Un model transgènic revela el paper de Klotho en el desenvolupament del càncer de pàncrees i obre el camí per a una nova teràpia basada en Klotho

Si us plau, feu clicoscar.xiao@wecistanche.comper a més informació

Resum simple:El nostre objectiu és estudiar el paper de la proteïna anti-envelliment klotho i la seva isoforma secretada, Regne Unit, en el càncer de pàncrees. Tres models in vivo, inclòs un nou model de ratolí genètic i anàlisis bioinformàtiques, van indicar klotho com a supressor de tumors en l'adenocarcinoma ductal pancreàtic i van donar a conèixer un patró d'hipermetilació de l'ADN klotho únic en tumors pancreàtics. Aquests resultats tenen un valor pronòstic significatiu i, a més, suggereixen que pot servir com a agent terapèutic per a l'adenocarcinoma ductal de pàncrees.

Feu clic aquí per saber-ne més

Resum: Klotho és una proteïna transmembrana anti-envelliment, que es pot eliminar i pot funcionar com a hormona. Les dades acumulades indiquen que klotho és un supressor de tumors en una àmplia gamma de tumors malignes i designen el subdomini KL1 com la regió activa de la proteïna per a aquesta activitat. El nostre objectiu és estudiar el paper del klotho com a supressor de tumors en l'adenocarcinoma ductal pancreàtic (PDAC). Les anàlisis bioinformàtiques dels conjunts de dades The Cancer Genome Atlas (TCGA) van revelar una correlació entre la supervivència dels pacients amb PDAC, els nivells d'expressió de klotho i la metilació de l'ADN, i van demostrar un patró d'hipermetilació únic de klotho en tumors pancreàtics. Els efectes in vivo de klotho i KL1 es van examinar mitjançant tres models de ratolí. Utilitzant un nou model genètic, combinant la derrota del klotho pancreàtic amb una mutació a Kras, la manca de klotho va contribuir a la generació de PDAC i a la disminució de la supervivència del ratolí. En un model de xenograft, l'administració de partícules virals que portaven el cel, una isoforma de klotho empalmada que conté el domini KL1, va inhibir els tumors pancreàtics.comprar cistancheFinalment, el tractament amb cel soluble va prolongar la supervivència de Pdx1-Cre; KrasG12D/ plus ; Ratolins Trp53R172H/ plus (KPC), es coneix un model per recapitular el PDAC humà.bioflavonoides,En conclusió, aquest estudi proporciona proves que el klotho és un supressor de tumors en PDAC. A més, aquestes dades suggereixen que els nivells d'expressió de klotho i metilació de l'ADN podrien tenir valor pronòstic en pacients amb PDAC, i que l'administració de sKL exògena pot servir com una nova estratègia terapèutica per tractar PDAC.

Paraules clau:klotho; KL1; sKL; supressor de tumors; càncer de pàncrees; PDAC

1. Introducció

El càncer de pàncrees es troba entre els càncers més agressius, amb una taxa de supervivència 5-any del 9 per cent . La incidència i la mortalitat estan augmentant, amb 60.430 casos nous i 48.220 morts previstes el 2021 només als EUA[1]. L'adenocarcinoma ductal pancreàtic (PDAC) representa el 85-90 per cent de totes les neoplàsies pancreàtiques malignes. Els models actuals indiquen el seu desenvolupament des de la neoplàsia intraepitelial pancreàtica benigna (PanlN)1-3 fins a un carcinoma invasiu, juntament amb l'adquisició de mutacions genètiques. L'activació de Kras es considera el primer pas cap a la malignitat [2] i, en models de ratolí, condueix al desenvolupament de PanIN als 9 mesos [3]. Tot i que la PDAC oberta en aquests ratolins és poc freqüent, en el model KPC, que combina la mutació de Kras amb la pèrdua del supressor de tumors p53 [4], la PDAC normalment es desenvolupa als 3-6 mesos d'edat [5].

Cistanche pot anti-envelliment

Klotho (aquí utilitzat com a klotho) és una proteïna transmembrana de tipus I implicada en la regulació de l'envelliment [6]. En els ratolins, la deficiència de klotho condueix a una síndrome que s'assembla a l'envelliment accelerat, mentre que la sobreexpressió de klotho allarga la vida útil [7, 8]. La regió extracel·lular klotho està formada per dos dominis homòlegs, KL1 i KL2, que es poden escindir de la membrana i actuar com a hormones circulants [9-11]. Es secreta una segona isoforma de klotho empalmada diferencialment (Regne Unit). El cel és idèntic al KL1, més 15 aminoàcids addicionals a l'extrem C-terminal. S'han descrit diferents activitats de klotho, inclosa l'activació de la senyalització del factor de creixement de fibroblasts (FGF) 23 [12, 13], la regulació del canal de calci de la subfamília V (TRPV) 5 del canal catiònic potencial del receptor transitori [14, 15] i la inhibició del les vies de la insulina i del factor de creixement semblant a la insulina (IGF)-1 [8,16,17].

