Acteòsid com a opció terapèutica potencial per al carcinoma hepatocel·lular primari: un estudi preclínic

Contacte: Audrey Hu Whatsapp/hp: 0086 13880143964 Correu electrònic:audrey.hu@wecistanche.com

Di Ma, Juan Wang, Lu Liu, Meiqi Chen i Zhiyong Wang

Resum

Antecedents: El carcinoma hepatocel·lular (HCC) és un tumor maligne comú amb característiques de mal pronòstic, alta morbiditat i mortalitat a tot el món. En particular, només hi ha algunes opcions de tractament sistèmic disponibles per als pacients amb HCC avançat i inclouen sorafenib i el règim d'atezolizumab més bevacizumab descrit recentment com a possibles tractaments de primera línia. Aquí proposem l'acteòsid, un glicòsid feniletanoide àmpliament distribuït en moltes plantes medicinals com a candidat potencial contra l'HCC avançat.

Mètodes: es van analitzar la proliferació cel·lular, la formació de colònies i la migració a les tres línies cel·lulars de HCC humanes BEL7404, HLF i JHH-7. L'assaig d'angiogènesi es va realitzar mitjançant HUVES. El model de ratolins nus amb xenograft BEL7404 o JHH-7 es va establir per analitzar els possibles efectes antitumorals de l'acteòsid. Es van utilitzar qRT-PCR i western blotting per revelar els possibles mecanismes antitumorals de l'acteòsid.

Resultats:Acteòsid de cistancheva inhibir la proliferació cel·lular, la formació de colònies i la migració a les tres línies cel·lulars de HCC humans BEL7404, HLF i JHH-7. La prohibició de l'angiogènesi per acteòsid es va revelar per la inhibició de la formació de tubs i la migració cel·lular dels HUVEC. La combinació d'acteòsid i sorafenib va ​​produir una inhibició més forta de la formació de colònies cel·lulars i la migració de les cèl·lules HCC, així com de l'angiogènesi dels HUVEC. L'eficàcia antitumoral in vivo de l'acteòsid es va demostrar encara més en el model de ratolins nus amb xenograft BEL7404 o JHH-7, amb una millora quan es combina amb sorafenib per inhibir el creixement del xenograft JHH-7. El tractament posterior de les cèl·lules JHH-7 amb acteòsid va revelar un augment del nivell de proteïna supresora de tumors p53, així com una disminució del nivell gènic de la peptidasa relacionada amb la cal·licreïna (KLK1, 2, 4, 9 i 10) sense cap mena significativa. canvis de la resta de gens KLK1-15.

Conclusions:Acteòsid de cistancheexerceix un efecte antitumoral possiblement mitjançant la seva regulació positiva dels nivells de p53, així com la inhibició de l'expressió de KLK i l'angiogènesi. L'acteòsid podria ser útil com a complement en el tractament de l'HCC avançat a la clínica.

Paraules clau: Acteòsid, Carcinoma hepatocel·lular, Sorafenib, Xenograft, p53, Kallikrein

Fons

El carcinoma hepatocel·lular (HCC) és un tumor maligne comú amb característiques de mal pronòstic i alta morbiditat i mortalitat a tot el món [1, 2]. S'han identificat diversos factors que contribueixen a l'aparició i progressió de l'HCC, inclosa la infecció pel virus de l'hepatitis B o C, la inactivació de gens supressors de tumors com p53, l'activació anormal d'oncogens com el K-ras i algunes molècules de senyalització. com ara PI3K, ERK/MAPK i Wnt/-catenina, així com l'evasió del sistema immunitari de l'hoste [3, 4]. Per al tractament de l'HCC, la resecció, el trasplantament hepàtic i l'ablació per radiofreqüència són opcions per als pacients amb HCC en fase inicial, però amb altes taxes de recurrència i metàstasi [3, 5, 6]. A més, només hi ha algunes opcions de tractament sistèmic disponibles per als pacients amb HCC avançat i inclouen sorafenib i el règim d'atezolizumab més bevacizumab descrit recentment com a possibles tractaments de primera línia [7]. En aquest context, és d'importància i interès desenvolupar nous agents dirigits a múltiples dianes moleculars o establir una nova estratègia com l'aplicació de la teràpia combinada en el tractament de l'HCC avançat.

Acteòsid de cistancheés un glucòsid feniletanoide àmpliament distribuït en moltes plantes medicinals, com ara Ligustrum purpurascens [8], Rehmannia glutinosa [9] i Ligustrum purpurascens [10]. L'evidència creixent ha demostrat que l'acteòsid pot exercir diverses activitats biològiques, inclosa la seva activitat antitumoral. Per exemple, l'acteòsid va mostrar forts efectes antiproliferatius sobre les cèl·lules canceroses de pròstata [11]. El lliurament intraperitoneal d'acteòsid va suprimir el creixement del tumor en un model de ratolí de melanoma possiblement mitjançant la inhibició de la proteïna cinasa C [12]. A més, l'acteòsid va potenciar la sensibilització de les cèl·lules del càncer colorectal a 5- fluorouracil mitjançant la senyalització PI3K/Akt [13]. Les nostres dades anteriors també han demostrat la inhibició de la melanogènesi per acteòsid a les cèl·lules de melanoma B16 [14]. Malgrat això, hi ha poca informació disponible sobre la possible eficàcia de l'acteòsid en el tractament de l'HCC i els possibles mecanismes subjacents.

