups, tal com s'indica. *P < 0.05="" versus="" controls="" simulats;="" †p=""><0, 05="" versus="" iri="" injectat="" amb="" plasmidis="" pcdna="" (n="">(G) Western blot representatiu de proteïnes p65 i p-p65 en diferents grups tal com s'indica.

Assaig d'apoptosi

Les cèl·lules es van tripsinitzar, es van recollir i es van rentar amb PBS. La tinció d'annexina V de PE es va realitzar segons el protocol del fabricant. L'anàlisi citomètrica es va realitzar amb un citòmetre de flux (BD FACSCanto II, San Jose, CA, Estats Units) per mesurar les taxes d'apoptosi detectant la quantitat relativa de cèl·lules positives de PE Annexina V i 7-AAD negatives. Cada assaig es va realitzar per triplicat.

Assaig de creatinina i nitrogen urea en sang

Es van mesurar els nivells de creatinina en sèrum i orina, així com els nivells d'ureanitrogen en sang (BUN) mitjançant un analitzador bioquímic automàtic (AU480, Beckman-Coulter Inc., Brea, CA, Estats Units).

Histologia i tinció immunohistoquímica

Es van realitzar seccions de ronyó i tinció immunohistoquímica tal com es va descriure anteriorment (Liu et al., 2020). Els anticossos primaris incloïen anti-Wnt1 policlonal de conill (ab15251; Abcam, Inc.), catenina policlonal anti- -de conill (ab15180; Abcam, Inc.). .), i anti-fibronectina policlonal de conill (F3648; Sigma-Aldrich).

Anàlisi Western Blot

L'anàlisi de Western blot es va realitzar tal com es va descriure anteriorment (Zhou et al., 2019). Els anticossos primaris incloïen anti-fibronectina policlonal de conill (F3648; Sigma-Aldrich), anticòs anti- -catenina monoclonal de ratolí (610154; BD TransductionLaboratories), anticossos monoclonal anti{- -SMA de ratolí (A2547; Sigma-Aldrich), conill policlonal anti-Wnt1 (ab15251; Abcam), anti- -tubulina de ratolí (T9026; Sigma-Aldrich), anticossos anti PAI-1 de ratolí (AF3828;R&D Systems), anti-catenina activa (núm. 05 –665; EMD Millipore), lligand anti-Fas (FasL) (SC -6237;Santa Cruz, CA, Estats Units), p53 (#2524S; CST), Bax (SC 20067; Santa Cruz), p65 ( #8242S; CST), p-p65 (#3033S; CST), PCNA (#2586S; CST).

Extracció d'ARN i anàlisi qPCR

L'aïllament total de l'ARN i la qPCR es van dur a terme tal com es va descriure anteriorment. Els nivells d'ARNm de diversos gens es van normalitzar amb -actina. Les seqüències d'imprimació dels gens s'enumeren a la taula suplementària 1.

FIGURA 3|L'expressió in vivo de Wnt1 exògena abans de la IR impedeix la progressió d'AKI a CKD en ratolins

(A)Grups de tractament del ratolí. Els ratolins van ser sotmesos a una injecció hidrodinàmica de la vena de la cua d'1 mg/kg pcDNA3 (IRI més pcDNA3) o plasmidi PHA-Wnt1 (IRI més PHA-Wnt1), o una injecció intraperitoneal de 5 mg/kg ICG-001 tres dies abans d'UIRI . La sang i els teixits es van recollir 11 dies després de la UIRI. Nivells de creatinina sèrica(B) i nivells de nitrogen ureic en sang (BUN).(C) es van mesurar.(D) Micrografies representatives de la morfologia renal als 11 dies després de la UIRI. Les seccions de ronyó van ser sotmeses a una tinció periòdica d'àcid-Schiff. Les zones encaixades s'amplien. Les fletxes indiquen túbuls renals. Barra d'escala, 100 µm. *P <0,05; **p=""><0,01. n="">

