Activitat blanquejadora dels components aïllats de la polpa de Trichosanthes

Contacte:joanna.jia@wecistanche.com/ WhatsApp: 008618081934791

Rongchao Zhang, 1,2Xiuqin Hu,1Bo Zhang,1ZhenWang,1Chunxiang Hao,1 Jie Xin,1i Qingmei Guo 2

Resum: El blanqueigEl mercat de cosmètics té un futur brillant i els productes de blanquejament natural pur de la medicina tradicional xinesa sempre han estat un punt d'investigació. En aquesta investigació, l'ingredient actiu blanquejador de la polpa de Trichosanthes de la medicina xinesa es va aïllar i purificar per primera vegada, i la sevablanqueigmecanisme es va aclarir. Es van utilitzar mètodes cromatogràfics com ara gel de sílice, ODS i HPLC per aïllar-los i purificar-los. Les cèl·lules B16 es van utilitzar per mesurar l'activitat antioxidant,tirosinasaactivitat i activitat d'eliminació de melanina. Es van aïllar un total de 20 compostos, incloent p-hidroxibenzaldehid (1), àcid salicílic (2), àcid vainílic (3), àcid isovanílic (4), protocatechuat (5), àcid transcinàmic (6), {{9 }}àcid cumàric (7), àcid transferúlic (8), drechslerol-B (9), palmitat de ciclohexanol 3- (10), 5-acetoximetil-2-furaldehid (11), 5-hidroximetilfurfural (12), diosmetina (13), apigenina (14), crisoberil (15), luteolina (16), 4′-hidroxiscutellarina (17), quercetina (18), 3′,{{31} }dihidroxi-7-(-D-glucopiranosiloxi)-4′-metoxi flavona (19) i ciprofloxacina{-7-O- -D-glucòsid (20). Entre ells, els compostos 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 i 20 tenen bons efectes reparadors antioxidants; els compostos 3, 4, 5, 6 i 7 tenen una alta inhibició del negre; els compostos 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 i 20 tenen una activitat inhibidora de la tirosina oxidasa evident. Els resultats 1e van establir les bases per al desenvolupament i la utilització posteriors dels recursos de pasta de Trichosanthes i també proporcionen una base per al desenvolupament de les plantes naturals.blanqueigcosmètics.

Cistanche herbaés uningredient natural per blanquejar.

1. Introducció

Trichosanthes kirilowii Maxim. és una herba enfiladissa perenne de la família de les cucurbitàcies. Els seus fruits, llavors, pela i arrel s'utilitzen habitualment com a medicina tradicional xinesa. Durant molt de temps, la polpa de Trichosanthis sovint es descarta en la producció i processament de Semen Trichosanthis i Pericarpium Trichosanthis, donant lloc a residus importants. Actualment, els informes sobre la polpa de Trichosanthes se centren principalment en la comparació del contingut de sucre, aminoàcids, vitamines i altres nutrients [1–4]. No hi ha cap informe sobre la composició química de la polpa de Trichosanthes. Per tant, cal estudiar sistemàticament els components químics de la polpa.

Al mateix temps, amb el ràpid desenvolupament de l'economia, els cosmètics no només són productes d'estil de vida d'alt consum, sinó que també es converteixen en les "necessitats" més populars per a les dones. Molts llibres de medicina clàssica xinesa o materiamedica han registrat que la polpa de Trichosanthes té la funcióblanqueigi efectes d'eliminació d'arrugues [5–7]. Els resultats anteriors del nostre grup d'investigació mostren que l'extracte d'aigua de la polpa de Trichosanthes era més grantirosinasaactivitat inhibidora i la taxa d'inhibició de la tirosinasa va ser d'un 70 per cent. 1ecomúblanqueigEls agents vitamina C (VC) i l'arbutina es van utilitzar com a substàncies de control [8]. Es va demostrar preliminarment que l'extracte de polpa de Trichosanthes tenia un cert efecte blanquejador en inhibir l'activitat de la tirosinasa. Per tant, és de gran importància estudiar els components químics i el mecanisme de blanqueig de la polpa de Trichosanthes.

