Un ARN no codificant llarg conservat, GAPLNC, modula la resposta immune durant el xoc endotòxic

Per obtenir més informació, contacteudavid.wan@wecistanche.com

Importància

La inflamació s'ha estudiat en gran mesura en el context dels gens que codifiquen proteïnes. Estudis recents han descobert IncRNAs com a reguladors importants de la immunitat. La caracterització funcional d'aquests gens continua sent una àrea activa de recerca. En aquest estudi, identifiquem GAPLNIC com un conservat funcionalmentIncRNAentre humans i ratolins. L'esgotament de GAPLLINC dóna lloc a una expressió millorada de gens de resposta immune que són directesNF-kBobjectius. Sorprenentment, observem que els ratolins knockout Gaplinc mostren resistència al xoc endotòxic induït per LPS i trobem que l'expressió basal de gens inflamatoris impedeix la formació de punts per protegir-se de la fallada multiorgànica i la mort. Aquestes troballes tenen implicacions en el tractament de la sèpsia, en què les noves teràpies dirigides als IncRNA poden aportar informació valuosa per entendre la inflamació i millorar els resultats dels pacients.

Feu clic aquí per obtenir més informació sobre Cistanche

FG 1. Identificació i caracterització de macròfags específicsIncRNA GAPLINC. (A) A schematic for macrophage differentiation in vitro using primary human celeb or immortalized THP-1 cells, Isolated monocytes from human P8MCs are differentiated into macrophages using recombinant magnon stimulating factor. PHP-1 cells are differentiated into macrophages by treatment with PMA (100 nM). (8)RNA-Seg analysis on macrophages differentiated from monocytes isolated from human PBMCs (n = 4 donors). Results are represented in a volcano plot. GAPUNC (shown in red) is the most up-regulated and RNA (>1,000-fok). (C) Anàlisi de RNA-SeqGAPLNCexpressió durant la diferenciació de monòcits a macròfags per als punts de temps indicats. L'expressió GAPLINC es representa com a còpies per cèl·lula (FPKM. (D) El mapa de calor representa l'expressió gènica d'un panell personalitzat de Nanostring, que mostra els 10 millors InciNA expressats de manera diferencial comparant monòcits amb macròfags a cèl·lules humanes primàries i cèl·lules THP-1. Les dades de Nanotring es van realitzar en duplicats biològics. (E) Un esquema de cèl·lules progenitores de granulòcits-monòcits que dóna lloc a dues poblacions diferents; 1) MDDC i 2) MDM. La pista del navegador del genoma UCSC mostra lectures d'ARN-Seq de monòcits, macròfags i cèl·lules dendrítiques a laGAPLNIClocus. () Anàlisi qPCR d'ARN purificats de fraccions nuclears (blanques) i citoplasmàtiques (grises) en MDM (anàlisi G qPCR de Russ aïllades de diferents fraccions polisomes de sistemes MDM (gradient de sacarosa del 10 al 50 per cent, SW41, 40 K rpm, per ~) 1,5 h).

Estudis recents han identificat milers d'ARN llargs no codificants (ARNnc) en genomes de mamífers que regulen l'expressió gènica en diferents processos biològics. Tot i que els IncRNAs s'han identificat en una varietat de cèl·lules immunitàries i estan implicats en la resposta immune, la funció i el mecanisme biològic de la majoria romanen sense explorar, especialment en la sèpsia. Aquí, identifiquem un paper per a un ARNhd (ARN no codificant intergènic llarg predictiu d'adenocarcinoma gàstric (GAPLINC)), caracteritzat prèviament pel seu paper en el càncer, ara en el context de la immunitat innata, els macròfags i el xoc endotòxic induït per LPS. L'anàlisi del transcriptoma de macròfags d'humans i ratolins revela que GAPLNIC és un IndRNA conservat que s'expressa molt després de la diferenciació dels macròfags. Després de l'activació inflamatòria, GAPLNC es regula ràpidament a la baixa. Els macròfags esgotats de GAPLNIC mostren una expressió millorada de gens inflamatoris a la línia de base, mentre que la sobreexpressió de GAPLNIC suprimeix aquesta resposta. En consonància amb les cèl·lules esgotades de GAPLNIC, els ratolins eliminatoris de Gaplinc mostren nivells basals millorats de gens inflamatoris i mostren resistència aInduït per LPSxoc endotòxic. Mecànicament, la supervivència està relacionada amb un augment dels nivells de NF-xB nuclear en els ratolins knockout Gaplinc que impulsen l'expressió basal de gens diana que normalment només s'activen després de l'estimulació inflamatòria. Mostrem que aquesta activació dels gens de resposta immune abans del repte de LPS condueix a la formació de coàguls de sang desaparèixer, que protegeix els ratolins nocauts de Gaplinc de la fallada multiorgànica i la mort. En conjunt, els nostres resultats identifiquen una funció desconeguda prèviament per a GAPLNIC com a regulador negatiu de la inflamació. i descobrir un paper clau per a aquest lncRNA en la modulació del xoc endotòxic.

