Efecte avantatjós/desfavorable de la quercetina a les membranes de les cèl·lules de neuroblastoma SK-N-SH Part 2

Si us plau, feu clicoscar.xiao@wecistanche.comper a més informació

2.2.2. Activitat antioxidant de la quercetina

Per provar l'eficàcia de la quercetina per protegir les membranes contra l'estrès oxidatiu, es van realitzar experiments en què els models lipídics de la membrana estaven exposats a l'ozó en absència (Figura 4a) i presència de quercetina a una concentració de 6, 25 μM (Figura 4b).

Sota la influència de l'ozó, el curs de les dues dependències, és a dir, π{{0}}f(A) i Cs-1=f(rn) canvia. Les isotermes obtingudes per a la propagació de monocapa a la subfase que conté ozó es van caracteritzar per un pendent més petit i un desplaçament cap a valors A més baixos. A més, els valors de Cs-1 van disminuir sota la influència de l'ozó. Aquests canvis van ser més grans a una concentració d'ozó d'unes 0,4 ppm.cintanchUn nou augment de la concentració d'ozó no va augmentar els canvis en les característiques de la monocapa (insert de la figura 4a).

Figura 4. Les isotermes de pressió superficial i el corresponent mòdul de compressibilitat (insert) del model de lípids de capes de neuroblastoma repartides a la subfase contenien les concentracions indicades d'ozó dissolt en tampó. Isotermes: (a) en absència d'antioxidants; (b) en presència de quercetina (6,25 μM) afegit al tampó que conté ozó.

Quan es va introduir quercetina a una concentració de 6,25 μM a la subfase, l'ozó no va afectar significativament el curs de la isoterma r (A); tanmateix, els valors del mòdul de compressió van canviar en presència d'ozó de la mateixa manera que en el cas de l'absència de quercetina (insert de la figura 4b).

Feu clic aquí per saber-ne més

Els valors numèrics dels paràmetres que caracteritzen les monocapes determinats a partir de les isotermes obtingudes es presenten a la Taula 3.

Taula 3. Paràmetres superficials de les monocapes Alim i Cs-I calculats per a monocapes del model de membrana de neuroblastoma estesa a la subfase contenia les concentracions indicades d'ozó dissolt en el tampó en absència i en presència de quercetina (6,25 uM). Les dades representen la mitjana de tres experiments ± SD. Les lletres diferents indiquen diferències significatives (p Menor o igual a 0,05).

En presència d'ozó, s'observa una lleugera reducció de la superfície per molècula (Alim) en monocapa densament empaquetada. La reducció màxima d'aquest paràmetre és del 3,2 per cent en comparació amb el control (monocapa sobre el tampó pur). El paràmetre Cs-I també es redueix, arribant a valors d'altiplà a concentracions d'ozó superiors a 0,6 ppm O. La reducció màxima d'aquest paràmetre arriba al 24 per cent en relació amb el control.

Quan la quercetina a una concentració de 6,25 uM està present a la subfase, els valors d'Alim (1-2 per cent) disminueixen lleugerament, mentre que la reducció del valor de Cs-1 és d'uns 27 per cent.

La naturalesa dels canvis d'Alim en presència d'ozó i d'ozó en combinació amb quercetina tenen diferents cursos. A una concentració d'ozó d'aproximadament 0,3 ppm, en absència de quercetina, l'objectiu disminueix bruscament fins a uns 88,3 A2. Aleshores assoleix el valor mínim de l'altiplà donant una dependència característica de la forma S (figura 5a, punts vermells). En presència de quercetina, hi ha una lleugera disminució monotònica suau d'Alim, arribant a una concentració d'ozó més alta, un altiplà d'uns 93,5 A2 (Figura 5a, punts verds).

Figura 5. La dependència de l'àrea per molècula de la concentració d'ozó (a) i la dependència del mòdul de compressió de la concentració d'ozó (b) per a la membrana del neuroblastoma en subfase: Sense punts vermells de quercetina; amb punts verds de quercetina. Les línies no presenten cap model físic, es van ajustar matemàticament i es van dibuixar per facilitar el seguiment dels canvis de paràmetres. Els valors màxims del mòdul de compressió de la capa canvien de manera similar amb la concentració d'ozó per a tots dos: en absència i presència de quercetina (figura 5b).