En el present estudi ho hem demostratActeòsid de cistancheinhibeix la proliferació cel·lular, la formació de colònies i la migració a les tres línies cel·lulars de HCC humans BEL7404, HLF i JHH7. L'angiogènesi també s'inhibeix després del tractament amb acteòsid, com ho demostra la inhibició de la formació de tubs i la migració cel·lular dels HUVEC. L'eficàcia antitumoral in vivo de l'acteòsid es demostra encara més en el model de ratolins nus amb xenograft BEL7404 o JHH-7, amb una millora quan es combina amb sorafenib per inhibir el creixement del xenograft JHH-7. Els efectes antitumorals de l'acteòsid es podrien atribuir a la seva regulació positiva de p53, així com a la supressió de KLK i angiogènesi.

Mètodes

Cultiu cel·lular

Les línies cel·lulars de carcinoma hepatocel·lular humà (HCC) BEL7404, HLF i JHH7 es van obtenir de la American Type Culture Collection i es van cultivar rutinàriament en medi DMEM que contenia un 10 per cent de sèrum fetal boví complementat amb 100 unitats/ml de penicil·lina G i 100 ug/ml d'estreptomicina. en una incubadora humidificada a 37 graus amb un 5 per cent de diòxid de carboni. Les cèl·lules endotelials de la vena umbilical humana (HUVEC) es van aïllar de les venes del cordó umbilical humà (proporcionades per ScienCell Research Laboratories, San Diego, EUA) i es van mantenir en un medi de cèl·lules endotelials tal com es va descriure anteriorment [15].

ReactiusActeòsid de cistanche (A01) es va comprar a Jiangsu Yongjian Medicine Technology Co., Ltd. (Taizhou, Xina; Lot núm. 100581; Puresa superior o igual al 99 per cent per HPLC). El sorafenib es va obtenir de Selleck Chemicals (Houston, EUA). Vam dissoldre l'acteòsid en una solució salina al 0,9 per cent. La solució de reserva de sorafenib es va preparar en sulfòxid de dimetil (DMSO; 10 mM), es va dividir en alíquotes i es va emmagatzemar a -20 graus.

Animals

A l'estudi es van utilitzar ratolins BALB/c (Nu/Nu) mascles (18-20 g, 6-8 setmanes en el moment de la recepció) (Shanghai Slac Laboratory Animal Co. Ltd., Xangai, Xina). Els animals s'han allotjat en gàbies de polisulfona ventilades individualment en una habitació amb temperatura i llum controlada (cicle fosc de 12 h de llum- 12 h, llums enceses a les 7:00 del matí) amb accés gratuït a menjar i aigua. . Tots els protocols experimentals van ser aprovats pel Comitè Institucional de Cura i Ús d'Animals i es van realitzar seguint les directrius de l'Associació Internacional per a l'Estudi del Dolor sobre l'ús d'animals de laboratori.

Assaig de proliferació cel·lular L'activitat antiproliferativa es va realitzar mitjançant l'assaig MTT. Breument, les cèl·lules es van xapar a una densitat de 4-5 × 103 cèl·lules per pou en plaques 96-pous. Després d'haver-se unit durant la nit, les cèl·lules es van tractar amb una sèrie de concentracions d'acteòsid. Després dels tractaments amb fàrmacs en el moment indicat, les cèl·lules es van incubar amb 3-(4,5- dimetiltiazol-2-il){-2,5-bromur de difeniltetrazoli (MTT ; Roche Diagnostic Corporation, Indianapolis, IN, EUA. Concentració final: 5 ug/ml) durant 3-4 h a 37 graus. El producte de formazà es va dissoldre en DMSO per a la quantificació a una longitud d'ona de 570 nm.

Colony formation assay Cells were seeded in 24-well plates at a density of 200 cells per well and allowed to attach to the bottom of the well overnight. Cells were then treated with indicated drugs at the given concentration. The culture medium was replaced every 3 days until colonies were visible on day 12 post-culturing. For colonies counting, the cells were fixed with 4% paraformaldehyde and stained with 0.1% crystal violet. Colonies>Es van comptar 10 cèl·lules amb un microscopi de llum (ampliació × 100; Olympus, Tòquio, Japó).

Assaig de cicatrització de ferides Les cèl·lules es van sembrar en plaques de {{{0}}pous (1 × 105 cèl·lules per pou) i es van cultivar fins al 90 per cent de confluència. La capa cel·lular es va ratllar amb una punta de pipeta estèril de 200 ul per produir un buit de la ferida. La migració cel·lular a la zona ferida es va visualitzar als punts de temps indicats (0, 10 i 24 h) sota un microscopi de llum invertida amb un augment de × 100. Cada experiment es va realitzar per triplicat.

Assaig de formació de tubs Els HUVEC es van cultivar tal com es va descriure anteriorment [15]. En resum, les plaques 96-pous es van recobrir amb Matrigel (BD Biosciences, Franklin Lakes, EUA) segons les instruccions del fabricant i després es van tornar a la incubadora per polimeritzar durant 30-40 min. A continuació, els HUVEC es van sembrar a una densitat de 2 × 105 cèl·lules/ml i es van tractar amb diversos fàrmacs donats durant 8 h. La formació del tub es va fotografiar amb un microscopi invertit als punts de temps indicats i es va analitzar mitjançant el programari ImageJ.