Fig.2. GAPLNC és un regulador negatiu de la inflamació i depèn de la senyalització Nf-sB. Els monòcits aïllats de PBMC humans i diferenciats en macròfags es van transfectar amb control o GAPLNC siRNA. (A)Anàlisi de l'ARNen GAPLNC kd o control siRNA MDMs. RNA-Seq es va realitzar en duplicats biològics. Els resultats es representen en una gràfica de volcà. Els gens regulats significativament amb canvis de plecs superiors o iguals a 2 estan enquadrats en vermell. (6) Anàlisi GO-Term sobre gens significativament regulats. (C) El mapa de calor representa l'expressió gènica dels principals gens relacionats amb la immunitat regulats a l'alça amb GAPLINC kd. Les dades d'ARN-Seq es van realitzar en duplicats biològics. (D) Les isoformes GAPLLINC en MDM es van determinar mitjançant la seqüenciació R2C2 basada en Nanopore. Les dades de la seqüenciació de Nanopore es van realitzar en duplicats biològics (les dades brutes estan disponibles a SRAunder Bloproject PRINA639136). (E) Una taula que representa els recomptes de lectura i el percentatge de cada isoforma GAPLNIC. (F) Vector bidireccional que expressa GFP-Zetocin per un costat i GAPLNIC per l'altre costat. (G i H) Anàlisi qPCR de l'expressió GAPLNIC a cèl·lules THP-1 que expressen GAPLNC ectòpic o control vectorial buit. Els nivells d'IL6 es van quantificar després de l'estimulació amb LPS (200 ml nal) durant 6 h; les dades es van agrupar de tres experiments independents.* P<0.05. ()="" rna-seq="" analysis="" of="" mdms="" stimulated="" with="" lps(200="" ng/ml)="" for="" the="" indicated="" time="" points.="" data="" from="" rna-seq="" was="" performed="" in="" biological="" duplicates.="" galplinc="" expression="" is="" represented="" as="" copies="" per="" cell="">FPKM), L'anàlisi U qPCR de GAPLINC en MDM （n=3）pretractat amb DMSO o BAY-7082（10μM）, seguida d'estimulació LPS (200 ngmL) per a 6 ht, es van agrupar dades de tres experiments independents. *Pàg<0.05. (k)atacseq="" analysis="" of="" monocytes="" and="" macrophages,="" untreated="" and="" treated="" with="" lps="" (200="" ng/ml)="" for="" 1,6,="" and="" 18h.ucsc="" browser="" track="" displays="" atac-seq="" reads="" at="" the="" gaplinc="">

La sèpsia és una malaltia que posa en perill la vida causada per una reacció excessiva del cos a la presència d'una infecció, que pot provocar ràpidament una insuficiència multiorgànica i la mort. El sistema immunitari és essencial per proporcionar protecció contra la infecció; tanmateix, l'activació incontrolada pot tenir conseqüències greus per a l'hoste. Segons els Centres per al Control i la Prevenció de Malalties, un de cada tres pacients que moren en un hospital té sèpsia(1). i, tanmateix, encara no entenem els mecanismes moleculars subjacents que condueixen a la fatalitat. Les opcions clíniques per al tractament de la sèpsia es limiten al lliurament de líquids, antibiòtics i cures de suport i s'han mantingut pràcticament sense canvis durant dècades. Tot i que el diagnòstic precoç i el tractament ràpid han millorat els resultats de la sèpsia(2), hi ha una necessitat crítica de desenvolupar noves teràpies. Tot i que s'han realitzat estudis d'expressió gènica per examinar dianes terapèutiques potencials per a la sèpsia, aquestes dianes romanen en gran part sense caracteritzar (3). Hem identificat un ARN no codificant llarg (lncRNA) amb papers en el control de la resposta immune i el xoc endotòxic que ofereix vies per al desenvolupament de nous fàrmacs per orientar la sèpsia.