Anàlisi estadística

Totes les dades es van expressar com a mitjana ± SEM. Les dades es van analitzar estadísticament mitjançant el programari Sigma Stat (Jandel ScientificSoftware, San Rafael, CA, Estats Units). La comparació entre grups es va fer mitjançant ANOVA unidireccional, seguida de la prova Student-Newman-Keuls. P < 0,05="" es="" va="" considerar="">

BENEFIC DE L'HERBA DE CISTANCHE RENON

RESULTATS

L'expressió in vivo de Wnt1 exògena abans que IR prevé la lesió renal aguda i activa la catenina renal en ratolins

Per determinar el paper de l'activació de Wnt/-catenina en la prevenció d'AKI, els ratolins es van administrar amb un vector d'expressió Wnt1 etiquetat amb HA (PHA-Wnt1) o un vector buit (pcDNA3) mitjançant una injecció hidrodinàmica de la vena de la cua 2 dies abans de BIRI.(Figura 1A). Els nivells sèrics de creatinina i BUN, dos biomarcadors de lesió renal, van augmentar significativament en els ratolins 1 dia després de la BIRI, cosa que suggereix l'existència d'AKI (figures 1B, C). observat en ratolins AKI(Figura 1D). En particular, aquestes alteracions en biomarcadors de lesions renals sèriques i lesions morfològiques en ratolins AKI es van atenuar notablement per Wnt1 exògena. Les anàlisis Western Blot van revelar que Wnt1 exògena va promoure l'expressió de la catenina renal en ratolins AKI.(Figures 1E, F). En conjunt, aquestes troballes suggereixen que el tractament previ de Wnt1 exògena activa la catenina renal i prevé l'AKI en ratolins.

L'expressió in vivo de Wnt1 exògena abans que IR redueixi l'apoptosi cel·lular tubular i inhibeix l'activació del factor nuclear-Kappa B

Per explorar si la regulació de l'apoptosi és el mecanisme subjacent a l'efecte protector del Wnt1 exògen sobre AKI, es va realitzar una tinció de TUNEL per identificar l'apoptosi al teixit renal de ratolins AKI. En comparació amb els ratolins Sham, IRI va augmentar notablement la taxa d'apoptosi, així com els nivells de proteïnes relacionades amb l'apoptosi, com FasL, p53 i Bax, ronyons de ratolins.(Figures 2A-F). Aquestes alteracions en els ronyons dels ratolins AKI es van reduir notablement per l'expressió in vivo de Wnt1 exògena abans de la IR. El factor nuclear-kappa B (NF κB), especialment la seva forma heterodímer p65/p50, té un paper crític en la regulació de la resposta inflamatòria en els ronyons dels ratolins AKI. L'anàlisi de Western blot va demostrar que tant p65 com la seva forma fosforilada (p-p65) van augmentar notablement els ronyons dels ratolins després de l'IRI, mentre que aquestes alteracions es van evitar amb Wnt1 exògena.(Figura 2G). Aquestes troballes suggereixen que l'expressió in vivo de Wnt1 exògena abans d'IR prevé l'apoptosi i inhibeix l'activació de NF-κB als ronyons dels ratolins AKI.

FIGURA 4|L'expressió in vivo de Wnt1 exògena abans de la IR regula a la baixa Wnt1 i -catenina endògena als ronyons de ratolins després de la progressió d'AKI-CKD

(A)Les micrografies representatives mostren l'expressió de proteïnes Wnt i -catenina en diferents grups tal com s'indica. Barra d'escala, 50 µm.(B–E)Anàlisis Western blot representatives dels nivells de proteïnes Wnt1, -catenina i -catenina activa en diferents grups, tal com s'indica.(F) Expressió d'ARNm de TGF- en diferents grups tal com s'indica.*P <0.05; **p=""><0,01. n="">

L'expressió in vivo de Wnt1 exògena abans que la IR impedeix la progressió de la lesió renal aguda a la malaltia renal crònica