ElblanqueigEl mecanisme es pot resumir com inhibint la síntesi de melanina i accelerant la transferència de melanina. El procés 1e de formació de melanina dels inmelanòcits és el següent:tirosinasaoxida la tirosina a BA polimorf (DOPA); després s'oxida a dopaquinona. Després d'una sèrie de reaccions metabòliques, es produeix melanina. La tirosinasa és l'únic enzim que limita la velocitat en el procés de reacció, i la seva activitat determina la quantitat de melaninsintetitzat. Quan es millora l'activitat de la tirosinasa, la melaninsíntesi augmenta; quan s'inhibeix l'activitat de la tirosinasa, la síntesi de melanina es redueix [9]. El centre actiu de la tirosinasa té un lloc actiu doble de coure, i cada ió de coure es combina amb 3 residus d'histidina amb 1 o 2 valències respectivament. Per tant, la reducció amb efectes antioxidants pot interactuar amb l'àtom de coure al lloc actiu de la tirosinasa o reduir l'intermedi en el procés de síntesi de melanina per inhibir la formació de melanina [10, 11]. A més, la inhibició de la transferència de melanòcits madurs als queratinòcits també pot tenir un paper en el blanquejament.

La tecnologia de cultiu cel·lular s'utilitza per determinar l'efecte deblanqueigprincipis actiustirosinasaactivitat i producció de melanina en melanòcits in vitro. La línia cel·lular 1e de melanoma de ratolí (cèl·lules B16) deriva de cèl·lules de melanoma de pell de ratolí i la seva estructura bàsica, especialment pel que fa a la síntesi de melanina, és bàsicament la mateixa que la de les cèl·lules normals de melanoma humà. Com que és molt difícil cultivar cèl·lules de melanoma de la pell primària humana, el model de ratolí es pot utilitzar com a cèl·lula de prova per a la determinació deblanqueigingredients actius. Per tant, es van utilitzar cèl·lules B16 per mesurar l'activitat antioxidant, l'activitat de la tirosinasa i l'activitat d'eliminació de melanina, i es van determinar preliminarment els components actius blanquejadors i el mecanisme relacionat. Els resultats van establir les bases per al desenvolupament i la utilització posteriors dels recursos de polpa de Trichosanthes i també proporcionen la base per al desenvolupament de cosmètics blanquejants naturals.

2. Experiments

2.1. Materials.

Trichosanthes trichosanthis es va recollir de la base de plantació de plantes medicinals Hebao a Pinyin, Jinan. Les mostres 1e van ser identificades pel professor QingmeiGuo de la Universitat de Medicina Tradicional Xinesa de Shandong. Després de treure la pela i les llavors, es va obtenir la part de polpa del fruit. Després de la liofilització, la polpa es va triturar, es va barrejar i finalment es va col·locar en un dessecador per a un ús posterior.

cistanche frescaambequinacòsidefectes

2.2. Viabilitat cel·lular.

Les cèl·lules B-16 (cèl·lules de melanoma de ratolí) es van comprar a KeyGEN i es van mantenir en medi DMEM suplementat amb un 10% de sèrum fetal boví (FBS), a 37 graus en una atmosfera humidificada amb un 5% de CO2. 1en, les cèl·lules B-16es van sembrar en plaques de 96-pous (10 × 104 cèl·lules/pou) durant 24 h d'incubació.

2.3. Preparació de diferents extractes.

La matèria primera de la polpa de Trichosanthes kirilowii era de 4,5 kg. 1e polpa es va remullar en 10 vegades la quantitat d'etanol al 95 per cent 3 vegades. Es van combinar 1eextractes i es van concentrar fins a uns 3,0 L. L'extracte d'acetat d'etil es va obtenir dispersant l'extracte d'etanol en 15 L d'aigua, extreint-lo amb acetat d'etil fins que l'extracte era incolor. Els extractes 1e es van combinar i es van concentrar a pressió reduïda.