Resultat

Fig. 3. GAPLINC es conserva en ratolins i regula la resposta al xoc endotòxic. (4) GAPLNIC es conserva en sintènia. GAPLNC es troba en Chr18 en humans i en Chr17 en ratolins, entre els gens que codifiquen proteïnes Dlgap1 i Gift. Dlgapil no s'expressa enmacròfags. (B) MCA mostra la distribució dels nivells de Gaplinc en diversos tipus de cèl·lules immunitàries (BM). (C) Anàlisi qPCR de l'expressió de Gaplinc en cèl·lules B i BMDM; aquestes dades (mitjana ± SD) són representatives de tres experiments independents, (D) anàlisi qPCR de l'expressió Gaping en BMDME estimulada amb LPS (200 na/mL) durant 6 h; aquestes dades (mitjana ± SD) són representatives de tres experiments independents. (E) Esquema del locus Gaplinc abans i després de la supressió mediada per CRISPRCas9. Les línies discontínues indiquen la regió aproximada de la supressió. El gel representa l'amplificació per PCR de dades genòmiques. Es comparen les longituds d'amplicon per a ratolins WT i Gaping KO, (F) anàlisi qPCR de l'expressió de Gaplinc en BMDM WT i Gaplinc-KO mitjançant una combinació d'encebadors per detectar les regions Exon1, Exon2 i que abasten exons de la transcripció Gaplinc; aquestes dades (mitjana ± SD) són representatives de tres experiments independents. Anàlisi (G) RNA-Seq en BMDM de ratolins WT i Gaplinc KO (n =3). Els resultats es representen en una gràfica de volcà. Els gens regulats significativament amb un canvi de plec superior o igual a 2 es mostren en vermell. (H) Anàlisi GO-Term sobre gens significativament regulats. (I i J) Les dades de supervivència dels ratolins WT i Gaplinc KO es mostren en resposta al repte LPS d'E. coli (5 mg/kg/ratolins) (n =6 a 10). La prova estadística de diferències es va comptar mitjançant la prova de rang logarítmic (Mantel-Cox). "...P< 0.001.="" changes="" in="" body="" temperature="" of="" wt="" and="" gapline="" ko="" mice="" were="" recorded="" at="" the="" indicated="" time="" points.="" (k)="" survival="" data="" of="" wt="" and="" gaplinc="" ko="" mice="" are="" shown="" in="" response="" to="" the="" e.="" coli="" lps="" challenge(20="" mg/kg/mice)(n="10)." the="" statistical="" test="" of="" differences="" was="" calculated="" using="" the=""><>

Com que l'expressió d'ARNnc pot regular la resposta immune afectant la diferenciació de cèl·lules immunitàries i la seva funció respectiva (4-7), hem volgut investigar el paper dels ARNnc en els macròfags. Els macròfags són cèl·lules immunitàries innates importants que es poden derivar dels monòcits i són crítiques per al reconeixement de patògens mitjançant l'ús de receptors Toll-like (TLR). Després de l'activació. Els TLR inicien vies de senyalització complexes que activen factors clau de transcripció com ara NF-kB, que condueixen a la transcripció de centenars de gens de resposta immune(8).

Per identificar els IncRNA implicats en la diferenciació i la funció dels macròfags, hem dut a terme la seqüenciació d'ARN (RNA-Seq) tant en macròfags (MDM) derivats de monòcits primaris humans com en la línia cel·lular monocítica THP-1s (Fig. lA i apèndix SI. Fig. S1). Hem identificat l'ARN no codificant intergènic llarg predictiu d'adenocarcinoma gàstric (GAPLINC) com l'IncRNA més regulat durant la diferenciació de monòcits a macròfags (Fig. 1B). Els nivells de GAPLNC es van detectar el dia 1 i van augmentar fins a ~ 300 còpies per cèl·lula (Fig 1C). Utilitzant la tecnologia de perfil d'ARN (nCounter, Nanostring), vam validar GAPLNIC com un dels 10 ARNm principals expressats en MDM primaris diferenciats i THP-1 (Fig1D). També vam confirmar que GAPLINC s'expressa molt en MDM, però no s'expressa en les cèl·lules dendrítiques derivades de monòcits (MDDC) estretament relacionades (Fig. 1E), cosa que suggereix que l'expressió de GAPLINC és específica del tipus cel·lular. Realitzant un experiment de fraccionament cel·lular i mesurant els nivells de GAPLNIC als compartiments citoplasmàtics i nuclears dels macròfags mitjançant qPCR, vam trobar que GAPLNIC es localitza predominantment al citosol en comparació amb CD14, un ARNm citoplasmàtic, i NEAT1, un IncRNA nuclear (Fig. 1F). Això és coherent amb les troballes a les cèl·lules canceroses, en què GAPLNIC es localitza principalment al citoplasma (9). Per assegurar-nos que GAPLNC no es codifica, hem realitzat la presentació de polisomes, un mètode utilitzat per analitzar si un gen es tradueix activament a proteïnes. A diferència del CD14, no es van trobar ni NEATI ni GAPLNIC a la fracció d'alt polisoma, cosa que suggereix que GAPLIC no es tradueix (Fig 1G),