A continuació, vam examinar si l'activació de Wnt/-catenina abans de la IR pot prevenir la progressió d'AKI a CKD. Com es mostra aFigura 3A, els ratolins es van sotmetre a una injecció en vena hidrodinàmica del plasmidi d'expressió Wnt1 (PHA-Wnt1) o a una injecció intraperitoneal d'ICG-001 3 dies abans de la UIRI. Tant els nivells de creatinina sèrica com de BUN van augmentar en ratolins als 11 dies després de la UIRI(Figures 3B, C). A més, la tinció de tricrom de Masson va revelar una important deposició de col·lagen renal i lesions fibròtiques en ratolins 11 dies després de la UIRI.(Figura 3D). Aquestes observacions indiquen la progressió d'AKI a CKD en ratolins després d'UIRI. En particular, les alteracions observades dels biomarcadors sèrics de lesió renal i la fibrosi renal en ratolins CKD es van prevenir gairebé completament mitjançant el tractament previ de Wnt1 exògena, però no ICG-001. Per tant, l'expressió in vivo de Wnt1 exògena abans de la IR impedeix la progressió d'AKI a CKD en ratolins.

Expressió in vivo de Wnt1 exògena abans que IR regui a la baixa l'endogen Wnt1 i la catenina als ronyons

Vam investigar més l'efecte de la senyalització Wnt/-catenina onògena Wnt1 exògena als ronyons de ratolins CKD. Tal com es mostra a la figura 4A, la tinció immunohistoquímica va revelar que tant Wnt1 com -catenina endògenes estaven marcadament regulats als ronyons dels ratolins als 11 dies després de l'IRI. Els seus nivells de proteïnes es van reduir considerablement amb el pretractament d'exogenousWnt1, però no ICG-001. Les anàlisis de Western blot van confirmar l'efecte inhibidor del Wnt1 exògen, però no de l'ICG-001, l'expressió onògena dels ronyons de Wnt1, -catenina i -catenina activa de ratolins CKD (figures 4B-E). Les vies de senyalització Wnt/-catenina i TGF- es creuen en la fibrosi renal. L'expressió d'ARNm de TGF- es va induir en ronyons de ratolins CKD, i aquesta inducció es va reduir per l'exògena Wnt1, però no per ICG -001 (figura 4F). Per tant, el pretractament de Wnt1 exògena inhibeix la Wnt/-cateninsignaling renal endògena en ratolins CKD.

FIGURA 5|L'expressió in vivo de Wnt1 exògena abans que la IR redueixi els gens diana de Wnt/-catenina renal en ratolins després de la progressió d'AKI-CKD

(A, B) Expressió d'ARNm de PAI-1 i MMP-7 en diferents grups tal com s'indica.(C–E)Anàlisis representatives de Western blot dels nivells de proteïnes PAI-1 i Klotho.(F)Expressió d'ARNm de Klotho. *P <{{0}},05; **p=""><0,01. n="">

L'expressió in vivo de Wnt1 exògena abans que IR redueixi els gens objectiu RenalWnt/-Catenin en ratolins

En comparació amb els ratolins Sham, l'expressió d'ARNm de PAI-1i MMP{-7, dos objectius directes aigües avall de Wnt/-cateninsignaling, es va regular significativament als ronyons de ratolins 11 dies després d'UIRI.(Figures 5A, B). El pretractament de Wnt1 exògena, però no d'ICG-001, va inhibir l'expressió d'ARNm de PAI-1 i MMP{-7 en ratolins CKD. L'anàlisi de Western blot va mostrar que els nivells de proteïna PAI-1 van augmentar en els ronyons dels ratolins CKD, on es van abolir mitjançant el pretractament de Wnt1 exògen, però no ICG-001(Figures 5C, D). Klotho és un antagonista anedogen de Wnt en unir i segrestar lligands Wnt. En comparació amb els ratolins Sham, tant els nivells d'ARNm com de proteïnes de Klotho es van reduir als ronyons dels ratolins als 11 dies després de la UIR.(Figures 5E, F). El pretractament de Wnt1 exògena, però no d'ICG-001, va restaurar gairebé completament l'ARNm de Klotho i l'expressió de proteïnes als ronyons de ratolins CKD. Aquestes troballes suggereixen a més l'efecte inhibidor del Wnt1 exògen sobre els ronyons de senyalització endògens de Wnt/-catenina de ratolins CKD.