3. Discussió

El mecanisme d'acció de la quercetina s'ha estudiat intensament durant molts anys, però els resultats dels experiments sovint són contradictoris i indiquen que en algunes circumstàncies, aquest compost és beneficiós i, en altres, desfavorable per a les cèl·lules. L'anàlisi dels estudis disponibles mostra que l'efecte d'aquest compost sobre les cèl·lules està relacionat amb dos aspectes, és a dir, la seva interacció amb les membranes i l'activitat antioxidant. Tanmateix, a les cèl·lules, no és possible distingir aquests dos modes d'acció de la quercetina i l'avaluació de la idoneïtat d'aquest compost com a substància potencial, per exemple, amb activitat antitumoral. Per aquest motiu, els experiments s'han planificat de manera que s'avaluï de manera qualitativa i quantitativa la influència d'aquest compost en les propietats mecàniques de les membranes, així com la seva activitat antioxidant en el sistema model, que elimina els efectes de l'activitat d'altres vies metabòliques.

A partir dels experiments realitzats, es va confirmar que fins i tot a les concentracions més baixes (6,25 uM), la quercetina modifica (tal com indica l'augment d'Alimvalue) les monocapes del model, imitant la part lipídica de la membrana de les cèl·lules del neuroblastoma. Apunta a la possibilitat de la interacció de la quercetina amb les membranes d'aquestes cèl·lules en arribar al cervell, fins i tot a concentracions baixes. Això és de particular importància per a les cèl·lules nervioses les membranes de les quals contenen quantitats relativament grans de lípids.

Cistanche pot millorar la immunitat

La relació lípid-proteïna aproximada per a les cèl·lules nervioses és del 80:20 per cent, i per exemple, per a la membrana dels eritròcits, aquesta proporció és del 50:50 per cent [29]. Aquest nivell de lípids a la membrana de les cèl·lules nervioses està relacionat amb el paper d'aquestes cèl·lules en la transmissió de senyals elèctrics. Al mateix temps, fins i tot canvis subtils en les propietats fisicoquímiques, com ara la flexibilitat i la rigidesa, de la membrana cel·lular, poden alterar significativament aquesta funció.

El potencial d'acció es transfereix al llarg de la membrana de la cèl·lula nerviosa gràcies al treball dels canals iònics, i després, gràcies a l'acció de les bombes iòniques, es restaura el potencial de repòs. El bon funcionament d'aquestes proteïnes (en particular, determinat per la seva forma) depèn estretament de l'entorn lipídic. A més, els canvis en les propietats mecàniques de la membrana poden pertorbar el funcionament dels canals el mecanisme de gating dels quals depèn precisament de les propietats mecàniques de la membrana.

Aquestes tesis es confirmen amb estudis que van demostrar que l'efecte de la quercetina sobre la membrana cel·lular està relacionat, entre altres coses, amb el transport d'ions Ca2 més i/o el metabolisme de Ca2 més [30,31]. Així, la introducció de molècules de quercetina a l'entorn de la membrana (especialment de les cèl·lules nervioses) pot tenir conseqüències importants en el seu funcionament.

Per comprovar si l'acció de la quercetina determinada en sistemes model té un paper beneficiós o desfavorable a les cèl·lules, els resultats obtinguts per a membranes model es van comparar amb l'efecte d'aquest compost sobre cèl·lules senceres de neuroblastoma. Per a les cèl·lules SK-N-SH, es va fer la prova MTT,Extracte de Cistanche Anti Alzheimerdonant la informació sobre la viabilitat cel·lular de les cèl·lules que al seu torn és directament proporcional als enzims deshidrogenases mitocondrials.

Els resultats obtinguts van mostrar que la presència de quercetina a concentracions de 100 i 200 uM augmentava el nombre de cèl·lules viables. Bao et al. van obtenir resultats similars. [32], investigant l'efecte de la quercetina a les cèl·lules PC-12. La fuita de LDH a l'entorn extracel·lular, que dóna informació sobre la interrupció de la membrana cel·lular, també es va examinar als mateixos nivells de quercetina. Els resultats obtinguts van demostrar que les membranes de les cèl·lules provades no estaven danyades en aquestes condicions. Boots et al. [2], estudiant els efectes de la quercetina sobre les cèl·lules epitelials pulmonars, va observar resultats similars. Per tant, es pot concloure que a aquestes concentracions, la quercetina té un efecte positiu sobre les cèl·lules, augmentant la seva viabilitat.