Fig.4. Gaplnc KO regula els IRG i mostra un augment del nivell de p65 al nu a la línia de base. (A) Nivells de citocines al sèrum de ratolins WT i Gaplinc KO a basal.n=4 a 7, * P<0.05.(b and="" c)rna-seg="" analysis="" in="" bmdms="" from="" wtand="" gaplinx="" ko="" mice="" stimulated="" with="" lps="" (200naiml)for6h="" (n="3)." the23aenes="" up-regulated="" in="" gap/inc="" ko-only="" condition="" are="" compared="" to="" wt="" and="" gapfinc-ko="" bmdms="" stimulated="" with="" lps.="" the="" resulting="" fold="" change="" upon="" lps="" stimulation="" is="" shown="" for="" wt="" and="" gapinc-ko="" bmdms.genes="" are="" ranked="" according="" to="" their="" fold="" change="" in="" wt.="" (d)="" coagulation="" parameters="" assessed="" for="" wt="" and="" gapinc="" ko="" mice="" challenged="" ip.with="" e.="" coils(5mg/kg/mice)(n="4" to="" 5).plasma="" was="" collected="" 18h="" post-lpsiniection.="" aptt="" was="" measured.="" (e)genes="" upregulated="" non="" sirna="" kd="" of="" human="" gaplnc="" in="" mdms="" are="" compared="" to="" genes="" up-regulated="" upon="" crsprcas9="" knockout="" of="" mouse="" gaplincin="" bmdms="" (fold="" change="" ≥1.5).="" up-regulated="" genes="" overlapping="" in="" both="" humans="" and="" mice="" are="" shown="" in="" the="" middle.="" (f)="" western="" blot="" of="" kb-gin="" wt="" and="" gaplinc-ko="" bmdms="" at="" the="" indicated="" time="" points="" following="" stimulation="" with="" lps="" (200="" ngml);="" these="" data="" are="" representative="" of="" three="" independent="" experiments,(g)="" western="" blot="" of="" p65="" in="" wt="" and="" gaplinc-ko="" bmdms="" (n="3)" at=""><0.01. (h="" western="" blot="" of="" p65="" in="" the="" nuclear="" fraction="" of="" wt="" and="" gaplinc-ko="" bmdms="" (n="">

A continuació, vam investigar l'efecte del silenciament de GAPLNC en la diferenciació dels macròfags. A mesura que els nivells de GAPLNC van augmentar durant la diferenciació, vam plantejar la hipòtesi que la derrota de GAPLNIC (KD) afectaria els gens implicats en la diferenciació. Utilitzant un petit ARN interferent (siRNA) agrupat, vam aconseguir entre el 55 i el 65 per cent de kd de GAPLNIC en MDM primaris (SIAppendix, Fig. S2). Vam realitzar RNA-Seq i vam identificar una sèrie de gens que estaven desregulats amb GAPLINC kd (Fig. 24). Hem confirmat els millors èxits mitjançant Nanostring (apèndix SI, figura S3). L'anàlisi d'enriquiment de l'ontologia gènica (GO) va mostrar que els gens de la resposta immune estaven significativament sobrerepresentats en gens regulats a l'alça sobre GAPLINC kd i no en gens implicats en la diferenciació dels macròfags, al contrari de la nostra hipòtesi original. (Fig. 2B). En particular, els gens expressats de manera diferencial a les cèl·lules GAPLINC-KD inclouen citocines i quimiocines proinflamatòries (IL6, CXCL10 i TNFSF10), gens estimulats per IFN (ISG) (IFIT2 i RSAD2) i proteïnes d'unió a guanilat (GBPs) (GBP3 i GBP5). (Fig. 2C i apèndix SI. Fig. S4). Per verificar que la diferenciació dels macròfags no es va veure afectada per GAPLNC kd. es van mesurar els nivells de CD11B.CD16 i CD14 en macròfags de control i tractats amb senyalització i es va trobar que eren similars (apèndix SI. Fig S5). A continuació, vam utilitzar un enfocament addicional de kdCRISPRinhibició (CRISPRi) per orientar el lloc d'inici de la transcripció mitjançant GAPLINUtilitzant tres ARN guia diferents (gRNAs) en cèl·lules THP-1 estimulades amb acetat de 12-mirstat 13- de forbol (PMA). Vam aconseguir més del 80 per cent de kd de GAPLINCi tornem a observar una expressió més gran de la citocina proinflamatòria IL6 quan GAPLNIC es derroca a la línia de base (apèndix SI. Fig. S6 A i B). Curiosament, després de l'activació dels lipopolisacàrids (LPS), els nivells d'IL6 eren similars en el control versus les cèl·lules GAPLINC kd THP-1 (SIAppendix, Fig. S6C). Com que els nivells de referència difereixen, la inducció global del plec d'IL6 es redueix quan s'elimina GAPLNIC. (S7 Apèndix, Fig. S6D).