Anàlisi de Western Blotting

Els lisats cel·lulars totals es van preparar amb tampó d'assaig de radioimmunoprecipitació (RIPA) (50 mM Tris HCl a pH 8.0, 150 mM NaCl, 1% NP40, 1% desoxicolat de sodi, 0,1% SDS, 10 ug/ml leupeptina, 10 ug/ml aprotinina i 2 mM PMSF). Les mostres de proteïnes amb quantitats iguals (20 ug/carril) es van separar en gel SDS-PAGE i es van transferir a membranes PVDF (Bio-Rad, Hercules, CA). Les membranes es van incubar durant la nit amb anticossos p53 (Cell Signaling Technology, Boston, MA). Per als controls de càrrega, les membranes es van esbandir amb un tampó d'eliminació i es van repetir amb l'anticòs -actina (Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA). Les proteïnes es van detectar mitjançant un sistema de detecció ECL (Perkin Elmer Life Sciences, Boston, EUA).

qRT-PCR

L'ARN total es va extreure de línies cel·lulars mitjançant el reactiu Trizol (Invitrogen, EUA) i es va sotmetre a una reacció en cadena de transcripció inversa-polimerasa (RT-PCR) per sintetitzar ADNc mitjançant un kit disponible comercialment. La qRT-PCR en temps real utilitzant 2xSYBR verd qPCR Supermix es va realitzar a la màquina Stratagene Mx3000P PRC (Agilent Technologies, EUA). Les seqüències de cebador es van mostrar a continuació: sentit 5′-CACCATGTGG TTCCTGGTTC-3′ i anti-sentit 5′-CAAACAAGTT GTGGCGACCC-3′ per a KLK1; sentit 5′-GTGTACAGTC ATGGATGGGC-3′ i anti-sentit 5′-CCCAGAATCA CCCCCACAAG-3′ per a KLK2; sentit 5′- CCACACCC GCTCTACGATATGA-3′ i anti-sentit 5′-CCC AGA ATCACCCGAGCAG-3′ per a KLK3; sentit 5′-CGCACA CTGTTTCCAGAACTC-3′ i antisentit 5′-GTTG CAGGAGTCCTTCTGGT-3′ per a KLK4; sentit 5′-CCTG CACCCACATCTTTCTCT-3′ i anti-sentit 5′- GGTAAGCATCCTCGCACCTT-3′ per a KLK5; sentit 5′- CTCTCTCCTGGGGACACAGA-3′ i anti-sentit 5′- TCCGCCATGCACCAACTTAT-3′ per a KLK6; sentit 5′- TTTTGGAGCCCAGCTGTGTG-3′ i antisentit 5′- GTCACCATTGCAGGCGTTTT-3′ per a KLK7; sentit 5′- CTGGGCAGGACACTCCAG-3′ i antisentit 5′- ACACCGCCACAGAGTAGTTG-3′ per a KLK8; sentit 5′- GTAGGGGGTTCTCGTAGGGT-3′ i antisentit 5′- CGGTGACGTCATAGAGACGG-3′ per a KLK9; sentit 5′-CAGGAGTGCCAGCCTCAC-3′ i anti-sentit 5′- CTGGGGAGGAAGAGGATGGA-3′ per a KLK10; sentit 5′-CCCACCCCTTGGATTCTGTCT-3′ i antisentit 5′-GTGAACTATGTAGCGGGGCT-3′ per a KLK11; sentit 5′-TGTTCTTGGTGAGTTCTCCCG-3′ i antisentit 5′-GGATCCAGTCCACATACTTGC-3′ per a KLK12; sentit 5′-CCTGAACCACGACCATGACA-3′ i antisentit 5′-GCAGGGTTTGGATGTAGCCT-3′ per a KLK13; sentit 5′-CCCAACTACAACTCCCGGAC-3′ i anti-sentit 5′-CCTGAAGCAACTGCTCGTGA-3′ per a KLK14; sentit 5′-AGTTGCTGGAAGGTGACGAG- 3′ i antisentit 5′-TGGCTAACATCTGGGCCTTG- 3′ per a KLK15; sentit 5′-GACAGTCAGCCGCATCTT CT-3′ i anti-sentit 5′- GCGCCCAATACGACCAAA TC{-3′ per a GAPDH. Els valors del llindar del cicle (Ct) de cada gen KLK es van normalitzar als de GAPDH i es van analitzar amb el programari MxPro.