L'extracte d'acetat d'etil es va barrejar amb gel de sílice (malla 100–2{0{0) en una proporció d'1: 2 (extracte: gel de sílice, v/ v). Es va evaporar 1 dissolvent i es va reservar el gel. La columna de cromatografia de vidre 1e (8{{30}} mm × 1200 mm) es va empaquetar amb 200–300 malla de gel de sílice i D101 resina macroporosa, i després la columna es va eluir amb acetat d'etil, èter de petroli (10 per cent, 25 per cent, 50 per cent, 75 per cent i 100 per cent) i metanol, acetat d'etil (5 per cent, 10 per cent, 25 per cent, 50 per cent). , 75 per cent i 100 per cent ), per recollir cada flux. Finalment, cada fracció es va recollir i configurar a les concentracions següents: 0,003125 mg/mL, 0,00625 mg/mL, 0,0125 mg/mL, 0,025 mg/mL, 0,05 mg/mL, 0,1 mg/mL, 0,25 mg/mL, 0,25 mg/mL, 0,05 mg/mL mL, 1,0 mg/mL i 2,0 mg/mL, i després s'utilitza per processar les cèl·lules cultivades. Al final del tractament, es van afegir 20 μL de solució MTT (5 mg/mL) a cada pou. Les cèl·lules 1e es van incubar durant 20 min a 37 graus. Es va descartar 1 sobrenedant i es van afegir 100 μL de DMSO a cada pou. L'absorbància 1e es va mesurar a 490 nm. L'experiment es va repetir 3 vegades. La taxa de supervivència 1e es va calcular de la següent manera:

percentatge de supervivència=(grup experimental grup en blanc)/(grup control - grup en blanc) × 100 per cent .

La concentració òptima (C1) de cada fracció es va calcular segons la relació funcional entre la taxa de supervivència i la concentració de cada fracció. C1 es va diluir 2, 4, 6 i 8 vegades per obtenir les concentracions C2, C3, C4 i C5, respectivament. A la taula 1 es mostren 1 extractes diferents de la polpa.

Taula 1: extractes polars de polpa de Trichosanthes i la concentració òptima.

2.4. Experiment de blanqueig

2.4.1. Prova d'antioxidants.

Es va utilitzar un assaig MTT per determinar la viabilitat cel·lular (MTT Kit, Kaiji Biology). 1en, les cèl·lules B-16 es van sembrar en 96-plaques de pous (10 × 104 cèl·lules/pou) durant 24 h i es van tractar amb diferents extractes o compostos durant 24 h. Després del tractament, el medi de cultiu es va descartar i es va rentar dues vegades amb PBS. 1en, es va afegir un 0,05 per cent d'H2O2 i les cèl·lules es van cultivar durant 4 h. Després d'això, les cèl·lules B-16 es van incubar en una solució MTT de 20 µL (5 mg/mL) a 37 graus durant 4 h. A la figura 1, es va eliminar el sobrenedant de cultiu i el residu es va dissoldre en 100 µL de DMSO. Es va detectar l'absorbància 1e a 490 nm mitjançant un lector de microplaques (Tecan Trading AG). Es van realitzar 1eexperiments en paral·lel 3 vegades.

2.4.2. Inhibició de la producció de melanina.

La producció de melanina es va determinar detectant el contingut de melanina a les cèl·lules mitjançant la piròlisi de NaOH [12]. Les cèl·lules es van sembrar en plaques de 96-wellculture durant 24 h a una densitat cel·lular d'10 × 104 cèl·lules/pou. 1en, les cèl·lules es van tractar amb diferents extractes o compostos durant 24 h. Després d'això, es va eliminar el sobrenedant del cultiu cel·lular (300 µL) i el residu es va dissoldre en NaOH (1 mL, 1, 0 mol/L) durant 24 h a temperatura ambient. Es va mesurar l'absorbància a 475 nm mitjançant un microplateador (Tecan Trading AG). Es van realitzar 1e experiments en paral·lel amb 3 rèpliques. 1e IC50 es va determinar amb el programari GraphPad Prism 5 (GraphPad Software, Inc., San Diego, Califòrnia) i es va utilitzar l'arbutina com a control positiu (IC50 =15,6 µL).

2.4.3. Determinació de l'activitat de la tirosinasa.

Es va eliminar el sobrenedant del cultiu cel·lular i el residu es va dissoldre en Tritonx-100 (90 µL) itirosinasa(10 µL, 1,0 mg/mL, Sigma, T3824 25ku). Després de la barreja, la mescla es va incubar a 37 graus durant 30 minuts. L'absorbància 1e es va mesurar a 475 nm mitjançant un lector de microplaques (Tecan Trading AG). Es van realitzar 1eexperiments en paral·lel 3 vegades. 1e IC50 es va determinar pel programari GraphPad Prism 5 (GraphPadSoftware, Inc., San Diego, Califòrnia) i es va utilitzar l'arbutina com a control positiu (IC50 =15,6 µL).