Com que GAPLINC kd va donar lloc a la regulació a l'alça dels gens de la resposta immune, vam generar una línia cel·lular THP-1 que sobreexpressava GAPLNIC per determinar si media l'efecte contrari. Ús de dades de seqüenciació de lectura llarga. vam identificar les isoformes dominants de GAPLIN expressades en MDM (Fig. 2D). La isoforma més abundant, que coincideix amb l'anotació del gen de la seqüència de referència (RefSeq), es va incorporar a la nostra construcció (Fig. 2E). Hem utilitzat un vector lentiviral que conté un promotor bidireccional per impulsar la proteïna fluorescent verda (GFP) / Zeocin i GAPLNIC en paral·lel (Fig. 2F). Vam confirmar mitjançant qPCR que GAPLNC s'expressava de manera estable en THP -1 en comparació amb el control (Fig. 2G). La sobreexpressió de GAPLNC va reduir la IL6 a nivell d'ARN en comparació amb el control després de l'estimulació amb LPS, un component dels bacteris gramnegatius (Fig. 2H). Aquestes observacions suggereixen que GAPLNC actua com a regulador negatiu de la resposta inflamatòria.

A continuació, vam examinar els nivells de GAPLNIC en MDM primaris en resposta a la inflamació. Després de l'estimulació de LPS, vam trobar que GAPLNC es va reduir ràpidament (Fig. 2I). A més, mitjançant qPCR mostrem que GAPLNC també està regulat a la baixa després de l'activació amb una varietat deTLRlligands (apèndix SI, fig. S7A). Es va confirmar la inducció de gens inflamatoris de control positiu TNF-a, IL6 i CCL5 (apèndix SI, figura S7B). Aquestes dades suggereixen que l'expressió de GAPLNIC s'ha de reduir després de l'estimulació per tal que es produeixi una inducció gènica inflamatòria òptima. Per avaluar el paper de NF-kB en el control de l'expressió de GAPLNIC, els MDM van ser pretractats amb dimetilsulfòxid (DMSO) o BAY11-7082, un inhibidor de NF-B,

seguida d'estimulació amb LPS durant 6 h. En els MDM tractats amb BAY11-7082-. la regulació a la baixa de GAPLNC es va veure afectada en relació al control (Fig. 2/). cosa que suggereix que la regulació de GAPLNC depèn de la senyalització NF-KB. Es va confirmar la inducció de gens inflamatoris de control positiu TNF- i IL6 després de l'estimulació de LPS (SIAppendix, Fig, S7C). Per entendre com s'està regulant GAPLNIC, vam utilitzar Assay for Transposase-Accessible Chromatin mitjançant la seqüenciació (ATAC-seq) en MDM per avaluar l'accessibilitat de la cromatina del locus GAPLNC. Hem trobat que GAPLIC es transcriu activament en macròfags en repòs, però tancat fortament després de l'estimulació de LPS (Fig. 2K), cosa que suggereix que GAPLIC està regulat a nivell de transcripció.