Klotho s'expressa principalment als ronyons i al cervell, però també a diversos teixits, inclòs el pàncrees exocrí i endocrí [7,17-20]. Les seves activitats fisiològiques al pàncrees encara s'han de determinar; tanmateix, hi ha proves de la seva implicació en la regulació de l'homeòstasi de la glucosa. Klotho indueix la producció i secreció d'insulina in vitro i in vivo, atenua la sensibilitat a la insulina en els ratolins i s'esgota als illots pancreàtics dels pacients amb diabetis mellitus tipus 2 (T2DM) [8, 19-22). Klotho és un potent supressor de tumors en nombroses malalties malignes, inclosos els càncers gastrointestinals [16,17,23-30]. Es silencia epigenèticament en càncer, i tant klotho com Karl redueixen el creixement de cèl·lules canceroses in vitro i in vivo [16,17,23,25,26,28,31-33]. En el càncer de pàncrees, la regulació a la baixa de klotho es correlaciona amb la supervivència del pacient. In vitro, klotho redueix el creixement de cèl·lules canceroses de pàncrees i inhibeix les vies IGF-I i bFGF [17,34].

En aquest estudi, vam voler desxifrar el paper de klotho com a supressor de tumors en PDAC mitjançant la utilització de tres models in vivo. Utilitzant un model genètic nou, vam demostrar que la derrota del klotho pancreàtic va contribuir al desenvolupament de PDAC i va reduir la supervivència dels ratolins mutants Kras. En un segon model, vam demostrar que l'administració de partícules virals que portaven sKL inhibia els tumors pancreàtics en un model de xenograft. Finalment, el tractament amb cel recombinant soluble va prolongar la supervivència dels ratolins KPC. Aquests resultats manifesten el paper del koto com a actor important en el desenvolupament del PDAC i suggereixen el klotho com a estratègia terapèutica per tractar pacients amb PDAC.

2. Materials i Mètodes

2.1. Anàlisi TCGA mitjançant el navegador UCSC Xena

Els conjunts de dades d'expressió gènica RNAseg (IlluminaHiSeq) i metilació de l'ADN (Methylation450k) per a la cohort de càncer de pàncrees (PAAD) The Cancer Genome Atlas (TCGA) es van estudiar mitjançant el navegador Xena de la Universitat de Califòrnia Santa Cruz (UCSC) (http://xena.ucscedu/, consultat el 19 de juliol de 2020)[35].cistanchMitjançant el navegador Xena, es va analitzar la supervivència global i l'interval sense progressió dels pacients amb càncer de pàncrees segons les expressions de klotho o la metilació de l'ADN KLOTHO i es van crear diagrames de Kaplan-Meier. Les dades individuals duplicades es van eliminar filtrant només per a tumors primaris. Les dades d'expressió gènica, donades en unitats log2 (x més 1), es van dividir en dos grups segons la mediana; Les dades de metilació de l'ADN es van dividir en dos grups segons els quartils inferior i superior.

Per a la metilació d'ADN KLOTHO específica del lloc, es van analitzar més mostres amb nivells baixos o alts d'expressió de klotho, tal com es defineixen pels quartils inferiors o superiors, respectivament. Es van calcular els valors 36] per a cada lloc de metilació i es va examinar la correlació amb l'expressió de klotho a la mostra corresponent mitjançant el coeficient de correlació de Pearson (r).

2.2. Productes químics, anticossos i construccions

Els productes químics utilitzats en aquest estudi incloïen la variant d'empalmament humà soluble klotho, que comprenia aminoàcids34-549(domini d'esquí; número d'accés BAA24941.1), amb una seqüència única d'15-aminoàcids a l'extrem C-terminal ({ {6}}; PeproTech Inc, Rocky Hill, NJ, EUA); glucosa （Floris, Misgav, Israel）, insulina humana （Actrapid; Novo Nordisk A/S, Bagsværd, Dinamarca) i luciferina (122799; PerkinElmer, Waltham, MA, EUA).

Els anticossos utilitzats en aquest estudi van incloure el control de l'isotip IgG2a de rata (02-9688; Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, EUA) i l'anti- -actina (A5441; Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, EUA) . Els anticossos anti-klotho dirigits contra el domini KL1 (KM2076) van ser un regal amable de Kyowa Hakko Kogyo Co., Ltd., Tòquio, Japó.

2.3.Producció i purificació de vectors AAV

Els vectors AAV9, el vector buit nul i el cel (que contenen l'isoforma de la variant d'empalmament de klotho secretada, número d'accés BAA24941.1) es van produir i purificar a les instal·lacions de nivell 2 de bioseguretat de la United Mixta UAB-VHIR i la Unitat de producció de vectors (VPU) Breument , els vectors es van generar mitjançant el sistema de transfecció triple a les cèl·lules HEK293. Després de 48 h, es van recollir vectors AAV, es van tractar amb benzonasa, es van purificar en un gradient de iodixanol i es van valorar amb PicoGreen [37]. L'expressió transgènica va ser impulsada per un promotor de CMV, tal com es va descriure anteriorment [37].

