SNP Rs708727 associat a la malaltia d'Alzheimer a SLC41A1 pot augmentar el risc de malaltia de Parkinson: informe de l'estudi eslovac ampliat, part 2

2.2. Anàlisis genètiques

Les anàlisis genètiques es van realitzar en els SNP A1 rs11240569, rs708727 i rs823156 en la cohort de 508 pacients amb EP (vs. 150 pacients en l'estudi pilot) i la cohort de 472 controls (vs. 120 controls en l'estudi pilot) [37]. Així, el nombre de pacients amb PD i de proves de control es va incrementar en aquest estudi en 3,{10}} vegades i 3,9 vegades, respectivament, en comparació amb l'estudi pilot.

Moltes persones experimenten pèrdua de memòria a mesura que envelleixen, però per a les persones amb malaltia de Parkinson, els canvis de memòria poden ser més pronunciats. Tanmateix, no hem de pensar que les persones amb malaltia de Parkinson pateixen un deteriorament de la memòria, perquè hi ha coses que podem fer per ajudar-los a mantenir la seva memòria.

En primer lloc, fer de manera constant algunes activitats d'entrenament cerebral pot ajudar les persones amb malaltia de Parkinson a millorar la seva memòria. Aquestes activitats poden incloure: fer Sudoku, jugar a jocs de taula, resoldre trencaclosques i molt més. Mitjançant aquestes activitats, poden exercir la seva memòria, millorar la seva funció cerebral i ajudar-los a mantenir el seu estat mental.

En segon lloc, la dieta també té un impacte molt important en la memòria dels pacients amb malaltia de Parkinson. A la dieta hi podem afegir alguns aliments rics en proteïnes i nutrients, com el peix, les mongetes, els fruits secs, etc. Aquests aliments ens poden ajudar a mantenir-nos sans i millorar la nostra memòria.

Finalment, l'exercici regular també pot ajudar les persones amb malaltia de Parkinson a millorar la seva memòria. L'exercici no només ens ajuda a mantenir-nos saludables físicament, sinó que, el que és més important, millora la nostra funció cerebral. Mitjançant l'exercici regular, poden augmentar la seva funció cardiopulmonar, millorar l'elasticitat dels seus músculs i ossos i millorar la seva memòria.

Amb tot, si les persones amb malaltia de Parkinson experimenten una disminució de la memòria depèn del seu estil de vida i dels seus hàbits alimentaris, així com de si presten atenció a coses com l'entrenament cerebral i l'exercici. Sempre que prestem atenció a aquests aspectes, crec que la memòria dels pacients amb malaltia de Parkinson es pot millorar de manera efectiva. Es pot veure que hem de millorar la nostra memòria. Cistanche deserticola pot millorar significativament la memòria perquè Cistanche deserticola és un material medicinal tradicional xinès amb molts efectes únics, un dels quals és millorar la memòria. L'eficàcia de la carn picada prové d'una varietat d'ingredients actius que conté, com l'àcid carboxílic, polisacàrids, flavonoides, etc. Aquests ingredients poden promoure la salut del cervell a través de diversos canals.

Feu clic a conèixer maneres de millorar la funció cerebral

In the sub-cohort of 96 PD patients and 100 controls, we also examined A1 SNPs rs9438393, rs56152218, and rs61822602 (first identified in the PD sub-cohort by the Sanger sequencing and afterward by RFLP analysis of the sub-cohort of controls). They were not analyzed in the pilot study (37]. The allele and genotype count and frequencies (fq) for each particular A1 SNP in the PD and the control cohorts are summarized in Table 3. The minor allele fa was, for rs11240569 (C>A) a la nostra cohort total (casos de PD + proves de control), aproximadament comparable amb el rang de fq de població total d'al·lels menors (MATPFR) informat per les bases de dades gnomAD i ExAC, de la següent manera: fqo (observat) vs. per (informat) {{1 }}% ​​vs. 29-30%.