Activitat antitumoral in vivo d'A01 sol o en combinació amb sorafenib Es van preparar 4 suspensions cel·lulars BEL74{0 (3 × 1{06 cèl·lules) i es van injectar per via subcutània al flanc dret de ratolins nus atímics. Deu dies després de la inoculació, es van seleccionar ratolins portadors de tumors (pes corporal (g): 22–26; mitjana ± SEM: 23,8 ± 0,14) i es van seleccionar per aleatoritzar-los en 7 grups de tractament després del volum del tumor ({ {12}} mm3). Es van assignar un total de 38 ratolins a diferents grups de tractament (n=5 per grup excepte el grup model (n=8)). A continuació, es van tractar els animals mitjançant sonda oral amb acteòsid (A01; 12,5, 25 i 50 mg/kg), sorafenib sol (50 mg/kg) o en combinació amb A01 (50 mg/kg) una vegada al dia durant 14 dies. A més, també es va administrar per via intravenosa una dosi de 20 mg/kg A01. Les dosis es van seleccionar a partir d'estudis anteriors i de les nostres dades preliminars [15]. El creixement del tumor es va controlar cada 3 o 4 dies mitjançant un calibre electrònic, amb el volum calculat com a 0,5 x longitud x amplada (mm3). A més, es va incloure un experiment paral·lel amb la inoculació de JHH-7. Set dies després de la inoculació, es van seleccionar ratolins portadors de tumors (pes corporal (g): 20-26; mitjana ± SEM: 24, 0 ± 0, 20) i es van seleccionar per aleatoritzar-los en grups de tractament d'acord amb el volum del tumor (80-130 mm3). ). Es van assignar un total de 23 ratolins a 4 grups de tractament (n=5 per grup excepte el grup model (n=8)). Aleshores, els animals van rebre A01 (20 mg/kg, iv), sorafenib sol (50 mg/kg, ig) o combinat amb A01 (20 mg/kg, iv) una vegada al dia durant 14 dies consecutius. Tots els ratolins van ser anestesiats amb hidrat de cloral (350 mg/kg) i sacrificats per luxació del coll al final del període d'observació. I es va eliminar la massa tumoral i es va fotografiar amb una càmera digital.

Anàlisi estadística

Totes les dades s'expressen com a mitjana ± desviació estàndard (DE). Llevat que s'indiqui el contrari, les anàlisis estadístiques es van realitzar mitjançant l'anàlisi de la variància (ANOVA) seguida d'una prova de Tukey posthoc. Els valors del volum del tumor es mostren com a mitjana ± error estàndard de la mitjana (SEM). Es va utilitzar ANOVA bidireccional seguit de proves de Tukey per analitzar les dades del volum del tumor. Per a les anàlisis estadístiques es va utilitzar el programari GraphPad Prism. Un valor de p < 0,05="" es="" va="" considerar="" estadísticament="">

Resultats

Efectes d'A01 sobre la proliferació i formació de colònies d'HCC in vitro

Les tres línies cel·lulars de HCC (BEL7404, HLF i JHH7) es van utilitzar per a l'assaig de proliferació cel·lular. Com es mostra a la figura 1, l'assaig MTT va revelar que A01 inhibeix la proliferació de les tres cèl·lules HCC. Per preguntar encara més si l'activitat antiproliferativa d'A01 es devia a la seva capacitat d'inhibir la clonogenicitat cel·lular, es va realitzar l'assaig de formació de colònies. A01 a 100 μM va mostrar una forta inhibició de la formació de colònies a les cèl·lules BEL7404 (Fig. 2a i b). Quan es combina amb sorafenib (2 μM), la potència d'inhibició era més forta que la d'A01 o sorafenib sol. També es van observar resultats similars a les altres dues cèl·lules HCC, HLF i JHH-7 (Fig. 2c i d).

Efectes d'A01 sol o en combinació amb sorafenib sobre la migració cel·lular d'HCC in vitro

A continuació, vam avaluar la migració cel·lular mitjançant l'assaig de ferides per rascades. Tal com es mostra a la figura 3, la combinació d'A01 (100 o 500 μM) i sorafenib (10 μM) va prevenir significativament la cicatrització de ferides a les tres cèl·lules HCC, en comparació amb el grup control. Per a les cèl·lules BEL7404, tant A01 (100 o 500 μM) com sorafenib (10 μM) només van produir una tendència a la prevenció de la cicatrització de ferides sense significació estadística (Fig. 3a i d). Per a les cèl·lules HLF, A01 a 500 μM i sorafenib a 10 μM van inhibir la cicatrització de ferides. En particular, A01 (500 μM) combinat amb sorafenib (10 μM) va produir una inhibició més forta de la cicatrització de ferides que el sorafenib sol (Fig. 3b i e). Per a les cèl·lules JHH, A01 (500 μM) i sorafenib (10 μM) van impedir la cicatrització de ferides. La combinació d'A01 (100 μM) i sorafenib (10 μM) va produir una inhibició més forta de la cicatrització de ferides que A01 (100 μM) o sorafenib (10 μM) sols. A més, A01 a 500 μM combinat amb sorafenib (10 μM) va mostrar una inhibició més forta de la cicatrització de ferides que A01 (500 μM) o sorafenib (10 μM) sols (Fig. 3c i f).

Efectes de l'A01 sol o en combinació amb sorafenib sobre l'angiogènesi in vitro

L'angiogènesi està estretament associada amb el creixement, la progressió i la metàstasi del tumor [16] i, per tant, es considera un dels objectius intermedis per al tractament del càncer. Primer vam realitzar un assaig de formació de tubs per analitzar la potencial angiogènesi in vitro. Tal com es mostra a la figura 4, el tractament durant 3 h amb sorafenib sol (10 μM) o la combinació d'A01 (100 i 500 μM) i sorafenib (10 μM) va començar a mostrar efectes inhibidors sobre la formació d'estructures semblants als vasos, és a dir. l'allargament i l'alineació dels HUVEC (Fig. 4a i c). Després del tractament durant 8 h, A01 (100 i 500 μM), sorafenib (10 μM), així com la combinació d'A01 i sorafenib, van inhibir significativament la formació d'estructures semblants als vasos, amb una inhibició més forta per la combinació d'A01 i sorafenib que A01 o sorafenib sol (Fig. 4a i c). A més, la migració cel·lular dels HUVEC és un pas clau per formar nous vasos durant l'angiogènesi i, per tant, s'investiga. Com es mostra a les figures 4b i d, A01 (500 μM), sorafenib (10 μM), així com la combinació d'A01 (100 i 500 μM) i sorafenib (10 μM) van inhibir significativament la migració cel·lular dels HUVEC. A01 (500 μM) combinat amb sorafenib (10 μM) va produir una inhibició més forta que A01 (500 μM) o sorafenib (10 μM) sols.