2.4. Manteniment d'animals

El manteniment i els experiments del ratolí es van dur a terme al Centre Mèdic Sourasky (Tel Aviv, Israel) i d'acord amb les normatives i estàndards del Comitè d'Ús i Cura d'Animals del Centre Mèdic Sourasky.

Les soques de ratolí utilitzades per als models transgènics estaven totes sobre un fons mixt C57BL/6 i JVB/NJ. Els ratolins Pdx1-Cre, LSL-KrasG12D/ plus i LSL-Trp53R172H/ plus t van ser regals amables del Dr. Ziv Gil (Technion-Institut de Tecnologia d'Israel a Rambam, Haifa, Israel).

2.5. Models de ratolí Knockdowm KLOTHO específics per al pàncrees

Per tal d'orientar la derrota de KLOTHO al pàncrees del ratolí, es van generar ratolins que portaven al·lels KLOTHO floxats (KLlox), tal com es va descriure anteriorment [38].cistanche AustràliaEls ratolins Keflex/flox es van creuar amb ratolins Pdx1-Cre, expressant la recombinasa Cre controlada pel promotor de Pdxl, obtenint així Pdx1-Cre; KL-/-ratolins. La derrota pancreàtica de KLOTHO es va confirmar amb immunohistoquímica i nivells d'ARNm, tal com es descriu a continuació.

Per generar ratolins que contenen la derrota de KLOTHO controlada pel promotor Pdxl i l'expressió Kras mutant, es van creuar ratolins LSL-KrasG12D/ plus [3], que portaven una seqüència Lox-Stop-Lox seguida d'un al·lel Kras mutant, amb ratolins KLflox/flox. Aquests ratolins es van creuar més amb ratolins Pdx1-Cre, donant lloc a Pdx1-Cre; KL-/-; KrasG12D/ més ratolins. LSL-KrasG12D/ plus també es van creuar amb ratolins Pdx1-Cre per separat, i aquest Pdx1-Cre; Es van utilitzar ratolins KrasG12D/ plus com a control. Els ratolins es van examinar diàriament per detectar signes de patiment, com ara respiració difícil, canvis importants de pes i tumors grans (més d'1 cm), i es van sacrificar els que complien els criteris establerts pel comitè ètic. Es va controlar la supervivència dels ratolins, amb la mort definida de manera espontània o per signes que necessitaven el sacrifici. A causa de la ràpida digestió del teixit pancreàtic per part dels líquids pancreàtics, només vam poder examinar el pàncrees dels ratolins que havien estat sacrificats. Els teixits es van recollir i es van mantenir en formaldehid durant 24 hores, que després es van substituir per etanol al 70%.

2.6. Estudis de xenograft de tumors de ratolins

Les femelles de ratolins nus atímics (fons BALB/c), de {{0}} setmanes d'edat, es van comprar a Envigo RMS (Jerusalem, Israel). Els ratolins es van allotjar i mantenir en armaris de flux laminar en condicions específiques lliures de patògens. El primer dia de l'experiment, les cèl·lules MIA PaCa-2 que expressaven de manera estable m-Cherry/luciferasa es van inocular per via subcutània (sc) als seus flancs （n=21, cèl·lules 1 × 10 graus en 100 μL de 5 per cent FCS DMEM mitjà）. Deu dies després de la inoculació del tumor, es va injectar intramuscularment una dosi alta (5 × 1011 GC/mL, n=7) o una dosi baixa (5 × 1010GC/ml, n{=6) d'AAV humà. (im).AAV-null va servir de control (5 × 1010 GC/mL, n=8). Els tumors es van mesurar amb un calibre digital tres vegades per setmana i el volum es va calcular mitjançant la fórmula de càlcul del volum el·lipsoide (0, 5 × longitud × amplada2). El dia 20 de l'experiment, els tumors es van avaluar in vivo controlant l'activitat luciferasa de la cèl·lula MIA PaCa-2 mitjançant la injecció de 150 ug/ml de luciferina intraperitonealment, i la intensitat de la luciferasa es va mesurar mitjançant Biospase.

El mateix dia, l'experiment va acabar i els ratolins van ser sacrificats. Els tumors es van extirpar, es van pesar i es van mesurar amb un calibre digital. Es va recollir sang abans de l'eutanasia i es van mesurar els nivells de klotho humà en sèrum mitjançant ELISA (IBL, Minneapolis, MN, EUA). Es van utilitzar cinquanta microlitres de sèrum per mostra (en duplicats) per a ELISA, i l'assaig es va dur a terme segons les instruccions del fabricant. La correlació entre el pes dels tumors i els nivells sanguinis de klotho humà es va examinar mitjançant el coeficient de correlació de Pearson.