L'expressió in vivo de Wnt1 exògena abans que IR redueixi la fibrosi renal en ratolins després de la progressió de la lesió renal aguda-malaltia renal crònica

A continuació, vam investigar l'efecte de l'activació de Wnt/-catenina abans de la IR sobre els gens de la matriu renal i les lesions fibròtiques en ratolins CKD. En comparació amb els ratolins Sham, l'expressió d'ARNm de fibronectina (FN), col·lagen I, col·lagen III i -SMA es va induir notablement en el ronyons de ratolins als 11 dies després de la UIR(Figures 6A-D).Aquestes alteracions es van reduir amb el tractament previ d'exogenousWnt1, però no ICG-001. L'anàlisi de Western blot va demostrar que els nivells de proteïnes de FN i -SMA van augmentar significativament els ronyons dels ratolins CKD, i aquestes alteracions es van suprimir mitjançant el tractament previ de Wnt1 exògena, però no ICG-001(Figures 6E-G). Els efectes de Wnt1 i ICG exògens-001 sobre l'expressió de la proteïna FN en ratolins CKD es van validar mitjançant la immunotinció renal amb un anticòs FN(Figura 6H). Aquestes troballes suggereixen que el tractament previ de Wnt1 exògena prevé la fibrogènesi renal en ratolins CKD induïts per IR.

FIGURA 6|L'expressió in vivo de Wnt1 exògena abans de la IR redueix la fibrosi renal en ratolins després de la progressió d'AKI-CKD

(A–D)Expressió d'ARNm de fibronectina, col·lagen I, col·lagen III i -SMA.(E–G)Anàlisis representatives de Western blot dels nivells de proteïna de fibronectina i -SMA-SMA.(H)Immunotinció de seccions renals de fibronectina. *P <{{0}}.05; **p=""><0,01; †p=""><0,05. n="5." barra="" d'escala,="" 50="">

Expressió in vivo de Wnt1 exògena abans que la IR atenui la inflamació renal després de la lesió renal aguda-la progressió de la malaltia renal crònica

En comparació amb els ratolins Sham, l'expressió d'ARNm de gens inflamatoris, com IL{0}}, IL-6 i TNF-, es va regular significativament als ronyons dels ratolins als 11 dies després de la UIR.(Figures 7A-C). Aquestes alteracions es van abolir gairebé completament mitjançant el tractament previ de Wnt1 exògen, però no ICG-001. L'anàlisi de Western blot va mostrar que els nivells de proteïnes tant de P65 com de la seva forma fosforilada (p-p65) van augmentar notablement als ronyons dels ratolins als 11 dies. després d'UIRI, que indica l'activació de la senyalització NF-κB en ratolins CKD(Figures 7D-F). En particular, el pretractament de Wnt1 exògen, però no ICG-001, va reduir significativament els nivells de proteïna p65 i p-p65 al ronyó de ratolins CKD.

FIGURA 7|L'expressió in vivo de Wnt1 exògena abans que IR atenui la inflamació renal en ratolins després de la progressió d'AKI-CKD

(A–C) Expressió d'ARNm d'IL-1, IL-6 i TNF- en ronyons de ratolins. (D–F)Anàlisis representatives de Western blot dels nivells de proteïna p65 i p-p65. *P <0.05; **p=""><0,01. n="">

Wnt1 exògena protegeix les cèl·lules tubulars contra l'apoptosi induïda per la lesió per hipòxia-reoxigenació in vitro