L'al·lel menor fq per a rs708727 (G > A) a la nostra cohort total era superior al MATPFR a les bases de dades gnomAD i ExAC (fq, enfront del=40% vs. 29-30%), però era comparable amb l'al·lel menor rs708727 fq informat per a la població europea a la base de dades ALFA (41%). L'al·lel menor rs823156 (A> G) fq de la nostra cohort total era del 17% i, per tant, era inferior a MATPFR a les bases de dades gnomAD i ExAC (23-30%), però era comparable amb l'al·lel menor rs823156 fq informat per a la població europea a la base de dades ALFA (18%).

La freqüència de l'al·lel menor de rs9438393 (A> G) a la cohort total era del 40% i, per tant, era notablement superior al MATPFR del 26-29% informat a les bases de dades gnomAD i TOPMED, però era comparable amb el menor rs9438393. freqüència d'al·lels informada a la base de dades ALFA per a la població europea (41%). L'al·lel menor de rs56152218 (T > C) a la cohort total estava present amb un fq del 38%, que es troba dins del MATPFR del 32-46% informat per les bases de dades ALSPAC, TOPMED i ALFA (població europea).

Curiosament, a les poblacions vietnamites, coreanes i qataries, l'al·lel menor és T i no C, tal com s'observa a la població europea [https://www.ncbi.nlm.nih.gov/snp/?term{{0} }rs56152218, consultat el 2 d'agost de 2021)]. Es va trobar que el fq de l'al·lel menor a rs61822602 (G > T) era del 12%. Això és comparable amb les freqüències de l'al·lel T informades per les bases de dades ALSPAC i TWINSUK (12% i 13%, respectivament), però és molt superior al fq de l'al·lel T informat a la població europea a la base de dades ALFA (6%).

Tots els SNP A1 provats a les nostres cohorts de PD i control estaven en equilibri Hardy-Weinberg (HWE; Taula 4).

A continuació, vam calcular les probabilitats (OR) de l'al·lel menor i els genotips que contenen l'al·lel menor per a cada SNP provat. Aquests resultats es resumeixen a la taula 5. El genotip GA a rs708727 es va associar amb PD (OR=1,42 (1,08-1,87), p=0,01) a la nostra població. A més, vam provar l'associació de combinacions genotípiques particulars per a cada SNP provat amb PD en models genètics recessius, dominants i completament sobredominants (taula 6). Coherent amb les dades anteriors, vam identificar una associació de l'al·lel menor (A) rs708727 amb PD en models genètics dominant (GG vs. GA + AA) i completament sobredominant (GG + AA vs. GA) (ORD {{16} },36 (1,05–1,77), p=0,02 i ORCOD=1,34 (1,04–1,72), p=0,02, respectivament). Els SNP restants no van mostrar cap associació amb PD en els models genètics provats (taula 6).

També vam provar la igualtat de proporcions poblacionals de qualsevol combinació genotípica composta de doblets, trillissos, quadruplets, quintil·lets o sextillissos dels SNP provats a la cohort PD (N {{0}}) i la cohort de controls ( N=100) per examinar la mida de l'efecte de les interaccions entre els SNP A1 provats cap a la susceptibilitat per desenvolupar PD a la nostra població. En total, un total de 12 combinacions genotípiques (dos doblets, set triplets i tres quadruplets, taula 7) amb significativament (p < 0.05, 10 genotips; p < 0,06, dos genotips). ) es van identificar diferents recomptes a les cohorts de PD i control (taula 7). Seguint els criteris de Cohen [39], que descriuen les diferències de proporcions, només el triplet GG(rs708727) + AG(rs823156) + CC(rs61822602) dels 12 genotips va mostrar la diferència de mida "mitjana" definida per h(2arcsin√ de Cohen). –2arcsin√ prp2) Major o igual a 0,5.