Efectes d'A01 sol o en combinació amb sorafenib sobre el creixement del tumor in vivo dels xenografts BEL7404 i JHH-7 HCC

Per avaluar encara més l'eficàcia d'A01 sol o combinat amb sorafenib en el creixement del tumor in vivo de l'HCC, vam establir un model de ratolí nu de xenograft subcutani mitjançant BEL7404 o JHH-7 cèl · lules. Com es mostra a la figura 5, el volum del tumor es va reduir molt després del tractament amb A01 (25 i 50 mg/kg, mitjançant sonda oral; 20 mg/kg, a través de la vena de la cua; tot p <0, 01="" vs="" grup="" model)="" o="" sorafenib="" (50="" mg/kg,="" mitjançant="" sonda="" oral;="" p=""><0, 01="" vs="" grup="" model)="" sol="" (fig.="" 5a="" i="" b).="" la="" combinació="" d'a01="" (50="" mg/kg)="" i="" sorafenib="" (50="" mg/kg)="" va="" mostrar="" una="" inhibició="" més="" forta="" del="" creixement="" del="" tumor="" en="" comparació="" amb="" el="" sorafenib="" sol="" (p=""><0, 01),="" però="" va="" produir="" un="" efecte="" similar="" al="" d'a01="" sol="" (fig.="" 5a="" i="" c).="" ).="" a="" continuació,="" vam="" utilitzar="" el="" model="" de="" ratolins="" nus="" amb="" xenograft="" jhh-7="" per="" provar="" encara="" més="" les="" possibles="" eficàcies="" antitumorals="" d'a01.="" tal="" com="" es="" mostra="" a="" la="" figura="" 6,="" el="" tractament="" amb="" a01="" (20="" mg/kg,="" iv)="" o="" sorafenib="" (50="" mg/kg,="" ig)="" va="" produir="" una="" inhibició="" significativa="" del="" creixement="" tumoral="" del="" xenoempelt="" de="" jhh-7="" (p=""><0, 01="" respecte="" al="" grup="" model).="" ),="" amb="" major="" inhibició,="" quan="" es="" combinen="" (fig.="" 6a="" i="" b;="" p="">< 0,01="" vs="" a01="" o="" grup="" de="" sorafenib="">

Possible modulació de la peptidasa relacionada amb la cal·licreïna i p53 perActeòsid de cistanche

La peptidasa relacionada amb la cal·licreïna (KLK) s'ha suggerit com a biomarcador del càncer en el diagnòstic i el pronòstic de diversos càncers, inclòs el carcinoma hepatocel·lular a causa de la seva expressió desregulada [17–19]. En aquest escenari, vam detectar l'expressió gènica de KLK1–15 a la línia cel·lular HCC JHH-7. Com es mostra a la figura 7, el tractament amb acteòsid va produir una inhibició significativa dels nivells d'ARNm de KLK1, 2, 4, 9 i 10 (Fig. 7a-e), sense canvis significatius de la resta de KLK1-15 (dades no mostrades). ). A més, també vam detectar el nivell de proteïna supresora de tumors p53 i vam revelar un augment pel tractament amb acteòsid (Fig. 7f).

Discussió

El maneig de l'HCC avançat ha estat durant molt de temps intractable a causa de la incapacitat de diagnòstic en etapes primerenques i la quimioresistència del tumor [5, 6]. Sorafenib, l'inhibidor de la multicinasa informat que inhibeix la proliferació cel·lular i l'angiogènesi, juntament amb un altre inhibidor oral de multicinasa, lenvatinib s'ha convertit en el tractament estàndard de l'HCC avançat [3, 5, 20, 21]. Tanmateix, les taxes de supervivència generals són modestes a la llum de les baixes taxes de resposta i la inadequació en els entorns clínics [3, 22]. Un estudi recent va demostrar que atezolizumab més bevacizumab van produir millors resultats clínics que sorafenib en pacients amb HCC no resecable, fent d'aquesta combinació una possible nova opció de tractament de primera línia per a HCC avançat [7]. En aquest context, hem identificat que el glucòsid feniletanoide,Acteòsid de cistancheva inhibir la proliferació cel·lular, la formació de colònies i la migració a les tres línies cel·lulars de HCC humanes BEL7404, HLF i JHH-7, així com l'angiogènesi prohibida dels HUVEC. La combinació d'acteòsid i sorafenib va ​​produir una inhibició més forta de la formació de colònies cel·lulars i la migració de les cèl·lules HCC, així com de l'angiogènesi dels HUVEC. Acteòside va presentar l'eficàcia antitumoral en el model de ratolins nus amb xenograft BEL7404 o JHH-7, amb una millora quan es combina amb sorafenib per inhibir el creixement del xenograft JHH{-7. Anàlisis posteriors van revelar un augment de p53 així com una disminució d'alguns gens KLK. En conseqüència, s'ha de considerar el possible ús d'acteòsid com a complements en el tractament de l'HCC avançat a la clínica.