Per identificar encara més el paper de Wnt1 en l'AKI, vam establir models de cèl·lules tubulars HKC-8 d'AKI mitjançant el tractament de hipòxia-reoxigenació (H/R). La citometria de flux es va utilitzar per detectar l'apoptosi i va revelar l'elevació de la taxa d'apoptosi a les cèl·lules HCK 8 després del tractament H/R(Figures 8A, B). Wnt1 exògena va reduir notablement l'apoptosi a les cèl·lules HCK-8 després del tractament H/R. Les anàlisis de Western blot van demostrar que el tractament amb H/R va augmentar significativament els nivells de proteïnes relacionades amb l'apoptosi, com FasL, p54, Bax i Parp{{4} } a les cel·les HCK-8(Figures 8C–G). Aquestes alteracions van ser disminuïdes per Wnt1 exògena. Aquestes dades suggereixen que Wnt1 exògena protegeix contra la dapoptosi induïda per H/R a les cèl·lules tubulars.

FIGURA 8|Wnt1 exògena protegeix les cèl·lules tubulars contra l'apoptosi induïda per la lesió per hipòxia-reoxigenació (H/R) in vitro

(A)Les anàlisis FACS representatives mostren que Wnt1 va inhibir l'apoptosi cel·lular induïda per hipòxia/reoxigenació (H/R). Les cèl·lules HKC-8 es van expressar prèviament amb Wnt1 exògena, seguides de condicions inhipòxiques d'incubació durant 48 h i després reoxigenació durant 2 h.(B) El gràficLa presentació mostra el percentatge de cèl·lules apoptòtiques en diferents grups tal com s'indica. Les cèl·lules positives amb Annexina V marcades amb PE es van comptar mitjançant citometria de flux. *P < 0.05="" versus="" controls;="" †p=""><0,05 versus="" h/r="" (n="">(C) Les anàlisis Western blots representatives mostren l'expressió de proteïnes de FasL, p53, Bax i Parp-1 a les cèl·lules HKC-8.(D–G)Les presentacions gràfiques mostren les abundàncies relatives de FasL, p53, Bax i Parp-1 a les cèl·lules HKC-8. *P < 0.05="" versus="" controls;="" †p=""><0,05 versus="" h/r="" (n="">

DISCUSSIÓ

Tot i que l'IRA està augmentant en incidència i és el principal factor de risc per a la progressió a l'ERC, no hi ha teràpies efectives per a la prevenció i el tractament de l'IRA. Una sèrie de situacions, com la cirurgia cardíaca, els dipòsits intratubulars i l'administració de fàrmacs nefrotòxics, podrien provocar el desenvolupament d'AKI (Mas-Font et al., 2017). Això posa de manifest la necessitat de mesures preventives de l'IRA.

Tot i que nombrosos estudis donen suport als efectes beneficiosos de l'activació de la Wnt/-catenina en la patogènesi de l'AKI, encara no té cap efecte sobre l'efecte preventiu de l'agonista de Wnt/-catenina en l'IRA. Una de les novetats del present estudi és que l'expressió in vivo de Wnt1 exògena abans de la IR podria protegir els ratolins contra l'AKI i prevenir la progressió de l'AKI a CKD. L'expressió in vivo de Wnt1 exògena 2 dies abans de la IR bilateral renal va poder activar la -catenina renal, provocant una reducció de l'apoptosi renal i la inflamació en ratolins AKI (1 dia després de la IR). Wnt/-cateninsignia endògena i va prevenir el desenvolupament de fibrosi renal en ratolins CKD (11 dies després de la IR). En canvi, es va demostrar que l'expressió in vivo de Wnt1 exògena 5 dies després de la IR renal indueix l'activació de la catenina i accelera la progressió de l'AKI a la CKD (Xiao et al., 2016). Aquests estudis suggereixen que el moment dels agonistes de Wnt/-catenina és un factor important quan s'utilitzen per a la prevenció i el tractament de l'IRA.