El valor h dels 11 genotips restants oscil·lava entre 0.32 i 0.46 i, per tant, es trobava dins de l'interval h de 0.2 a 0.5, que defineix petites diferències de proporcions (taula 7) [39]. Per tant, el triplet GG(rs708727) + AG(rs823156) + CC(rs61822602) podria ser clínicament significatiu i s'haurien de dur a terme exàmens futurs d'aquest genotip sobre la susceptibilitat a la PD. Per a rs11240569, rs708727 i rs823156, vam realitzar el mateix tipus d'anàlisi amb dades font de la cohort de 508 pacients amb PD i la cohort de 472 controls. Quatre genotips, dos doblets (GG(rs11240569) + AG(rs708727), GG(rs708727) + AG(rs823156)) i dos triplets (GG(rs11240569) + GG(rs708727) + AGG31561 (rs708727), (2GG39561) + GG(rs708727) + AG(rs823156)), amb recomptes significativament diferents (p < 0, 05) en les cohorts de PD i control, es van identificar. La h de Cohen calculada per a cadascun dels quatre genotips estava per sota del llindar de 0, 2 [39], i per tant, la diferència entre les proporcions de població entre els grups provats va ser, en els quatre casos, insignificant.

L'envelliment, seguit del gènere masculí, es considera el factor de risc més destacat per a l'aparició de la MP idiopàtica [37]. En el nostre estudi pilot, l'edat d'inici de la PD idiopàtica en la cohort de 15 pacients amb PD 0 no es va correlacionar amb la presència de cap combinació genotípica per als SNP rs11240569, rs708727 i rs823156 [37]. Aquí, hem correlacionat l'edat d'inici de la MP amb (1) la presència de cada combinació genotípica per als SNP rs11240569, rs708727 i rs823156 en el grup de 508 pacients amb PD (figura 2) i (2) amb la presència de cadascun. combinació genotípica per a SNP rs11240569, rs708727, rs823156, rs9438393, rs56152218 i rs61822602, a la subcohort de pacients amb PD, seleccionats aleatòriament per a la seqüenciació de la cohort A1PD3 (figura 3). Sobre l'edat d'inici, una anàlisi ANOVA unidireccional va revelar que no hi havia cap diferència significativa (p <0, 05) entre les subpoblacions genotípiques per a cadascun dels SNP provats tant a la gran cohort de PD com a la sub-cohort de PD. pacients. Així, cap genotip en particular dels SNP provats no influeix en l'edat d'aparició de la forma idiopàtica de PD. Això està totalment d'acord amb la conclusió extreta del nostre estudi pilot [37].

També hem realitzat el mateix tipus d'anàlisi per a cadascun dels SNP provats en subpoblacions de dones i homes que es van derivar de la gran cohort (N=508) i de la subcohort (N=96 ) dels pacients amb EP. Tal com es demostra a les figures complementàries S1-S3, no hi ha cap associació significativa (p <{6}}.05) entre l'edat d'inici i la presència de cap combinació de genotips particulars en els SNP provats i rs61822602 als subgrups dividits per gènere es va derivar de la gran cohort de PD (NM=306, NF=202) o de la subcohort de PD seleccionada per a la seqüenciació del promotor A1 (NM {{20} }, NF=42).

2.3. Aprenentatge automàtic de RandomForest (RF-ML)

Tots els SNP A1 es van provar per la seva capacitat de discriminar entre pacients amb PD i controls amb RF-ML. L'algorisme RF-ML es va entrenar amb les nostres dades i es va avaluar la importància discriminativa dels SNP individuals mitjançant una construcció tècnica, coneguda com a profunditat del gràfic [37,40]. Com en el nostre estudi pilot [37], la capacitat predictiva dels SNP provats es va visualitzar i quantificar per corbes ROC (característica de funcionament del receptor) i per AUC (àrea sota corba ROC), respectivament. La capacitat de discriminació dels predictors es dóna dins de l'interval d'AUC des del 100% (capacitat de discriminació màxima) fins al 50% (capacitat de discriminació mínima); AUC < 50% correspon a no capacitat discriminatòria.