2.5. Extracció i aïllament. L'extracte d'acetat d'etil es va dissoldre en metanol i la columna es va empaquetar amb gel de sílice de malla 200-300, que es va equilibrar amb èter de petroli. 1en, una elució en gradient que consisteix en èter de petroli i acetat d'etil en proporcions de 2:1, 1:1 i 1:2; acetat d'etil; acetat d'etil i metanol en proporcions de 2:1, 1:1 i 1:2; i es va utilitzar metanol juntament amb TLC per obtenir els compostos A (11,5 g), B (10,4 g), C (12,1 g), D (5,2 g) i E (6,1 g).

A es va separar per cromatografia en columna de poliamida, utilitzant diclorometà i metanol en proporcions de 2:1, 1:1 i 1:2 com a dissolvent d'elució. 1e eluat es va controlar mitjançant TLC. Es van combinar punts amb el mateix factor de retenció (rf) i es van obtenir A1 i A2. 1en, A1 es va preparar per TLC, utilitzant diclorometà i metanol en una proporció d'1:1 com a agent de desenvolupament, i es va purificar diverses vegades per la columna de gel. Finalment, es van obtenir el compost 1 (17 mg) i el compost 2 (27 mg). A2 es va purificar mitjançant cromatografia en columna de gel de sílice, utilitzant diclorometà i metanol com a eluent en proporcions d'1:1 i 1:2. Es van obtenir el compost 3 (11 mg), el compost 4 (12 mg) i el compost 5 (23 mg). B es va separar mitjançant cromatografia a pressió mitjana C18 en fase inversa (RP-C18), utilitzant metanol, aigua en una elució en gradient de la següent manera: 0 per cent, 10 per cent, 15 per cent, 20 per cent, 25 per cent, 30 per cent, 30 per cent, 35 per cent, 40 per cent, 50 per cent, 75 per cent, 90 per cent i 100 per cent. El cabal 1e era de 10 mL·min-1. Es van combinar 1e fraccions de flux amb la mateixa rf i es van obtenir B1 i B2. B1 es va purificar repetidament per la columna de gel, amb metanol com a dissolvent d'elució. El compost (24 mg), 7 (21 mg) i 8 (18 mg) es van obtenir després d'elucions repetides. B2 es va purificar mitjançant la columna de gel i metanol i es va obtenir el compost 9 (11 mg). El C es va separar per RP-C18 i es va eluir amb metanol i aigua amb un cabal de 10 mL·min-1. Es van combinar 1e fraccions de flux amb la mateixa rf i es van obtenir C1, C2 i C3. El C1 es va preparar per la columna de gel i es va eluir amb metanol, i es va obtenir el compost 10 (13 mg). El C2 es va separar mitjançant una columna de gel de sílice i es va eluir amb acetat d'etil i metanol, amb una elució en gradient en proporcions de 2:1, 1:1 i 1:2. El C2 es va purificar mitjançant extracció preparativa en fase líquida i els compostos 11 (15 mg) i 12. es van obtenir (14 mg). El C3 es va separar per la columna de poliamida, es va eluir amb metanol i aigua i es va purificar per HPLC. Es van obtenir els compostos 13 (34 mg), 14 (42 mg) i 15 (38 mg). D es va separar per RP-C18 i es va eluir amb metanol i aigua. El cabal 1e va ser de 10 mL·min-1. Els compostos 16 (36 mg), 17 (19 mg) i 18 (37 mg) es van obtenir per HPLC. Els compostos 19 (29 mg) i 20 (34 mg) es van obtenir mitjançant elució en gradient utilitzant acetat d'etil i metanol en proporcions d'1:1 i 1:2, seguits de metanol al 100% en una columna de gel de sílice.