Els estudis suggereixen que l'activació sostinguda de Wnt/-cateninsignaling podria impulsar la progressió d'AKI a CKD. ICG 001 inhibeix selectivament la senyalització de la proteïna d'unió Wnt/-catenina/CREB (CBP) i actualment es troba en un assaig clínic per a diversos càncers. Prèviament vam demostrar que l'administració d'ICG-011 als 5 dies després de la IR va restaurar la funció renal i va impedir la progressió de l'IRA a l'ERC, com ho demostra la reducció de la fibrosi renal (Xiao et al., 2016). A més, l'administració d'ICG-001 que va començar 3 dies després de l'obstrucció ureteral unilateral (UUO) va poder atenuar les lesions fibròtiques renals en models UUO de ratolins CKD (Hao et al., 2011). No obstant això, el present estudi va demostrar que el pretractament de l'ICG-001 3 dies abans de la IR no va tenir cap efecte en la senyalització renal de Wnt/-catenina ni en la progressió d'AKI toCKD. Això no és sorprenent perquè la senyalització de Wnt/-catenina s'expressa a nivells molt baixos en ronyons adults no lesionats (Tanet al., 2014). No obstant això, els nostres resultats suggereixen que el moment i la durada de l'administració d'ICG-001 són fonamentals per determinar el seu resultat terapèutic.

Els mecanismes subjacents a l'efecte protector de Wnt/-catenina poden implicar la modulació de l'apoptosi i les vies de supervivència. L'ablació genètica del túbul-catenina afavoreix l'apoptosi tubular després del tractament amb IRI o àcid fòlic, mentre que l'activació de Wnt/-catenina suprimeix les proteïnes pro-apoptòtiques (Wang et al. ,2009; Zhou et al., 2012). En el present estudi, exogenousWnt1 va inhibir notablement l'apoptosi de cèl·lules tubulars tant en models IRImouse d'AKI com en models cel·lulars induïts per H/R d'AKI. Això suggereix que l'apoptosi podria ser un mecanisme potencial subjacent a l'efecte preventiu de Wnt1 exògena sobre la progressió d'AKI i AKI a CKD. El present estudi també va demostrar un efecte inhibidor del Wnt1 exògen sobre l'activació de NF-κB tant en AKI com en CKD, cosa que indica la supressió de la resposta inflamatòria. Tanmateix, cal tenir en compte que encara s'ha de determinar si la reducció de la inflamació és un efecte secundari de la protecció o els mecanismes de protecció mediats per Wnt1 exògen. Es necessiten més estudis per dilucidar el mecanisme exacte de la protecció exògena mediada per Wnt1-contra l'IRA i la prevenció de la progressió de l'IRA a la CKD.

Utilitzeu moduladors Wnt/-catenina per prevenir i tractar l'AKI i la CKD

CONCLUSIÓ

En conclusió, el present estudi proporciona l'evidència per donar suport a l'efecte preventiu de l'activació de Wnt/-catenina sobre AKI i CKD relacionats amb IR, tot i que es necessita més treball per dilucidar els mecanismes exactes pels quals Wnt1 exògen protegeix contra AKI i CKD. Tenint en compte el doble paper de la senyalització Wnt/-catenina en AKI i CKD, el present estudi posa de manifest la importància del temps quan s'utilitzen moduladors Wnt/-catenina per a la prevenció i el tractament de l'AKI. Es justifiquen estudis futurs que utilitzen enfocaments més farmacològics i genètics, així com el temps i la durada òptims del tractament per investigar l'efecte dels Wnt/-cateninagonistes en la prevenció i el tractament de l'IRA.

DE: Wnt1 exògena prevé la lesió renal aguda i la seva progressió posterior a la malaltia renal crònica, Xue Hong^1†, Yanni Zhou^2†, Dedong Wang^3†, Fuping Lyu⁴, Tianjun Guan³, Youhua Liu^1,5i Liangxiang Xiao^{3 *}

Davant. Fisiol., 08 de novembre de 2021|https://doi.org/10.3389/fphys.2021.745816