L'algorisme de RF es va entrenar en els modes següents: (1) amb tres o sis (taula 8) SNP A1 particulars (cada SNP, tres genotips (AMAM/AMAm/AmAm, on AM significa al·lel major i Am per al·lel menor), com a predictor (tres o sis models de RF, un per a cada SNP), (2) amb doblets genotípics dels SNP aparellats com a predictors (tres models de RF (tres SNP) o 15 models de RF (sis SNP), un per a cada parell de SNP; Taula 8), (3) amb triplets genotípics dels tres SNP com a predictors (un model de RF (tres SNP) o 20 models de RF (sis SNP), un per a cada triplet de SNP; Taula 8), (4) amb quadruplets genotípics dels sis SNP com a predictors (15 models de RF, un per a cada quàdruplet; Taula 8), (5) amb quintullissos genotípics dels sis SNP com a predictors (sis models de RF, un per a cada quintillot; Taula 8) i ( 6) amb un sextuplet genotípic (un model de RF, taula 8).

Així, quan es van utilitzar com a predictors singletons, duplets, triplets, quadruplets, quintuplets i el sextuplet dels SNP A1, no tenien cap capacitat per discriminar entre els pacients amb PD i els controls (taula 8). Per tant, segons l'anàlisi RF-ML, i d'acord amb l'estudi pilot [37], els SNP A1 no tenen potencial per servir com a discriminadors entre els controls i els pacients amb MP i, sobre la MP, no tenen cap valor predictiu o diagnòstic a la població eslovaca. .

3. Discussió

El locus PARK16 ha cridat l'atenció de la comunitat científica per la seva associació amb la PD i el seu paper discutit en la definició de la susceptibilitat a aquesta malaltia complexa. El 2019, vam informar d'un estudi pilot en què vam analitzar l'associació dels tres SNP A1, és a dir, rs11240569, rs708727 i rs823156, amb la forma idiopàtica de PD a la població eslovaca (eslaus occidentals). Al nostre estudi no es va trobar l'associació informada de rs11240569 i rs823156 amb la susceptibilitat a la PD principalment a les poblacions asiàtiques/orientals [37]. No es va poder confirmar cap associació mitjançant estadístiques freqüentistes (anàlisis genètiques conservadores) o per anàlisi RF-ML [37].

La principal limitació del nostre estudi pilot va ser, però, el nombre relativament baix de pacients/probands a les cohorts de PD i control (150 i 120, respectivament). Vam destacar que, des d'un punt de vista estadístic, les dades s'havien d'interpretar amb cautela a causa de la petita mida de la mostra en ambdues cohorts i a causa del baix poder estadístic de les anàlisis realitzades [37]. No obstant això, utilitzant l'enfocament ML, que requereix mides de mostra considerablement més petites que les estadístiques frequentistes convencionals o el càlcul bayesià aproximat, vam poder examinar amb confiança la capacitat de determinats SNP A1 per discriminar entre pacients amb PD i controls. En tots els casos, l'enfocament ML va revelar essencialment zero rellevància diagnòstica i predictiva dels SNP rs11240569, rs708727 i rs823156 a la població eslovaca [37].

En aquest estudi, hem examinat no només els tres SNP esmentats, sinó també els tres SNP (rs9438393, rs56152218 i rs61822602) localitzats a la regió promotora d'A1. Aquests SNP s'han identificat mitjançant la seqüenciació de 96 mostres de PD seguida de l'anàlisi RFLP de les mostres de control i la verificació RFLP de les mostres de PD seqüenciades. Les nostres anàlisis genètiques no han revelat essencialment cap associació de cap dels tres SNP recentment estudiats amb PD. El mateix passa amb rs11240569 i rs823156, que s'han analitzat a les subcohorts de PD i control (96/100) i també a les cohorts de 508 pacients amb PD i 472 controls. Aquests resultats estan totalment d'acord amb el resultat de l'estudi pilot [37]. Tanmateix, a les grans cohorts, rs708727 s'associa amb un augment del risc de PD a la població eslovaca.