Explorar la conservació de GAPLNC entre humans i ratolins. hem intentat identificar loci sintènics, en què els gens es conserven posicionalment entre els mateixos dos gens que codifiquen proteïnes. seguida d'una avaluació per a la conservació funcional. Aquí, mostrem que Gaplinc es conserva posicionalment, localitzant una transcripció entre els gens Dlgap1 i TgifI (Fig.3A). Per confirmar l'especificitat del tipus cel·lular, hem utilitzat el Mouse Cell Atlas (MCA)

(10) per avaluar els nivells de transcripció a través de les cèl·lules immunitàries de la medul·la òssia (BM) i es va trobar que s'expressava més altament en macròfags, amb nivells més baixos d'expressió en progenitors de neutròfils (Fig. 3B). A continuació, per determinar si es van conservar els patrons d'expressió durant la diferenciació de macròfags tant en humans com en ratolins, vam realitzar RNA-Seq comparant cèl·lules BM amb macròfags derivats de la medul·la òssia (BMDM), vam completar el muntatge de la transcripció de novo i vam trobar que els nivells de Gaplinc del ratolí van augmentar després de la diferenciació. (Apèndix SI, Fig. S8A). Ho vam validar mitjançant qPCR, comparant els nivells de Gaplinc a les cèl·lules BM amb els BMDM (Fig. 3C). Comparable al GAPLNIC humà. ratolí Gaplinc es regula ràpidament a la baixa en BMDM estimulats per LPS (Fig. 3D). Com a control, vam confirmar la inducció dels gens inflamatoris The-a i I6 (Apèndix SI. Fig. S8B). Mouse Gaplinc també es regula ràpidament després de l'activació amb diversos lligands TLR. També es va confirmar la inducció dels gens de control positiu ll6 i Ccl5 (apèndix SI, fig. S8C).

Utilitzant CRISPR, vam generar un ratolí Gaplinc knockout (KO) en el qual es van eliminar l'exó I i la majoria del primer intró (Fig. 3E). Els ratolins Chaplin KO es van criar amb normalitat i no van mostrar defectes de desenvolupament evidents. La supressió de Gapline es va confirmar mitjançant l'amplificació per PCR de l'ADN genòmic en ratolins de tipus salvatge (WT) i Gaplinc KO, amb mides d'amplicon ~ 1.300 pb per a WT i ~ 500 pb per a ratolins Gaplinc KO (Fig. 3E), L'estratègia de genotipat completa per confirmar WT i Gaplinc KO es destaca a l'apèndix SI, figura S9. També vam confirmar la deficiència de Gaplinc en BMDM mitjançant qPCR (Fig. 3F). Per avaluar si la deficiència de Gaplinc va afectar la diferenciació, vam tacar els BMDM WT i Gaplinc-KO per a CD11B i F4/80; els patrons de tinció eren similars, cosa que suggereix una diferenciació normal dels macròfags (apèndix SI, fig. S104). Per avaluar si Gaplinc KO va alterar la funció dels macròfags, vam comparar l'activitat de fagocitosi en els BMDM WT i Gaplinc-KO i no vam trobar diferències (apèndix SI, Fig. S10B).

Per avaluar l'impacte global de la deficiència de Gaplinc en els macròfags, vam realitzar RNA-Seq en BMDM WT i Gaplinc-KO; tots dos no van ser tractats i LPS estimulat durant 6 h. En els BMDM Gaplinc-KO, l'expressió de 23 gens (mostrats en vermell. Fig.3G) es va regular significativament a la línia de base. Aquests gens inclouen citocines i quimiocines proinflamatòries (Il6.l1-a. I{1-8 i Cxd10), ISG (Ifitlbl1), membres de la família GBP (Gbp5 i Gbp0) i marcadors de superfície cel·lular específics per als macròfags activats (Cd69). L'anàlisi GO va confirmar que els gens implicats en la resposta immune estan sobrerepresentats en els BMDM Gaplinc-KO a la línia de base (Fig. 3H). Aquests gens solen estar regulats a l'alça després de l'estimulació amb LPS (apèndix SI. Fig. S11). De manera similar a les dades obtingudes dels nostres estudis humans, aquestes dades suggereixen queGAPLNICes conserva funcionalment entre espècies per controlar bàsicament l'expressió dels gens de resposta inflamatòria (IRG). No hi va haver cap diferència important en els gens que estaven regulats després de l'estimulació LPS entre els BMDM WT i Gaplinc-KO (Dataset S1).