El segon aspecte important del mecanisme d'acció de la quercetina està relacionat amb les seves propietats antioxidants. Per avaluar l'efecte associat del polifenol estudiat, es van dur a terme experiments en els quals es va comprovar si la quercetina té un paper protector a les cèl·lules exposades a l'estrès oxidatiu. L'estrès oxidatiu es va generar introduint H, O2 a l'entorn cel·lular.Cistanche per millorar la memòriaCom es va demostrar en aquest estudi, el peròxid d'hidrogen causa una mortalitat cel·lular important, expressada com a dany als mitocondris.

Quan es van cultivar cèl·lules SK-N-SH durant 3 h en un medi que contenia 3 i 5 mM d'H2O2, la viabilitat cel·lular va disminuir fins a aproximadament un 44 per cent de la de les cèl·lules no tractades (assaig MTT). Els estudis van demostrar que el pretractament de 24 h de cèl·lules amb quercetina provoca un augment del nombre de cèl·lules vives en relació amb les cèl·lules tractades amb H2O2. Suematsu et al. [13] van informar d'efectes similars.

També vam mesurar el nivell de MDA, que és un biomarcador de l'estrès oxidatiu com a producte final de la peroxidació lipídica[33]. El pretractament de les cèl·lules amb concentracions elevades de quercetina, seguit de l'addició de peròxid d'hidrogen, va donar lloc a un lleuger augment del contingut de MDA en comparació amb les cèl·lules exposades a H O, soles. Això pot ser perquè la quercetina (a concentracions més altes) també pot patir una activació reductora d'òxids i ser objecte de cicles redox, generant espècies d'oxigen intracel·lularment reactives [34].

No hi va haver canvis significatius en la destrucció de la membrana (tal com indica el nivell de LDH sense canvis) de les cèl·lules tractades amb quercetina i H2O2 en comparació amb el cas en què les cèl·lules estaven exposades només a l'estrès oxidatiu. Per tant, es pot concloure que malgrat un augment de la peroxidació lipídica (a concentracions elevades de quercetina), això no va ser prou significatiu per destruir les membranes i interrompre la seva continuïtat.

Les observacions obtingudes per al sistema natiu es van confrontar amb les rebudes per a un sistema model on és possible controlar exactament tant la concentració de quercetina com el nivell d'estrès. Es va comprovar com la part lipídica de la membrana del neuroblastoma és resistent a l'estrès oxidatiu. Les condicions d'estrès es van crear mitjançant la introducció d'ozó al tampó, en què l'ozó de l'entorn de l'aigua experimenta reaccions de descomposició formant radicals oxidatius, entre d'altres radicals hidroxil i radicals anions superòxid [35]. La barreja obtinguda d'espècies reactives d'oxigen correspon a les que es troben naturalment a les cèl·lules, a causa del desequilibri de pertorbació de l'estat redox [36-38].

Sota la influència de l'estrès, la forma de les isotermes va canviar, cosa que indica una disminució significativa de l'àrea per molècula única a la monocapa densament empaquetada. Aquests canvis es van produir a causa de l'oxidació dels enllaços insaturats a les cadenes d'àcids grassos. Aquest efecte va augmentar amb l'augment de la concentració d'ozó fins a aproximadament {{0}},3 ppm, i després aquest paràmetre d'isoterma es va mantenir al mateix nivell malgrat l'augment de ROS. Això significa que a una concentració d'ozó d'aproximadament 0,3 ppm, tots els àcids grassos insaturats presents a la monocapa es van oxidar (en el model de neuroblastoma, la quantitat total d'àcids grassos insaturats era del 52 per cent).

Les monocapes oxidades tenen una rigidesa substancial,cistanche en xinèstal com es representa pel valor Cs-1 (com més alt sigui el valor d'aquest paràmetre, més gran serà la rigidesa de la capa). En presència de quercetina, fins i tot a una concentració baixa (6,25 μM), les modificacions de la membrana exposada a l'ozó, visualitzades pels canvis en el valor d'Alim, es van reduir significativament (figura 5a), cosa que demostra l'activitat antioxidant d'aquest compost. . Val la pena assenyalar, però, que tot i que la quercetina va eliminar els radicals, protegint els àcids grassos insaturats de l'oxidació, no va revertir els canvis en la rigidesa de la membrana (figura 5b).