Segons el nostre millor coneixement, cap estudi encara ha associat directament A1 SNP rs708727 amb un risc alterat de desenvolupar PD [19,37]. En el nostre estudi ampliat (en comparació amb l'estudi pilot [37]), l'al·lel menor A de rs708727 s'associa amb un augment del risc d'inici de PD quan es prova en dominant [40] (ORD=1.36 (1,05– 1,77), p=0,02) o models completament sobredominants [41] (ORCOD=1,34 (1,04–1,72), p=0,02) (taula 5). Així, la presència de l'al·lel menor (A) a rs708727 podria estar associada a un augment del risc de desenvolupar PD. Mentre que Sánchez-Mut et al. [27] i Wang et al. [42] han demostrat clarament que la presència de l'al·lel menor A a rs708727 altera la metilació del promotor PM20D1 (i, per tant, la seva expressió) de manera dependent de la dosi (quantitativa), els models genètics més adequats en el nostre estudi. indiquen que la presència d'un al·lel rs708727 A és suficient per alterar la susceptibilitat a l'inici de la MP. La susceptibilitat a la PD (fenotip), sobre si una o dues còpies de l'al·lel menor estan presents a rs708727 (genotip), encara s'ha de dilucidar amb més detall.
Sánchez-Mut et al. han identificat PM20D1 (localitzat dins del locus PARK16 i que codifica per al domini de la peptidasa M20-que conté l'enzim proteïna 1 amb activitats tant d'hidrolasa com de peptidasa; N-acil aminoàcid sintasa/hidrolasa) com a tret quantitatiu de metilació i expressió. locus (mQTL) acoblat a un haplotip associat al risc d'AD, que mostra característiques semblants a un potenciador i contacta amb el promotor PM20D1 mitjançant un bucle de cromatina mediat pel factor de transcripció CTCF (enllaç CCCTC) depenent de l'haplotip [27]. En comparar mostres de controls sans i pacients amb MA en estadi avançat, han trobat que PM20D1 mostra constantment una hipermetilació del promotor en pacients amb AD [27]. A1 SNP rs708727 es correlaciona amb els nivells de metilació de l'ADN PM20D1 a l'escorça frontal humana i l'hipocamp [27], igual que SNP rs960603 [27]. Wang i els seus col·legues, en el seu treball sobre sang perifèrica, han adquirit dades que confirmen que PM20D1 és un mQTL mediat principalment per l'A1 SNP rs708727 associat al risc d'AD [42].

A més, les seves dades longitudinals demostren que la hipometilació es produeix abans de l'aparició simptomàtica de l'AD, possiblement per facilitar l'expressió creixent de PM20D1 per activar la seva funció protectora [42]. El progrés de l'AD es caracteritza per un nivell creixent de metilació a les illes CpG a la DMR (regió metilada diferent) del promotor PM20D1 en pacients amb AD, que finalment condueix a la inhibició de la transcripció i expressió gènica [27,42,43]. PM20D1 també s'ha associat amb la diabetis [44], l'obesitat [45] i l'esclerosi múltiple [46], i com que està localitzat dins del locus PARK16, s'assumeix la seva possible implicació/associació amb la MP [47].