Nombrosos estudis han demostrat la capacitat dels IncRNAs per regular la transcripció de gens veïns(11). Com a tal, vam explorar possibles papers reguladors cis per a Gaplinc, ja que el seu gen veí, Tgif1, s'ha implicat anteriorment en la modulació de l'activació dels macròfags (12). Utilitzant les nostres dades d'ARN-Seq, vam confirmar que en els BMDM GaplincKO, l'expressió de Tgifl en relació amb les cèl·lules T no es va veure afectada (SIAppendir.Fig.S124). A més, vam confirmar per qPCR que Tgifl no es va alterar als BMDM Gaplinc-KO (apèndix SI, figura S12B). A continuació, vam explorar la possibilitat que la interrupció del locus Gaplinc pogués eliminar un element regulador important, com ara un potenciador. Hem utilitzat dades ATAC-seq de WT BMDM per avaluar regions transcripcionalment actives al locus Gaplinc (13). No vam identificar senyals dins de la regió de supressió de Gaplinc, només els corresponents al promotor de Gaplinc (apèndix SI. Fig. S13). Col·lectivament, aquestes dades suggereixen que la regulació de l'IRG davant la deficiència de Gaplinc no es deu als efectes sobre els gens veïns o a l'eliminació d'un element regulador.

Com que Gaplinc KO en BMDM regula l'expressió dels IRG en condicions basals, a continuació vam voler desafiar els animals Gaplinc KO in vivo per observar diferències en la resposta de l'hoste. Hem utilitzat un model de "xoc endotòxic". en què Escherichia coli LPS es va injectar intraperitonealment (ip) a ratolins WT i Gaplinc KO per mesurar les diferències de supervivència. A una dosi de 5 mg/kg/ratolí. Els ratolins WT van mostrar un 0 per cent de supervivència després de 2 dies (Fig. 30. No obstant això, el 100 per cent dels ratolins Gaplinc KO van sobreviure, sg-aconseguint que els ratolins Gaplinc KO tenen resistència al xoc endotòxic induït per LPS (Fig. 31). , s'observen diferències significatives de temperatura entre els ratolins amb deficiència de Gaplinc i WT (Fig. 3). Fins i tot quan s'utilitzen una dosi molt més alta de LPS de 20 mg/kg, els ratolins amb deficiència de Gqplinc mostren un avantatge significatiu de supervivència (Fig. 3K). , aquestes dades mostren que Gaplinc té un paper important en la regulació de la resposta immune in vivo.

A partir dels nostres estudis humans, sabem que GAPLNC pot regular els gens immunitaris a la línia de base. Tot i que no hi ha cap diferència en l'expressió de citocines després de l'activació inflamatòria, hi ha una diferència en la magnitud de la resposta ja que els nivells de referència difereixen, per tant, per entendre millor aquestes diferències de supervivència in vivo, vam avaluar els canvis en l'expressió de citocines a la línia de base. Hem utilitzat una matriu de citocines multiplexades per mesurar simultàniament biomarcadors associats a la resposta immune, la sèpsia i el càncer. A la línia de base, gens immunes clau inclòs MDC. MIP-1a.IL-13. IL-5. i M-CSF es va elevar significativament en el sèrum de ratolins Gqplinc KO en comparació amb WT (Fig.44). Aquestes citocines estan implicades en el reclutament de cèl·lules: tanmateix, mitjançant citometria de flux, vam confirmar que el percentatge de neutròfils, cèl·lules T, cèl·lules B, eosinòfils, monòcits i macròfags eren comparables entre WT i Gaplinc KOmice a la línia de base (Apèndix SI, Fig. S14) . Curiosament, aquests percentatges també eren comparables als reptes post-LPS als punts de temps de 6 h i 18 h (apèndix SI, figures S15 i S16). A més, el sèrum de ratolins WT i Gaplinc KO provat per a les característiques clíniques de la sèpsia, inclòs el lactat i la proteïna C reactiva (CRP) (Apèndix S7, Fig. S17), no va mostrar diferències.

Com que els nivells augmentats de MDC o IL-13(Fig.44) s'han caracteritzat prèviament per tenir un paper protector contra el xoc endotòxic mitjançant la modulació de citocines proinflamatòries (14, 15), a continuació vam examinar les diferències en els nivells de citocines proinflamatòries. , incloent l6, Il1-, l1- i Cxcl10, després de l'activació inflamatòria. Tot i que els nivells de WT i Gaplinc KO són ​​els mateixos tant a la transcripció (Fig. 4B) com a la proteïna (apèndix SI, Fig. S18A-C), la magnitud del canvi és molt menor (Fig. 4C), cosa que suggereix que aquest plec reduït. el canvi pot tenir un paper en la prevenció de la susceptibilitat dels ratolins Gaplinc KO a LPS. xoc endotòxic induït.