Així, s'ha demostrat que la quercetina presenta una acció antioxidant, però la seva mera presència entre molècules de lípid influeix (determina) en els paràmetres de la laver, és a dir, malgrat la protecció de les cadenes d'àcids grassos contra l'oxidació, la rigidesa de la membrana va disminuir significativament (Cs- Valoro un 25 per cent més baix en comparació amb el control).

Aquests resultats indiquen que és el canvi de membrana el principal factor en els efectes cel·lulars derivats de la presència de quercetina. Tanmateix, les conseqüències d'aquest canvi (modificació de la senyalització, transport) varien segons el nombre de molècules de polifenol, la composició inicial de la membrana i la funció de la cèl·lula. Això explica que, en diferents circumstàncies i en diferents estudis, la quercetina mostri un efecte protector, mentre que en d'altres tot el contrari.

En una situació d'estrès oxidatiu elevat, l'efecte antioxidant ajuda a la cèl·lula protegint els seus components dels danys. Tanmateix, si les membranes es modifiquen significativament localitzant aquest compost en el seu entorn, donant lloc a la distribució de les vies de senyalització o transport per la rigidesa de la membrana canviada, això pot provocar efectes desfavorables. També cal recordar que molts processos en una cèl·lula tenen lloc simultàniament, tant els relacionats amb les membranes com els que generen estrès oxidatiu. L'efecte que es pot observar i mesurar determinant el nivell d'indicadors específics és sempre total. Per tant, hi ha situacions en què l'efecte de la quercetina es percep com a favorable i desfavorable.

4. Materials i Mètodes

4.1.Materials

La composició del model de la part lipídica de la membrana de les cèl·lules del neuroblastoma es va establir a partir del treball dels autors de [39-41]. Fosfolípids: 1-oleoil-2-palmitoil-sn-glicerol-3-fosfocolina;1-hexacosanoil-d{4-2-hidroxi-sn-glicerol-3-fosfocolina; 1,2-dioleoil-sn-glicerol-3-fosfocolina; L- -fosfatidiletanolamina (cervell); esfingomielina (cervell)-(Avanti Polar Lipids Inc., Alabaster, AL, EUA). Es va comprar colesterol (Sigma-Aldrich, Darmstadt, Alemanya). La relació entre fosfolípids i colesterol va ser del 79% al 21%. La proporció d'àcids grassos saturats i insaturats va ser del 48% al 52%.

Els dissolvents (cloroform, etanol) de puresa química-Poch (Gliwice, Polònia); aigua acabada de desionitzar produïda per HLP 5 Hydrolab (Straszyn, Polònia). El medi de cultiu, el sèrum i els antibiòtics es van comprar a CytoGen GmbH. Els reactius químics utilitzats en els experiments es van obtenir de Sigma Aldrich.

4.2.Cultura cel·lular

La línia cel·lular de neuroblastoma humà SK-N-SH (la col·lecció europea de cultius cel·lulars autenticats (ECACC) es va cultivar en sèrum boví fetal (FBS) a l'10 per cent en el medi d'àguila modificat de Dulbecco (DMEM), complementat amb un 0,01 per cent de penicil·lina -estreptomicina a 37 graus en atmosfera humidificada, que conté un 5 per cent de CO2.

4.3. Mesura de la viabilitat cel·lular (assaig MTT)

Les cèl·lules es van sembrar en una placa de pous {{{0}}a una densitat d'1 × 104 cèl·lules per pou en un volum de 0,1 ml. Les cèl·lules es van tractar durant 24 h amb diverses concentracions de quercetina (3.75-200 μM）. Passat aquest temps, es van afegir peròxid d'hidrogen 3 mM i 5 mM durant 3 h. A causa de la manca de diferències entre els efectes de Concentracions d'HO2 at3 i 5 μM, per a estudis estadístics, es van tractar com els mateixos tractaments i es van descriure com a tractament 3-5 uM H2O2.

Després de 50μL MTT（3-【4,5-dimetiltiazol-2-il】-2,5 solució de bromur de difenil tetrazoli）(solució estèril de 5 mg/mL) es va afegir a les cèl·lules i es va incubar durant 2 h a 37 graus en una atmosfera humidificada al 5% de CO. A continuació, es van afegir 0, 4 ml de dimetil sulfòxid (DMSO) a cada pou i es van mantenir durant 10 min. Després de la centrifugació, es va mesurar la densitat òptica del sobrenedant a 570 nm mitjançant un lector de plaques de microlitres (BioTek Instruments, VT, EUA).