Malgrat la manca d'anàlisis mecàniques moleculars, especulem, a la llum de les nostres dades actuals, que la MA i la PD (i altres malalties neurodegeneratives menys freqüents) comparteixen no només mecanismes fisiopatològics "coneguts" (per exemple, mitofagia alterada, retròmer i proteasoma). funcions), però també mecanismes epigenètics, com ara la regulació de l'expressió PM20D1 depenent de A1 rs708727- [27, 42]. El nostre treball s'afegeix indirectament a la necessitat d'aclarir detalladament el paper dels N-acil aminoàcids (NAA) endògens que són metabolitzats per PM20D1 en la patobiologia de la PD i altres trastorns neurodegeneratius. Ara se sap que els NAA i els N-acil conjugats de neurotransmissors (NAAN) tenen un paper important en la neuromodulació [48,49]. El treball recent de Song et al. Aquests autors han demostrat que la supressió de kir6.2 (una subunitat formadora de porus dels canals K+ sensibles a l'ATP) condueix a un recompte reduït de mitocondris i una reducció de la producció d'ATP mitjançant un augment dels nivells de PM20D1 i d'agents que desacoblan la respiració mitocondrial. , inclòs NADA, al mesencefalo murí [49].

NADA és un potent inhibidor de la 5-lipoxigenasa (5-LOX) i té una distribució limitada al cervell amb els nivells més alts a l'estriat i molt baixos en altres llocs [48,50,51]. 5-LOX catalitza la síntesi de leucotriens o 5-HpETE (5-àcid hidroperoxi eicosatetraenoic) a partir de l'àcid araquidònic i s'ha associat amb la neurodegeneració (AD i PD) mitjançant la seva implicació en la neuroinflamació [51, 52]. Per tant, suggerim que la disminució de l'expressió de PM20D1, la subsegüent menor abundància de NADA i l'augment de l'activitat de 5-LOX contribueixen significativament a la patologia de la MP (i altres malalties neurodegeneratives).

Sanchez-Mut i els seus companys de feina han demostrat que la sobreexpressió de PM20D1 a l'hipocamp murií d'AD dóna com a resultat una millora de l'aprenentatge, mentre que la seva eliminació augmenta la càrrega de la placa amiloide [27]. Tant les patologies de tipus Lewy com de tipus Alzheimer són importants en la demència relacionada amb la MP [53]. Un grup significatiu de pacients amb PD pateix un empitjorament de la demència durant la malaltia [54]. Tenint en compte aquestes observacions, especulem si l'activitat lligada a rs708727-que silencia PM20D1 contribueix a l'inici de la demència PD i si el seguiment de l'activitat de PM20D1 pot servir com a paràmetre pronòstic per a l'aparició de la demència PD.

El treball publicat anteriorment ha suggerit la implicació dels transportadors de Mg2+ en la patobiologia de la MP [18–22,55]. A1, essent el jugador clau en l'homeòstasi de Mg de les cèl·lules somàtiques, s'ha relacionat directament amb la PD [20–22]. Les mutacions puntuals en A1 que condueixen a substitucions p.A350V, p.R244H i p.R285Q s'han associat putativament amb PD, i se suposa que tant la manca de funció com la pèrdua de mutacions de funció en A1 tenen conseqüències perjudicials a les neurones, per tant. contribuint al fenotip PD [20–22]. Aquest treball apunta indirectament cap a la possibilitat que no només les pertorbacions de la funció central A1 (intercanvi Na+/Mg2+), sinó també la regulació epigenètica vinculada a A1-(rs708727) de l'expressió (i l'activitat de PM20D1), contribueixin a la patobiologia de la PD.

En aquest estudi, hem identificat el triplet genotípic GG (rs708727) + AG (rs823156) + CC (rs61822602) com a potencial clínicament significatiu (h superior o igual a 0,5). Curiosament, rs708727 amb genotip GG forma part del triplet. Tanmateix, a la llum d'investigacions anteriors, s'espera que el genotip que conté l'al·lel menor A a rs708727 estigués relacionat amb un risc potencial de PD associat a aquest triplet. Actualment, no podem comentar cap interacció molecular/genètica/epigenètica que impliqui els SNP del triplet GG(rs708727) + AG(rs823156) + CC(rs61822602), i per tant, sobre qualsevol contribució putativa d'aquest triplet a una suma. del risc d'aparició de la MP.