2.7. Models de ratolí KPC

La generació de ratolins KPC es va fer mitjançant l'encreuament de ratolins LSL-Trp53R172H/ plus [5] que portaven una seqüència Lox-Stop-Lox, seguida d'un al·lel p53 mutant puntual que funciona com una mutació nul·la, amb ratolins LSL-KrasG12D/ plus t. Aquests es van creuar més amb ratolins Pdx1-Cre, donant lloc a Pdx1-Cre; KrasG12D/ plus ; Trp53R172H/ més ratolins. Els ratolins es van emparellar segons el sexe, l'edat i el pes, i es van assignar aleatòriament per rebre tractament amb injeccions intraperitoneals (ip) de pell humana soluble (15 mg/kg, dues vegades per setmana) o control de vehicles (n =6 per al grup tractat amb cel; n =7 per al grup control). El tractament va continuar fins a 30 setmanes. Els ratolins es van examinar diàriament per detectar signes de patiment, com ara respiració difícil, canvis importants de pes i tumors grans (més d'1 cm), i es van sacrificar els que complien els criteris establerts pel comitè ètic. Es va controlar la supervivència dels ratolins, amb la mort definida de manera espontània o per signes que necessitaven el sacrifici.

2.8. Genotipat

Es van prendre cues de ratolí a les 3 setmanes d'edat per genotipar. L'ADN es va extreure per incubació de la cua en una solució de lisi alcalina, formada per 250 μM de NaOH i 2 μM d'EDTA disòdic (pH 12.0), durant 30-60 min a 95 graus. , seguida de neutralització amb 0,4 mM Tris HCL (pH 5,0). Posteriorment, l'ADN es va sotmetre a una amplificació per PCR per als diferents genotips, utilitzant REDTaq ReadyMix PCR Reaction Mix (Sigma-Aldrich, Rehovot, Israel). Els cebadors estaven a una concentració final de 1000 nM. Els cicles i els primers de PCR es detallen a la taula S1. Els productes es van electroforitzar en gels d'agarosa a l'1,5 per cent i es van tacar amb bromur d'etidi.

2.9. Anàlisi d'immunohistoquímica (IHC).

Els teixits es van fixar en un 4% de paraformaldehid i els teixits incrustats es van seccionar en sèrie. Les seccions es van tacar amb hematoxilina i eosina (H&E) i es van examinar microscòpicament per un patòleg experimentat, o es van tacar amb IHC, tal com es descriu. Per al klotho IHC, les seccions fixades amb formalina i incrustades en parafina, de 4 um de gruix, es van desparafinar amb xilè i es van rehidratar. La recuperació d'antígen es va realitzar mitjançant un bany calent (95 graus) durant 2 0 min en tampó de citrat pH 6, 0. Després de refredar-se durant 30 min, es van esbandir les diapositives en tampó TBS-tritó (TBS-T).avantatges de cistanchePosteriorment, es va realitzar un bloc de peroxidasa endògena durant 10 min en un 3% d'H, O/metanol. Després d'esbandir a TBS-T, les seccions es van bloquejar durant 30 min utilitzant un 5% de BSA a TBS-T i més tard es van incubar durant la nit amb anticossos primaris klotho a 4 graus. La detecció es va realitzar amb ZytoChem Plus (HRP) One-Step Polymer anti-ratolí/conill/rata (ZUC053; Zytomed Systems, Berlín, Alemanya). La IgG2a de rata va servir com a control d'isotip.

2.10. Reacció en cadena de la polimerasa de transcripció inversa (RT-PCR)

Pàncreata de Pdxl-Cre sacrificat; Els ratolins de control KL-/- i KLflox/flox es van extirpar, es van congelar en nitrogen líquid i es van emmagatzemar a -80 graus. Després de l'homogeneïtzació del pàncrees, es va preparar l'ARN total mitjançant el kit d'aïllament d'ARN (Sigma) i es va transcriure inversament mitjançant JScript cDNA SuperMix (Quanta BioSciences, Gaithersburg, MD, EUA). L'ADNc es va amplificar per a klotho i -actina (com a control de càrrega) mitjançant REDTaq ReadyMix PCR Reaction Mix (Sigma). La PCR es va optimitzar a 94 graus durant 5 minuts, seguit de cicles de 30 s a 94 graus, els 90 a 52,5 graus i 20 s a 72 graus (45 cicles per a klotho, 25 cicles per a -actina) i 10 min a 72 graus per a l'extensió, utilitzant primers de klotho de 12,5 pmol (F,5-ACGTTCAAGTGGACACTACTCT-3'i R,5'-TTCTTIGGCTACAACCCCGTC-3') i cebadors d'actina de 5 pmol (F,5') -TGTTACCAACTGGGACGACA-3'i R,5'-GGGGTGTTGA AGGTCTCAAA-3). Els productes es van electroforitzar en gels d'agarosa a l'1,5% tenyits amb bromur d'etidi. La quantificació es va fer mitjançant el programari ImageJ, National Institutes of Health, Bethesda, MD, EUA.