Juntament amb la producció desenfrenada de citocines. Un altre aspecte clínic del xoc endotòxic que pot conduir a la mortalitat és la formació de coàguls de sang als vasos més petits, que condueixen a una fallada multiorgànica (16.17). Per solucionar-ho, vam analitzar el sèrum de ratolins tractats amb LPS ip. per avaluar les diferències en la coagulació. Mitjançant un assaig de temps de tromboplastina parcial activat (a) que mesura el temps per a la formació de coàguls, trobem que els ratolins WT mostren un temps significativament perllongat en comparació amb els ratolins Gaplinc KO després del repte LPS (Fig. 4D). Els temps prolongats d'aPTT suggereixen que els ratolins WT ja han patit coagulació i han esgotat els factors clau de coagulació, de manera que en el moment de la prova, l'inici de la coagulació i la mesura, el temps per a la formació de coagulació augmenta. Les dades suggereixen que les diferències en la supervivència en el desafiament de LPS es deuen a que els ratolins WT pateixen un augment de la coagulació, provocant una eventual insuficiència d'òrgans i la mort.

A continuació, vam intentar entendre de manera mecànica com Gaplinc està mediant aquest efecte. Primer, vam confirmar la seva localització i vam analitzar els nivells de Gaplinc tant als compartiments citoplasmàtics com nuclears dels BMDM mitjançant qPCR. Similar al GAPLNIC humà. El Gaplinc del ratolí era predominantment citoplasmàtic (apèndix ST, Fig. S19). A continuació, vam realitzar una identificació completa modificada de proteïnes d'unió a l'ARN (ChIRP), juntament amb espectrometria de masses i seqüenciació d'ARN petit, ja que prèviament s'ha demostrat que GAPLNIC interactua amb micro ARN (18). No vam observar interaccions amb objectius identificats prèviament (SIAppendix, Fig. S20).

Com que no vam poder identificar un soci d'unió directa, ens vam centrar en la funció conservada entre humans i ratolins, concretament en els gens conservats afectats en els nostres estudis humans GAPLINC kd i Gaplinc KO del ratolí, la majoria dels quals són reguladors de NF-kB (Fig. 4E). ). La forma més abundant de NF-KB activada per LPS és l'heterodímer p65:p50, i set dels nou gens conservats són dianes directes de p65(19). Hem utilitzat la immunoprecipitació d'ARN natiu (RIP) i hem demostrat que no hi ha interacció directa entre Gaplinc i p65 (S7 Apèndix, Fig. S21). a I-kB- inhibidor a les cèl·lules en repòs. Després de l'activació, I-KB- es degrada, permetent que p65:p50 es transloqui al nucli i activi els gens diana (20). En els BMDM WT i Gaplinc-KO, vam mesurar la degradació d'I-kB- mitjançant Western blot i no vam trobar diferències (Fig. 4F). A continuació, vam comparar els nivells totals de p65 en BMDM. A les nostres dades d'ARN-Seg, els nivells de transcripció de p65 (RelA) tant a les condicions basals com a les estimulades per LPS per als BMDM WT i Gaplinc-KO són ​​comparables (apèndix SI, figura S22). Tanmateix, quan vam comparar els nivells totals de proteïna p65 mitjançant Western blot, vam trobar un augment significatiu dels nivells de p65 a les cèl·lules Gaplinc-KO en comparació amb WT (Fig. 4G). Això suggereix que Gaplinc regula els nivells totals de p65 a nivell translacional. A més, vam avaluar els nivells de p65 als compartiments citoplasmàtics i nuclears i vam trobar que la p65 nuclear és més abundant a les cèl·lules amb deficiència de Gaplinc en comparació amb WT (Fig. 4H). Combinades, aquestes dades suggereixen un paper mecanicista per a GAPLNC en l'activació d'IRG crítics.

Discussió

Aquí, hem identificat GAPLNIC com un IncRNA conservat expressat citosòlicament en humans i ratolins que funciona per controlar l'expressió gènica inflamatòria mitjançant la regulació de NF-xB. En comparació amb els IncRNAs citosòlics reportats que afecten l'eficiència de la traducció mitjançant la modulació de l'expressió de proteïnes o el conjunt de ribosomes (21-23), trobem que Gapline contribueix citosòlicament a la capacitat de traducció de p65; tanmateix, el mecanisme d'interacció, ja sigui directe o indirecte, queda per determinar. Les nostres troballes proporcionen informació sobre com un IncRNA conservat funcionalment regula la resposta immune i proporcionen vies d'investigació per al desenvolupament de terapèutiques per al xoc endotòxic.