En el nostre estudi pilot, vam utilitzar RF-ML per avaluar i interpretar les nostres dades [37]. El principal avantatge de l'anàlisi de dades RF-ML és doble, com segueix: (1) permet quantificar la capacitat discriminatòria dels SNP entre pacients amb PD i controls [37], i (2) requereix mides de mostra més baixes per a l'avaluació de la importància discriminatòria dels SNP individuals o les seves combinacions [37]. A més, RF-ML evita el problema del valor p associat sovint amb mostres més grans, fins i tot quan estan disponibles [56]. Com en el nostre informe anterior, cap dels SNP A1 provats s'ha demostrat que tingui el poder de discriminar entre pacients amb PD i provants no PD a la nostra cohort (taula 8). Per tant, podem suposar que cap dels SNP A1 provats és adequat per servir com a discriminador PD/no PD a la població eslovaca.

Pel que fa a l'associació d'A1 rs708727 amb un risc alterat de MP, el resultat de la nostra anàlisi RF-ML sembla ser, a primera vista, contradictori (Taules 5 i 6 vs. Taula 8). Jakobsdottir et al. en les seves anàlisis de regressió logística i corba ROC van demostrar que fins i tot les associacions genètiques fortes no garanteixen automàticament una discriminació efectiva entre casos i controls [57]. Tot i ser classificadors pobres, els SNP amb OR significatius poden ser molt valuosos per establir hipòtesis etiològiques [57]. En el nostre cas, A1 SNP rs708727 no té cap poder de classificació pel que fa a la PD, per tant, no té importància clínica. Tanmateix, la seva associació feble, però significativa, amb el risc alterat de la MP ens va permetre especular sobre la implicació de rs708727 en la patobiologia de la MP d'una manera similar o de la mateixa manera que està implicada en l'AD [27].

4. Materials i Mètodes

4.1. Participants a l'estudi (Característiques bàsiques)

En total, es van incloure a l'estudi 980 probands (508 pacients amb EP i 472 controls, complint criteris inclusius). La forma idiopàtica de la MP va ser diagnosticada pels neuròlegs en cinc centres de diagnòstic de MP (a Martin, Bratislava, Trencin, Zvolen i Kosice) segons els criteris de diagnòstic de MP de la MDS (Movement Disorder Society). Tots els pacients van ser tractats amb teràpia anti-PD estàndard. L'edat mitjana dels pacients amb PD va ser de 68,4 ± 9,6 anys. L'edat mitjana d'inici de la malaltia va ser de 61,7 ± 10,7 anys. El cas més jove es va diagnosticar als 34 anys i el cas més antic als 89 anys. El grup de PD estava format per 202 pacients femenins (F) i 306 homes (M) i, per tant, la relació F: M era 1:1,5.

La cohort de control de proves estava formada per pacients externs i interns de la Clínica de Medicina i Toxicologia del Treball (Hospital Universitari Martin (UHM)) i la Clínica de Neurologia (UHM). Només aquells pacients que no havien estat diagnosticats prèviament amb cap malaltia neurodegenerativa i neuropsiquiàtrica, com la diabetis mellitus o l'osteoporosi (totes les malalties suposadament associades amb l'expressió A1 alterada i la desregulació de la funció A1), van ser inscrits al grup d'estudi control. L'edat mitjana dels tests control va ser de 68,3 ± 11,6 anys. El grup de control estava format per 208 individus femenins i 264 homes i, per tant, la relació F: M era 1:1,3 al grup control.