2.11.Anàlisi estadística

Els resultats es presenten com a mitjana ± SD o SEM, tal com s'ha esmentat. Les variables contínues es van comparar mitjançant la prova t tret que s'indiqui el contrari. Totes les proves de significació eren de dues cues i es va considerar estadísticament significatiu un valor p inferior o igual a 0.05. La correlació es va avaluar mitjançant el coeficient de correlació de Pearson (r). L'anàlisi de la supervivència es va fer mitjançant el test de rang logarítmic.

3. Resultats

3.1.Els nivells d'expressió de Klotho i la metilació de l'ADN en els tumors pancreàtics es correlacionen amb la supervivència dels pacients amb càncer

La cohort de càncer de pàncrees (PAAD) del navegador del genoma del càncer (TCGA) es va examinar mitjançant el navegador Xena de la Universitat de Califòrnia Santa Cruz (UCSC) [35]. Les anàlisis d'expressió gènica van revelar una supervivència global (SO) reduïda i un interval lliure de progressió (PFI) per als pacients amb càncer de pàncrees amb tumors que expressen klotho baix, en comparació amb l'alt (n =89 per a cada grup; figura 1A, B). L'examen de les dades de metilació va mostrar una tendència compatible de SO i PFI obstaculitzats en pacients que tenien tumors amb nivells elevats de metilació de l'ADN KLOTHO, en comparació amb els baixos (n=45 i n{=46, respectivament; Figura 2A, B) .

Further analyses of gene expression and methylation data (Table S2) revealed three specific sites, evaluated by probes cg23282559, cg02441765, and cg25650964, which were hypermethylated(IDelta βI>0.15)and negatively correlated to klotho expression(Irl>0.3) en el càncer de pàncrees humà (figura 2C-E).

3.2. Generació de ratolins pancreàtics KLOTHO Knockdown

Els ratolins no condicionats KLOTHO moren al voltant de les 8-9 setmanes d'edat [7], per tant, no poden servir de models per al desenvolupament del càncer. Per tant, teníem com a objectiu dirigir la derrota de KLOTHO al pàncrees dels ratolins. Amb aquest objectiu, es van creuar ratolins Pdx1-Cre amb ratolins que portaven al·lels KLOTHO floxats, KLlox/lox [38], obtenint així Pdx1-Cre; Ratolins KL-/- (Figura 3A, B). Els nivells d'ARN i proteïnes van validar la derrocació del klotho pancreàtic (Figura 3C-E). Pdx1-Cre; Els ratolins KL-77 van mostrar un lleuger augment de pes al llarg del temps, en comparació amb el control (figura 3F), però no hi ha diferències en la glucosa sèrica o la tolerància a la insulina i la glucosa (figura S1).

Figura 3. Generació de ratolins knockdown KLOTHO pancreàtics. (A) Diagrama esquemàtic de l'al·lel KLflox: els llocs LoxP flanquegen l'exó 2 de KLOTHO, donant lloc a la seva derrota dirigida al pàncrees de Pdx1-Cre; KL-/-ratolins. El panell superior mostra l'al·lel floxat, el panell inferior mostra els resultats esperats de la recombinació Cre. (B) Gel representatiu que mostra productes de PCR del genotipat KLOTHO del ratolí: KL plus / plus (WT; 370 pb), KLl/plus (470 i 370 pb) i KLflox/flox (470 pb). (C,D) L'ARN pancreàtic es va extreure de Pdx1-Cre; KL-/-(n=7) i ratolins de control (n{=4). Els nivells d'ARNm de Klotho es van determinar mitjançant RT-PCR semiquantitativa i es van quantificar. Es mostra el gel representatiu (les taques originals sense retallar estan disponibles a la figura S2). (E) Tinció de klotho immunohistoquímica representativa del pàncrees extirpada de Pdx1-Cre; KL-/- i ratolins de control. Ampliació: X20. S/O, sense. (F) Pes dels ratolins als dos grups (n=5per grup). Analitzat mitjançant mesures repetides ANOVA.p=0.01. Les dades es presenten com a mitjana ± SEM. Control, ratolins KLflox/flox. Els ratolins que albergaven la derrota pancreàtica de KLOTHO i l'expressió mutant de Kras es van generar mitjançant l'encreuament de Pdx1-Cre amb ratolins LSL-KrasG12D/ plus [3] (ratolins Pdx{{1-Cre; KrasG12D/ plus), i més encreuament amb ells. Ratolins KLflox/lox (Pdx1-Cre; KL-/-; KrasG12D/ més ratolins). Les anàlisis es van realitzar amb ratolins mascles. Es van excloure les ratolins femelles, a causa d'una alta taxa de lesions anals tant a Pdx1-Cre; KrasG12D/ plus i Pdx1-Cre; KL-/-; Ratolins KrasG12D/ plus, que és coherent amb els informes anteriors de papil·lomes mucocutani en aquests ratolins [3].