L'evidència creixent ha demostrat els efectes antitumorals deActeòsid de cistancheen diverses cèl·lules tumorals com ara cèl·lules de melanoma B16, cèl·lules de glioblastoma, cèl·lules de càncer colorectal, cèl·lules de carcinoma de cèl·lules escamoses orals, cèl·lules de càncer de pròstata i cèl·lules d’adenocarcinoma de mama humà [11–13, 23–25] o en animals que tenen tumors [12]. Malgrat això, pocs estudis s'han centrat en els efectes de l'acteòsid sobre l'HCC in vitro o in vivo, excepte un estudi que utilitza dietilnitrosamina com a carcinogen per induir l'hepatocarcinogènesi en rates i que revela la quimioprevenció per acteòside [26]. En l'estudi actual, vam mostrar la inhibició per l'acteòsid de la proliferació cel·lular, la formació de colònies i la migració a les línies cel·lulars d'HCC, així com el creixement del tumor en ratolins amb xenografts de línia cel·lular HCC, demostrant així directament els efectes antitumorals de l'acteòsid en HCC. A més, la combinació d'acteòsid i sorafenib va ​​produir efectes antitumorals encara més forts. Combinat amb l'evidència que l'acteòsid és protector contra les lesions hepàtiques [27-29] sense efectes tòxics en animals i sense mutagenicitat [30], sembla que és factible per a l'aplicació futura de la teràpia combinada d'acteòsid i sorafenib en pacients amb avançat. HCC a la clínica.

La família de la cal·licreïna humana comprèn 15 serina proteases de tipus tripsina o quimotripsina secretades (KLK1-15) homòlogues, d'una sola cadena i ha estat implicada en la regulació del creixement del tumor, la progressió neoplàstica, l'angiogènesi i la metàstasi [18, 31]. En particular, els KLK s'han suggerit com a biomarcador del càncer en el diagnòstic i el pronòstic de diversos càncers, inclòs el carcinoma hepatocel·lular a causa de la seva expressió desregulada [17–19]. Per exemple, KLK1 es proposa com el biomarcador del càncer gàstric a causa de l'elevació dels nivells de KLK1 en la neoplàsia gàstrica i la prevenció del creixement del tumor en el càncer gàstric mitjançant la inhibició de l'activitat de KLK1 amb la proteïna d'unió a la cal·licreïna (KBP) [32]. En aquest escenari, vam observar una inhibició significativa dels nivells d'ARNm de KLK per l'acteòsid (KLK1, 2, 4, 9 i 10). Es va informar que l'aplicació de KBP, que s'uneix específicament a la cal·licreïna dels teixits i inhibeix l'activitat de la cal·licreïna, va suprimir el creixement de l'HCC en ratolins possiblement mitjançant la seva activitat anti-angiogènica [33], cosa que suggereix la possible implicació de KLK en la progressió de l'HCC. A més, la proteïna supresora de tumors p53 és capaç d'induir la senescència, l'apoptosi i l'aturada del cicle cel·lular. L'augment de l'expressió de p53 confereix una quimiosensibilitat millorada a les cèl·lules canceroses [34]. En aquest sentit, els nostres resultats occidentals van mostrar un augment dels nivells de p53 després del tractament amb acteòsid. En conjunt, és raonable inferir que l'acteòsid exerceix els efectes antitumorals sobre l'HCC possiblement mitjançant la seva regulació positiva de p53, així com la inhibició de KLK i l'angiogènesi.

Cal tenir en compte que la diana molecular directa a la qualActeòsid de cistanchepodria unir-se directament encara no està clar. Les nostres dades preliminars mitjançant l'acoblament molecular van revelar la unió directa de l'acteòsid amb la cal·licreïna (dades no mostrades). Caldrien més experiments per aclarir aquesta presumpció. A més, pel que fa a les dosis d'acteòsid utilitzades per a l'assaig cel·lular a l'estudi 10-5{0 vegades superiors a les de sorafenib (10 μM), en primer lloc vam triar aquelles dosis d'acteòsid d'acord amb el relació dosi-resposta en l'assaig MTT. En segon lloc, les dosis que vam utilitzar (100, 500 μM) eren comparables a estudis anteriors [35], en què l'acteòsid (100 μM) inhibia la proliferació cel·lular de cèl·lules de càncer colorectal. Finalment, malgrat la dosi més alta en l'assaig cel·lular, l'acteòsid va produir una inhibició pronunciada del creixement del tumor en el model de ratolins nus amb xenograft HCC en el nostre estudi (25 i 50 mg/kg), els efectes són similars al sorafenib (50 mg/kg). Per al sorafenib, es va utilitzar en el nostre estudi a la dosi de 10 μM a nivell cel·lular. Aquesta dosi és comparable a estudis anteriors en què es va trobar que el sorafenib inhibeix la viabilitat cel·lular amb un IC50 de 4,0-6,5 μM a les línies cel·lulars HCC de cèl·lules PLC/PRF/5 i HepG2. En canvi, la dosi de sorafenib utilitzada per suprimir el creixement dels xenografts d'HCC en ratolins femelles SCID va ser de 30 mg/kg (po per sonda) [36]. A la clínica, la dosi recomanada de sorafenib per al pacient és de 400 mg per vegada (2 * 0,2 g), dues vegades al dia (800 mg per dia en total). Aquesta dosi de sorafenib que s'utilitza a la clínica contrasta amb la que s'utilitza en l'assaig cel·lular (valor IC50 en nivell de μM), possiblement a causa de la seva poca absorbibilitat en condicions in vivo. Per a l'acteòsid, segons la seva dosi en ratolins (50 mg/kg, ig), la seva dosi equivalent per a humans (60 kg BW) és d'uns 250 mg. Aquesta dosi és comparable a la del sorafenib utilitzat a la clínica i hauria de ser acceptable per als pacients.