herba epimedium sagittatum a la pell

3. Resultats i discussió

3.1. Determinació d'extractes actius (E1–E11).

Es va calcular la concentració òptima (és a dir, C1) de cada extracte i es mostra a la taula 1. Un experiment antioxidant mostra que tots els extractes tenen un efecte reparador antioxidant, però en comparació amb VC, l'efecte antioxidant de cada grup és feble. L'activitat antioxidant d'E1, E3, E4, E7 i E11 va disminuir dins de la concentració creixent, tal com es mostra a la figura 1. La prova d'inhibició de melanina va demostrar que tots els components polars de la pulpof Trichosanthes kirilowii inhibien la síntesi de melanina. En particular, la taxa d'inhibició de la melanina va ser significativament més alta per a E2, E3 i E4 que la de l'arbutina de control positiu, com es mostra a la figura 2. 1e resultats detirosinasaL'activitat mostra que tots els components polars de la polpa de Trichosanthes kirilowii van inhibir l'activitat de la tirosinasa i la tendència d'inhibició era semblant a la de la inhibició de la melanina. La inhibició 1e de l'activitat de la tirosinasa va ser significativament més alta per a E2, E3, E4 i E8 que la del control positiu. En general, els extractes de l'èter de petroli tenen un efecte inhibidor baix sobre la tirosinasa. Els extractes d'acetat d'etil tenen un alt efecte inhibidor sobre la tirosinasa, especialment els components polars de l'acetat d'etil. Els extractes 1e de n-butanol també tenen un alt efecte inhibidor sobre la tirosinasa, tal com es mostra a la figura 3.

3.2. Aïllament i identificació de components monòmers.

Es van separar 20 compostos per gel de sílice i columnes de cromatograma ODS, així com per HPLC preparativa. A partir de l'anàlisi de dades de RMN i MS, es van dilucidar les seves estructures.1e 20 compostos es mostren a la taula 2, i les dades analítiques específiques dels monòmers es mostren a l'apèndix 1.

3.3. Anàlisi de validació de compostos efectius

3.3.1. Anàlisi de validació de compostos antioxidants.

E1, E2, E3, E4 i E5 tenen efectes antioxidants. Els principals compostos aïllats dels components anteriors eren drechslerol-B (compost 9), ciclohexanol 3-palmitat (compost 10), 5-acetoximetil-2-furaldehid (compost 11), 5-hidroximetilfurfural ( compost 12), diosmetina (compost 13), apigenina (compost 14), crisoberil (compost 15), luteolina (compost 16), 4′-hidroxi-escutellarina (compost 17), quercetina (compost 18), 3′,{{ 25}}Els principals compostos eren glicòsids, cosa que indica que els glucòsids tenen bones activitats antioxidants. Àcids fenòlics, com ara 5-acetoximetil-2-furaldehid (compost 11), 5-hidroximetilfurfural (compost 12), diosmetina (compost 13), apigenina (compost 14), crisoberil (compost 15) ,luteolina (compost 16), 4′-hidroxiscutellarina (compost 17), quercetina (compost 18) i 3′,5-dihidroxi-7-(-Dglucopiranosiloxi)-4′-metoxi flavona, també tenen bones activitats antioxidants, a causa del grup hidroxil fenòlic i dels dobles enllaços insaturats [26, 27]. Els resultats 1e es mostren a la figura 4.

Figura 4: Taxa de supervivència cel·lular (per cent) de l'experiment antioxidant de diferents compostos d'extractes de Trichosanthes

3.3.2. Anàlisi de validació de compostos d'inhibició de la melanina.

E11, E12, E13, E16, E17 i E18 tenen un bon efecte inhibidor sobre la síntesi de melanina. A la taula 2 es mostren els principals compostos aïllats dels components anteriors. Segons el mètode de la secció 2.4.2, es va determinar l'efecte de cada compost sobre la síntesi de melanina. Cada compost es va avaluar a les concentracions següents: 1000 µg/mL, 800 µg/mL, 400 µg/mL, 200 µg/mL i 100 µg/mL. Cada mesura es va realitzar per triplicat i es va calcular la taxa d'inhibició de la síntesi de melanina.

Protocatechuat (compost 5), 5-acetoximetil-2-furaldehid (compost 11), 5-hidroximetilfurfural (compost 12), diosmetina (compost 13), p-hidroxibenzaldehid (compost 1), àcid salicílic (compost 2), àcid vanil·lic (compost 3), àcid isovanil·lic (compost 4), àcid transcinàmic (compost 6), 4-àcid cumàric (compost 7), apigenina (compost 14), crisoberil (compost 15) ), luteolina (compost 16), 4′-hidroxi scutellarina (compost 17), quercetina (compost 18), 3′,5-dihidroxi-7-(-D-glucopiranosiloxi)-4′ -metoxi flavona (compost 19), ofloxacina-7-O- -D-glucòsid (compost 20) poden inhibir la producció de melanina [28]. En particular, l'àcid vanil·lic (compost 3), l'àcid isovanílic (compost 4), el protocatechuat (compost 5), l'àcid transcinàmic (compost 6) i l'àcid 4-cumàric (compost 7) ​​tenen una alta inhibició de la melanina. Els resultats 1e es mostren a la figura 5.