3.3. La pèrdua de kloto pancreàtic contribueix a la reducció de la supervivència en ratolins

No hi va haver cap diferència en la supervivència de Pdx1-Cre; ratolins KL-/-, en comparació amb el control). Vam procedir a estudiar l'efecte de la derrota pancreàtica combinada de KLOTHO i la mutació de Kras sobre la supervivència mitjançant el seguiment dels ratolins durant 65 setmanes. La mort es va produir de manera espontània o per eutanàsia quan van començar els signes de patiment sever o una càrrega tumoral que va requerir sacrifici. Supervivència de Pdx1-Cre; KL-/-;KrasG12D/ més els ratolins (n ​​=21) ​​es va reduir, en comparació amb el control Pdx1-Cre; KrasG12D/ més ratolins (n=18;p= 0,02; figura 4A). Així, a l'edat de 22 setmanes, el 100 per cent (18/18) de Pdx1-Cre; Els ratolins KrasGi2D/ plus estaven vius, en comparació amb el 71 per cent (15/21) de Pdx1-Cre; KL-/-; KrasG12D/ plus ratolins. No es van observar canvis significatius de pes entre els grups (figura 4B).

Figura 4. La derrota pancreàtica de KLOTHO contribueix a reduir la supervivència i indueix PDAC in vivo. (A) Corbes de Kaplan-Meier de Pdx1-Cre; KL-/-;KrasGi2D/ plus (n=21) en comparació amb el control Pdx1-Cre;KrasGi2D/ plus (n=18)ratolins.p{=0.02.( B) Pes dels ratolins als dos grups (n=19 per grup). (CE) El pàncrees es va extirpar de Pdx1-Cre; KL-/-; KrasG12D/ plus (n=7, edat mitjana 36 setmanes)i control Pdx1-Cre; Ratolins KrasGi2D/ plus (n=8, edat mitjana 49 setmanes) després del sacrifici. (C) Comparació entre l'avaluació patològica del pàncrees tenyit amb H&E d'ambdós grups. (D) Tinció representativa d'H&E de pàncrees collida de 24-ratolins d'una setmana. Pdx1- Cre; KL-/-; KrasG12D/ plus (dreta): pèrdua completa de polaritat cel·lular, atípia nuclear significativa i brotació de grups cel·lulars al lumen ductal, juntament amb fibrosi profusa i queratina. Control Pdx1-Cre; KrasG12D/ plus (esquerra): sense lesions. Ampliació: ×10.(E) Lesions PanIN representatives dels dos grups. Ampliació: ×10.

3.4. Klotho coopera en el desenvolupament de PDAC In Vioo

A partir d'estudis anteriors que mostraven el desenvolupament de PDAC en ratolins amb mutació de Kras i pèrdua d'activitat supressora de tumors [4], vam examinar Pdx1-Cre; KL-/-; KrasG12D/ més pàncrees de ratolí per a lesions. A causa de la ràpida digestió del teixit pancreàtic per part dels líquids pancreàtics, només vam poder utilitzar el pàncrees dels ratolins que havien estat sacrificats. Mostres de Pdx1-Cre; KL-7-; KrasGi2D/ plus (n =7) ​​i control Pdx1-Cre; Els ratolins KrasGi2D/ plus (n =8) es van sotmetre a una avaluació patològica (edat mitjana de la mort: 36 i 49 setmanes, respectivament). PDAC es va identificar en dos Pdx1-Cre; KL-/-; KrasG12D/ més ratolins, però en cap dels Pdx1-Cre; KrasG12D/ més ratolins, mentre que PanN2 es va observar en dos dels Pdx1-Cre; KL-/-; KrasG12D/ més ratolins i en quatre del Pdx1-Cre; KrasG12D/ més ratolins (figura 4C). Es mostren imatges representatives (figura 4D-E).

3.5. El tractament amb sKL inhibeix els tumors pancreàtics i allarga la supervivència in vivo

The potential of SQL treatment as a therapeutic strategy for PDAC was studied using two mouse models, a xenograft model treated with a viral skin vector, and the transgenic KPCmodel treated with soluble, recombinant sKL. For the xenograft model, m-Cherry/luciferase-labeled MIA PaCa-2 cells were s.c.inoculated into nude mice. Ten days later, mice were injected with adeno-associated viruses(AAV)encoding sKL(AAV-L) at two doses. Tumor load in mice inoculated with AAV skin was significantly lower compared to the control, reflected by smaller size, weight, and luciferase signals (Figure 5A-E). Importantly, tumor weights negatively correlated with human klotho blood levels in mice (Ir| >0.729; Figura 5F-G).