Conclusions En conclusió,Acteòsid de cistancheés capaç d'exercir un efecte antitumoral en línies cel·lulars de HCC i en ratolins nus que porten xenoempelts de línia cel·lular HCC, efectes possiblement mitjançant l'augment dels nivells de p53, així com la prohibició de KLK i l'angiogènesi. L'acteòsid podria ser útil com a complement en el tractament de l'HCC avançat a la clínica.

Referències

1 Bray F, Ferlay J, Soerjomataram I, Siegel RL, Torre LA, Jemal A. Global cancer statistics 2018: GLOBOCAN estimations of incidence and mortality worldwide for 36 cancers in 185 countries. CA Cancer J Clin. 2018;68(6):394–424..

2. Llovet JM, Zucman-Rossi J, Pikarsky E, Sangro B, Schwartz M, Sherman M, Gores G. Hepatocellular carcinoma. Nat Rev Dis Primers. 2016;2:16018.

3. Sim HW, Knox J. El carcinoma hepatocel·lular a l'era de la immunoteràpia. Curr Probl Càncer. 2018;42(1):40–8. 4. Jiang Y, Han QJ, Zhang J. Carcinoma hepatocel·lular: mecanismes de progressió i immunoteràpia. Món J Gastroenterol. 2019;25(25):3151–67.

5. Forner A, Da Fonseca LG, Diaz-Gonzalez A, Sanduzzi-Zamparelli M, Reig M, Bruix J. Controversies in the management of hepatocellular carcinoma. JHEP Rep. 2019;1(1):17–29.

6. Hartke J, Johnson M, Ghabril M. El diagnòstic i tractament del carcinoma hepatocel·lular. Semin Diagn Pathol. 2017;34(2):153–9.

7. Finn RS, Qin S, Ikeda M, Galle PR, Ducreux M, Kim TY, Kudo M, Breder V, Merle P, Kaseb AO, et al. Atezolizumab més Bevacizumab en el carcinoma hepatocel·lular irresecable. N Engl J Med. 2020;382(20):1894–905.

8. He ZD, Ueda S, Akaji M, Fujita T, Inoue K, Yang CR. Glicòsids monoterpenoides i feniletanoides de Ligustrum peduncular. Fitoquímica. 1994;36(3):709–16.

9. Li H, Chou GX, Wang ZT, Hu ZB. Determinació de HPLCacteòsida Radix Rehmanniae. Zhongguo Zhong Yao Za Zhi. 2006;31(10):822–4.

10. Wong IY, He ZD, Huang Y, Chen ZY. Activitats antioxidants dels glucòsids feniletanoides de Ligustrum purpurascens. J Agric Food Chem. 2001;49(6):3113–9.

11. Mulani SK, Guh JH, Mong KK. Una estratègia sintètica general i les propietats antiproliferació en línies cel·lulars de càncer de pròstata per a glicòsids feniletanoides naturals. Org Biomol Chem. 2014;12(18):2926–37.

12. Cheimonidi C, Samara P, Polychronopoulos P, Tsakiri EN, Nikou T, Myrianthopoulos V, Sakellaropoulos T, Zoumpourlis V, Mikros E, Papassideri I, et al. Citotoxicitat selectiva de la substància herbal acteòsid contra cèl·lules tumorals i els seus coneixements mecanicistes. Redox Biol. 2018;16:169–78.

13. Attia YM, El-Kersh DM, Wagdy HA, Elmazar MM. Verbascòsid: identificació, quantificació i sensibilització potencial de cèl·lules de càncer colorectal a 5-FU orientant-se a la via PI3K/AKT. Ciència Rep. 2018;8(1):16939.

14. Liu S, Zhao Z, Huo Z, Xu Z, Zhong Y, Wang X, Yang Y, Wang Z. L'extracte aquós de flors d'Osmanthus fragrans i el seu acteòsid enriquit inhibeixen la melanogènesi i la pigmentació induïda per l'ultraviolat. Nat Prod Commun. 2018;13(5):575–80.

15. Wang J, Ma S, Chen X, Zhang S, Wang Z, Mei Q. El nou inhibidor de PI3K S1 sinergia amb sorafenib en cèl·lules de càncer de pulmó de cèl·lules no petites que impliquen la senyalització Akt-S6. Investig noves drogues. 2019;37(5):828–36.

16. Hanahan D, Weinberg RA. Característiques del càncer: la propera generació. Cèl·lula. 2011;144(5):646–74. 17. Emami N, Diamandis EP. Utilitat de les peptidases relacionades amb la cal·licreïna (KLK) com a biomarcadors del càncer. Clin Chem. 2008;54(10):1600–7.

18. Tailor PD, Kodeboyina SK, Bai S, Patel N, Sharma S, Ratnani A, Copland JA, She JX, Sharma A. Potencial de biomarcador diagnòstic i pronòstic dels gens de la família de la cal·licreïna en diferents tipus de càncer. Oncotarget. 2018;9(25): 17876–88.