3.3.3. Verificació i anàlisi de compostos que inhibeixen l'activitat de la tirosinasa.

E2, E3, E4, E7, E8 i E9 tenen bons efectes inhibidorstirosinasaactivitat. Els principals compostos aïllats dels components anteriors es mostren a la taula 2. Segons el mètode presentat a la secció 2.4.3, es va utilitzar arbutina com a control i la concentració del compost va ser de 1000 µg/mL, 800 µg/mL, 400 µg/mL. , 200 µg/mL i 100 µg/mL. Cada mesura es va realitzar 5 vegades i es va calcular la taxa d'inhibició de la tirosinasa. Els resultats 1e es mostren a la figura 6.

Els resultats 1e mostren que la diosmetina (compost 13), apigenina (compost 14), crisoberil (compost 15), luteolina (compost 16), 4′-hidroxiscutellarina (compost 17), quercetina (compost 18), 3′, {{10} }dihidroxi-7-(-D-glucopiranosiloxi)-4′-metoxi flavona (compost 19), ciprofloxacina{-7-O{- -D-glucòsid (compost 20), p-hidroxibenzaldehid (compost 1), àcid salicílic (compost 2), àcid vainílic (compost 3), àcid isovanílic (compost 4), protocatechuat (compost 5), àcid transcinàmic (compost 6), 4-àcid cumàric (compost 7). ), i l'àcid transferúlic (compost 8) tenen tots evidentstirosinasaactivitats inhibidores.

La planta de Cistanche inhibeix l'activitat de la tirosinasa.

Feu clic a la imatge i obteniu més detalls.

Compostos substituïts per hidroxil a l'anell de benzè, com p-hidroxibenzaldehid (compost 1), àcid salicílic (compost 2), àcid vainílic (compost 3), àcid isovanílic (compost 4), protocatechuat (compost 5), àcid transcinàmic ( compost 6), 4-àcid cumàric (compost 7), àcid transferúlic (compost 8) i flavonoides, presentaven una alta inhibició de la tirosinasa i la taxa d'inhibició dels compostos substituïts en para era significativament més alta que la dels compostos substituïts per fortho. . Per exemple, l'activitat inhibitòria del p-hidroxibenzaldehid era significativament superior a la de l'àcid salicílic i l'activitat inhibidora de l'àcid vanil·lic era significativament superior a la de l'àcid isovanil·lílic. A més, l'activitat inhibidora del p-hidroxibenzaldehid era significativament superior a la de l'àcid salicílic, l'àcid vainílic, l'àcid isovanílic i el protocatechuat. Una raó pot ser que els grups nucleòfils al voltant del centre actiu detirosinasa, com ara -SH, -NH2 i -OH, ocupen l'espai al voltant del centre actiu i així eviten que la tirosina ataci el centre actiu. Finalment, es va inhibir la síntesi de melanina [28]. L'activitat inhibidora dels compostos que contenien o-dihidroxi era més forta que la dels compostos parahidroxi, i l'activitat inhibidora del protocatechuat era significativament superior a la de l'àcid vanil·lic. Els fenòmens 1e anteriors també existeixen en els flavonoides. La taxa d'inhibició dels flavonoides que contenien grups hidroxil 7 i 4′ era significativament més alta que si es substituïssin els grups hidroxil 7 i 4′. Per exemple, l'activitat inhibidora del crisoberil era significativament superior a la de la diosmetina, mentre que l'activitat inhibidora de la diosmetina era superior a la del 3′,5-dihidroxi-7-(-D-glucopiranosiloxi)-4 ′- metoxi flavona i ciprofloxacina-7-O- -D-glucòsid. La taxa d'inhibició dels flavonoides que contenien 3-hidroxi era significativament més alta que la dels compostos sense 3-hidroxi o si es substituïa 3-hidroxi. Per exemple, l'activitat inhibidora de la quercetina era significativament superior a la de la 4′-hidroxiscutellarina, però l'activitat inhibidora de la 4′-hidroxiscutellarina era superior a la de la quercetina-3-o glucòsid. A més, l'activitat inhibidora de la koellina és més gran que la de l'apigenina però inferior a la de la luteolina. Es suggereix que els substituents de l'anell B, especialment el grup hidroxil, poden millorartirosinasaactivitat inhibidora i el grup ortodihidroxi de l'anell B tenia una activitat inhibidora més gran [29].