El segon model utilitzat per a aquest objectiu va ser el model KPC. Els ratolins es van emparellar segons el sexe, l'edat i el pes i es van tractar amb ipinjeccions de sKL humà soluble o control de vehicles durant un màxim de 30 setmanes. La mort es va produir de manera espontània o per eutanàsia quan van començar els signes de patiment sever o una càrrega tumoral que va requerir sacrifici. La supervivència dels ratolins tractats amb sKL es va incrementar en comparació amb el control (p=0.005; Figura 5H).

Figura 5. El tractament amb sKL disminueix el creixement local del tumor i perllonga la supervivència in vivo. (AG) Es van inocular ratolins nus atímics BALB/c amb cèl·lules MIA PaCa-2 que expressaven de manera estable m-Cherry/luciferasa (1 × 10 graus per cèl·lules per ratolí). Deu dies més tard, es van injectar ratolins amb dosis altes d'AAV-sKL (5 × 1011 GC/mL, n=7), dosis baixes d'AAV-sKL (5 × 1010 GC/ml, n{{13} }), o controlar AAV-null (5 × 1010 GC/mL, n= 8). (A) Es va mesurar el volum del tumor in vivo amb un calibre digital. (B) Imatges representatives de la bioimatge de l'activitat de la luciferasa dels tumors locals. (C) L'activitat de la luciferasa dels tumors es va mesurar mitjançant recomptes per minut. (D) Imatges representatives de tumors collits el dia del sacrifici. (E) Pes dels tumors recollits. (F) Nivells sanguinis de klotho humà. *pàg<0.05, was="" calculated="" using="" the="" kruskal-wallis="" test.="" (g)="" correlation="" between="" tumor="" weights="" and="" human="" klotho="" blood=""><0.05.r, pearson's="" correlation="" coefficient.="" (h)kpc="" mice="" were="" matched="" according="" to="" sex,="" age,="" and="" weight,="" and="" randomly="" assigned="" to="" receive="" treatment="" with="" i.p.injections="" of="" soluble="" human="" skin="" (15="" mg/kg,="" twice="" weekly)or="" vehicle="" control(n="6" for="" the="" sky-treated="" group;n="7" for="" the="" control="" group)for="" up="" to="" 30="" weeks.="" kaplan-meier="" curves="" of="" skin-treated="" and="" control="" mice="" are="" presented.p=""><0.05;*><0.005;*** p=""><0.0005 compared="" to="" control.="" error="" bars,="" mean="" ±="">

4. Discussió

El present estudi estableix el paper del klotho com a supressor de tumors en PDAC. Les anàlisis bioinformàtiques van revelar una correlació entre la supervivència dels pacients amb PDAC i els nivells d'expressió de klotho i metilació de l'ADN, i van demostrar un patró d'hipermetilació únic de KLOTHO en tumors pancreàtics. Utilitzant un nou model de ratolí, vam demostrar que la derrota del klotho pancreàtic coopera amb la mutació de Kras per disminuir la supervivència i generar PDACin Vivo. A més, L va inhibir el creixement de tumors originats a partir de cèl·lules pancreàtiques en un model de xenograft i va allargar la supervivència dels ratolins KPC.

Klotho es silencia epigenèticament mitjançant la hipermetilació del promotor en una àmplia gamma de tumors malignes [16,23,25,26,28-31,33,39,40]. Això també s'ha informat en petites cohorts a PDAC, així com en una correlació entre la supervivència dels pacients amb PDAC i els nivells d'expressió de klotho i metilació de l'ADN [17,34]. D'acord, la nostra avaluació del sistema operatiu, així com la PFI utilitzant dades que comprenien 178 mostres de PDAC, van mostrar una associació positiva amb l'expressió de klotho i una associació negativa corresponent amb la metilació de l'ADN de KLOTHO. Aquestes dades indiquen a més que l'expressió de klotho pot estar regulada per la metilació de l'ADN i reforcen la idea que aquests paràmetres podrien servir per avaluar el pronòstic dels pacients amb PDAC.

Estudis anteriors de metilació de l'ADN de KLOTHO a PDAC [17, 34] es van basar en un subconjunt limitat de pacients i experiments in vitro i no van analitzar el patró de metilació de llocs específics dins de tot el gen KLOTHO. L'anàlisi actual, basada en l'extens conjunt de dades esmentat anteriorment, va revelar que tres llocs específics, dos dels quals es troben dins d'un CpGisland a l'últim exó de KLOTHO, actuen com a reguladors negatius de l'expressió de klotho per hipermetilació. Abans vam trobar que un d'aquests llocs, cg23282559, també està hipermetilat en el càncer colorectal [25]. Encara està per determinar si aquests llocs també tenen un paper en la regulació del klotho en altres malalties malignes.