4.4.Assaig de danys a la membrana (assaig LDH)

L'assaig de lactat deshidrogenasa (LDH) es va utilitzar com a marcador de la totalitat de la membrana cel·lular.

Les cèl·lules en una quantitat d'1 × 1{{10}}* cèl·lules per pou es van sembrar en una placa de 96-pou i es van incubar en presència de quercetina （3.75-200 μM） durant 24 h; A continuació, es van afegir 3 mM i 5 mM d'H2O durant 3 h. Als tubs que contenien 0,5 ml de piruvat de sodi 0,75 mM i 10 uL de NADH (140 μM) (escalfat a 37ºC durant 10 min), es van afegir 150 μL de sobrenedant i es van incubar durant 30 min a 37 graus. A continuació, es van afegir 0,5 ml de 2,4-dinitrofenilhidrazina a la mostra i, després d'1 h, es va mesurar l'absorbància a 450 nm.

4.5. Determinació de la peroxidació lipídica (concentració de MDA)

La peroxidació lipídica de la membrana es va estimar mitjançant la reacció d'àcid tiobarbitúric (TBA) amb malondialdehid (MDA). Les cèl·lules es van sembrar en plaques de {{{0}}pous que contenien quercetina i H, O2 (en concentracions i temps descrits anteriorment) en una quantitat d'1 × 104 cèl·lules per pou en un volum de { {10}},25 ml. Després del tractament, les mostres es van recollir i es van centrifugar (1000×&,5 min). Als pellets, es va afegir 0, 5 ml de TCA al 0, 5 per cent, es va vortexar durant 1 min i es va lisar per sonicació durant 5 min. Després de la centrifugació a 10.000 × g durant 10 min, es van afegir 0, 4 ml de sobrenedant a l'1, 25 ml de TCA al 20 per cent amb un 0, 5 per cent de TBA i es van escalfar en un termobloc sec (100 graus) durant 30 min. Després del refredament, es va mesurar l'absorbància a 532 nm utilitzant el coeficient d'extinció molar de MDA igual a 155 M-1 cm-1.

4.6.Model de Membranes

Ozonització tampó. El tampó de fosfat (0,01 M, pH 7,4) es va saturat amb ozó produït pel generador d'ozó FM 500 (Grekos, Polònia). La concentració d'ozó en un tampó es va determinar segons Bader i Hoigne [42].

Isotermes de pressió superficial.creixement del penis de cistancheL'abeurador Langmuir (KSV, Finlàndia) es va utilitzar per al registre d'isotermes de pressió superficial a una velocitat de compressió constant corresponent a una velocitat de barrera de 5 mm/min. La monocapa lipídica es va formar repartint una quantitat definida de solució de cloroform lipídic a una concentració d'1 mg/ml a la subfase composta per tampó fosfat aquós 0,01 M, pH 7,4 amb o sense quercetina i amb o sense ozó. Les tensions superficials es van mesurar amb una placa Pt-Wilhelmy. Els experiments es van realitzar a 25 graus ± 1 grau.

4.7. Anàlisi estadística

Es van realitzar de tres a sis anàlisis independents per a cada variant provada i es van promediar (± SD). Les diferències significatives en comparació amb els controls es van estimar mitjançant l'explotació del procediment SAS ANOVA. L'anàlisi estadística es va realitzar mitjançant la prova de rang múltiple de Duncan, prenent p<0.05. statistical="" tests="" were="" carried="" out="" using="" statistica="" 13.3(cracow,="">

Contribucions de l'autor: Conceptualització, BK, BD i ER-S.methodology, BKBD; programari, BK, BDvalidation, BK, BD, ER-S., ABwriting: preparació de l'esborrany original BK, BD, ER-S., redacció: revisió i edició, BK, BD, ER-S., ABvisualization, BK, BDsupervision, BK, BD, ER-S., ABATots els autors han llegit i han acceptat la versió publicada del manuscrit.

Finançament:Aquesta investigació no va rebre cap finançament extern.

Declaració de la Junta de Revisió Institucional: No aplicable.

Declaració de consentiment informat: No aplicable.

Declaració de disponibilitat de dades: Les dades es troben a l'article. Conflictes d'interessos: els autors declaren no conflicte d'interessos.

Aquest article està extret de Molecules 2021, 26, 4945. https://doi.org/10.3390/molecules26164945 https://www.mdpi.com/journal/molecules