19. Kontos CK, Mavridis K, Talieri M, Scorilas A. Kallikrein-related peptidases (KLKs) in gastrointestinal cancer: mecanicistic and clinical aspects. Tromb Haemost. 2013;110(3):450–7.

20. Cheng AL, Kang YK, Chen Z, Tsao CJ, Qin S, Kim JS, Luo R, Feng J, Ye S, Yang TS, et al. Eficàcia i seguretat de sorafenib en pacients de la regió Àsia-Pacífic amb carcinoma hepatocel·lular avançat: un assaig de fase III aleatoritzat, doble cec i controlat amb placebo. Lancet Oncol. 2009;10(1):25–34. 21. Llovet JM, Ricci S, Mazzaferro V, Hilgard P, Gane E, Blanc JF, de Oliveira AC, Santoro A, Raoul JL, Forner A, et al. Sorafenib en el carcinoma hepatocel·lular avançat. N Engl J Med. 2008;359(4):378–90.

22. Cançó MJ. Quimioteràpia per infusió de l'artèria hepàtica per al carcinoma hepatocel·lular avançat. Món J Gastroenterol. 2015;21(13):3843–9.

23. Liao YF, Rao YK, Tzeng YM. L'extracte aquós d'Anisomeles India i el seu compost purificat exerceixen activitat antimetastàtica mitjançant la inhibició de l'activació de MMP-9 dependent de NF kappaB/AP-1-en cèl·lules MCF-7 de càncer de mama humà. Food Chem Toxicol. 2012;50(8):2930–6.

24. Zhang Y, Yuan Y, Wu H, Xie Z, Wu Y, Song X, Wang J, Shu W, Xu J, Liu B, et al. Efecte del verbascòsid sobre l'apoptosi i la metàstasi en el carcinoma de cèl·lules escamoses orals humans. Int J Càncer. 2018;143(4):980–91.

25. Hwang TW, Kim DH, Kim DB, Jang TW, Kim GH, Moon M, Yoon KA, Choi DE, Park JH, Kim JJ. Efecte anticancerígen sinèrgic de la quimioteràpia de glioblastoma basada en acteòsid i temozolomida. Int J Mol Med. 2019; 43(3):1478–86.

26. Peerzada KJ, Faridi AH, Sharma L, Bhardwaj SC, Satti NK, Shashi B, Tasduq SA. Els acteòsids median la quimioprevenció de la carcinogènesi hepàtica experimental mitjançant l'estrès oxidatiu i l'apoptosi regulats per STAT-3. Entorn Toxicol. 2016;31(7):782–98.

27. Cui Q, Pan Y, Zhang W, Zhang Y, Ren S, Wang D, Wang Z, Liu X, Xiao W. Metabòlits de l'Acteòsid dietètic: perfils, aïllament, identificació i capacitats hepatoprotectores. J Agric Food Chem. 2018;66(11):2660–8.

28. Xiong Q, Hase K, Tezuka Y, Namba T, Kadota S. L'acteòsid inhibeix l'apoptosi en la lesió hepàtica induïda per D-galactosamina i lipopolisacàrids. Ciència de la vida. 1999;65(4):421–30.

29. Zhao J, Liu T, Ma L, Yan M, Zhao Y, Gu Z, Huang Y. Efecte protector de l'acteòsid sobre la lesió hepàtica immunològica induïda pel Bacillus Calmette Guerin més lipopolisacàrid. Planta Med. 2009;75(14):1463–9.

30. Lu B, Li M, Zhou F, Huang W, Jiang Y, Mao S, Zhao Y, Lou T. L'extracte ric en glucòsids feniletanoides de flors fragants d'Osmanthus: estudis de toxicitat aguda i subcrònica. J Etnofarmacol. 2016;187:205–12.

31. Diamandis EP, Yousef GM. Cal·licreïnes de teixit humà: una família de nous biomarcadors de càncer. Clin Chem. 2002;48(8):1198–205.

32. Sawant S, Snyman C, Bhoola K. Comparació de l'expressió del receptor de la cal·licreïna i la cinina dels teixits en úlceres gàstriques i neoplàsies. Int Immunofarmacol. 2001;1(12):2063–80.

33. Lu L, Yang Z, Zhu B, Fang S, Yang X, Cai W, Li C, Ma JX, Gao G. La proteïna Kallikreinbinding suprimeix el creixement del carcinoma hepatocel·lular per activitat antiangiogènica. Càncer Lett. 2007;257(1):97–106.

34. Guntur VP, Waldrep JC, Guo JJ, Selting K, Dhand R. L'augment de la proteïna p53 sensibilitza el càncer de pulmó de cèl·lules no petites al paclitaxel i al cisplatí in vitro. Res. anticancerígena 2010;30(9):3557–64.

35. Zhou L, Feng Y, Jin Y, Liu X, Sui H, Chai N, Chen X, Liu N, Ji Q, Wang Y, Li Q. El verbascoside promou l'apoptosi regulant la senyalització HIPK2-p53 en humans càncer de colon. BMC Càncer. 2014;14:747.

36. Liu L, Cao Y, Chen C, Zhang X, McNabola A, Wilkie D, Wilhelm S, Lynch M, Carter C. Sorafenib bloqueja la via RAF/MEK/ERK, inhibeix l'angiogènesi del tumor i indueix l'apoptosi de les cèl·lules tumorals a l'hepatocel·lular model de carcinoma PLC/PRF/5. Càncer Res. 2006;66:11851–8.