Se sap que Klotho s'expressa al pàncrees; tanmateix, encara es desconeix el seu paper en el desenvolupament i la funció pancreàtics normals. Si bé els ratolins amb deficiència de klotho mostren una disminució de la producció d'insulina, juntament amb un augment espectacular de la sensibilitat a la insulina [22], la sobreexpressió de klotho en ratolins provoca un augment de la insulina en sang en dejuni, acompanyada de resistència a la insulina [8]. Sorprenentment, el model de ratolí presentat en aquest estudi, que alberga la derrota del klotho pancreàtic, no va mostrar un fenotip evident de diabetis ni una sensibilitat alterada a la insulina. A més, no hi va haver cap efecte sobre la morfologia pancreàtica, la formació de tumors o la supervivència. Aquests resultats suggereixen que la pèrdua de klotho pancreàtic es pot compensar per efectes perifèrics del klotho sistèmic o per altres mecanismes. A més, el desenvolupament de la diabetis és un procés complex, que depèn no només del pàncrees, sinó també del fetge, els músculs i els teixits grassos. Com en el nostre model, el klotho va ser derrocat principalment al pàncrees, pot explicar la manca de diabetis en aquest model de ratolí.

D'acord amb els resultats clínics presentats, Pdx1-Cre; KL-/-; Els ratolins KrasG12D/ plus tenien una vida útil escurçada en comparació amb el control Pdx1-Cre; KrasGi2D/ plus ratolins (48 vs. 60 setmanes, respectivament). Tot i que no vam poder examinar patològicament tot el pàncrees del ratolí, es va observar una taxa més alta de PDAC obert a Pdx1-Cre; KL-7-; KrasG12D/ plus ratolins, en comparació amb el control Pdx1-Cre; KrasG2D/ més ratolins. Aquests resultats demostren la importància del klotho en el desenvolupament de malignes pancreàtiques i la supervivència in vivo. El fenotip de Pdx1-Cre; Els ratolins KL-/-:KrasGl2D/ plus són menys pronunciats, en comparació amb els models que combinen la pèrdua d'altres supressors de tumors amb mutacions Kras. Com a exemple, els ratolins KPC tenen una supervivència mitjana de només 5 mesos[5]. És possible que això es degui a una compensació parcial de la pèrdua de klotho local per klotho circulant. Alternativament, l'expressió residual de klotho al pàncrees pot haver afectat el fenotip. Aconseguir un silenciament complet dirigit de klotho en estudis futurs permetria una millor subestimació del seu paper en diferents teixits, així com el contrapès entre els efectes locals i sistèmics de klotho.

Hem presentat dos models que demostren el potencial terapèutic del klotho. En un model de ratolí xenograft, les injeccions de càncer de pàncrees d'un vector de pell viral van ser molt efectives, no només per inhibir el creixement del tumor, sinó també per reduir la mida dels tumors. El tractament va començar quan els tumors ja eren visibles i establerts, semblant-se al moment d'inici del tractament en la majoria dels pacients. Els resultats suggereixen que es pot utilitzar per a la teràpia gènica, evitant així els principals obstacles per a l'estabilitat i el lliurament eficaç de fàrmacs basats en proteïnes i pèptids. A més, es va observar una correlació negativa entre el pes del tumor i els nivells sanguinis de klotho humà. Una investigació addicional dels nivells sanguinis de klotho pel que fa al seu efecte pot ajudar a predir qui es beneficiarà del tractament amb klotho o SQL, així com a mantenir els nivells dins de la finestra terapèutica.

El desenvolupament de teràpies basades en klotho és un objectiu que busquen molts grups de recerca, així com empreses farmacèutiques. Pel que fa al tractament del càncer, hi ha diverses vies que s'exploren. Es poden augmentar els nivells endògens de klotho aprofitant els mecanismes epigenètics demostrats que afecten l'expressió de klotho. S'ha informat que el promotor klotho està fortament metilat en molts càncers i també és una funció de l'edat. Així, els compostos que inhibeixen les ADN metil transferases podrien convertir-se en un objectiu terapèutic per augmentar l'expressió de klotho. D'altra banda, es poden augmentar els nivells afegint klotho de manera exògena, per exemple, emprant teràpia gènica o lliurament d'una proteïna klotho recombinant. Aquí, vam informar de la introducció de la regió activa de klotho (L) mitjançant el sistema d'expressió AAV, que va donar lloc a un efecte terapèutic en un model de càncer de pàncrees.

A continuació, vam demostrar que el tractament amb cel soluble va allargar la supervivència dels ratolins KPC, un model conegut per recapitular el PDAC humà. Això va demostrar l'efecte del cel en un amfitrió immunocompetent i un entorn de tumor natiu, donant suport encara més al possible ús de SSL en entorns clínics.

5. Conclusions

En conclusió, aquest estudi va identificar klotho com un potent supressor de tumors en PDAC. Els règims de tractament actuals per a PDAC no són suficients i l'administració de sKL exògena pot servir com una nova estratègia per al tractament de la PDAC.

Aquest article està extret de Cancers 2021, 13, 6297. https://doi.org/10.3390/cancers13246297 https://www.mdpi.com/journal/cancers