La subcohort de pacients amb PD, en què es va seqüenciar la regió promotora A1, constava de 96 subjectes seleccionats aleatòriament. La relació F:M va ser d'1:1,3 (42 dones i 54 homes). L'edat mitjana dels pacients de la subcohort de DP era de 67 anys.{{10}} ± 9,5 anys. La subcohort de control estava formada per 41 dones i 59 homes, per la qual cosa la relació F:M era 1:1,4. L'edat mitjana dels probands a la subcohort de control va ser de 59,8 ± 5,0 anys.

Aquest estudi va ser aprovat pel Comitè Ètic de la Facultat de Medicina Jessenius de la Universitat Comenius (JFM CU). L'aprovació s'ha registrat amb ID: EK 66/2019. Tots els participants de l'estudi van signar formularis de consentiment informat.

4.2. Processament de mostres

Es van recollir mostres de sang en tubs BD Vacutainer® tractats amb EDTA (Becton, Dickinson and Company, Franklin Lakes, NJ EUA). L'ADN genòmic es va aïllar de mostres de sang fresca (UHM) o congelada (altres centres de PD) mitjançant el kit de purificació d'ADN genòmic Wizard® (Promega Corporation, Maddison, WI, EUA) segons el protocol del fabricant. Les mostres d'ADN aïllades es van emmagatzemar a -80 ◦C.

4.3. Genotipat

El genotipat es va realitzar en 358 mostres de PD i 352 mostres de control. Els resultats d'aquests experiments es van analitzar juntament amb els resultats reportats anteriorment per Cibulka et al. [37]. Els SNP rs11240569, rs708727 i rs823156 es van analitzar mitjançant sondes de genotipat TaqMan® C_34251_20/rs11240569, C_375742_10/rs823156 i C_9238453_10/rscientific, Walthermscientific, MA USA) de la mateixa manera que es va informar anteriorment [37].

4.4. Seqüenciació Sanger

La regió promotora es va dividir en quatre fragments/amplicons superposats, ja que era massa llarg per a una única seqüenciació. Abans de ser seqüenciades, es van amplificar les regions objectiu. Els primers es van dissenyar utilitzant l'eina en línia Primer3Plus [https:// primer3plus.com/cgi--bin/dev/primer3plus.cgi (consultat el 3 de maig de 2018)]. Cada parell d'encebadors es va comprovar la presència de múltiples productes d'amplificació mitjançant l'eina en línia de PCR UCSC [http://www.genome.ucsc.edu/cgi--bin/hgPcr (consultat el 3 de maig de 2018)].

Els primers i programes de PCR utilitzats per a l'amplificació dels quatre fragments es resumeixen a les taules complementàries S1 i S2. Les composicions de mescles mestres per a cada fragment es resumeixen a SA3. Els fragments 3 i 4 tenen un alt contingut de nucleòtids G i C (67,4% i 71,9%, respectivament). El rendiment de la reacció es va augmentar amb l'addició de 10 × GC Rich Enhancer (Solis Biodyne, Tartu, Estònia). El producte de PCR es va purificar mitjançant NucleoSpinTM Gel i un kit de neteja per PCR (Macherey-Nagel GmbH&Co. KG, Düren, Alemanya). En el següent pas, el producte de PCR purificat es va diluir a una concentració adequada per a la seqüenciació prèvia de la PCR (SA4, SA5). Només es van utilitzar primers directes (fw) a la PCR de pre-seqüenciació. La barreja de reacció també incloïa BigDye Terminator v3.1 (Applied Biosystems, Waltham, MA, EUA) i didesoxinucleòtids.

Com a resultat, vam obtenir una barreja de productes de diverses mides acabada per didesoxinucleòtids marcats amb fluorescència. Els productes es van purificar posteriorment mitjançant el kit de neteja de la reacció de seqüenciació SigmaSpin (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, EUA) segons el protocol del fabricant. Es va transferir un volum de 3 µL de producte purificat a una placa de pou 96- juntament amb 12 µL de formamida desionitzada d'alt grau (Applied Biosystems, Waltham, MA, EUA). La mescla es va desnaturalitzar durant 5 min a 95 ◦C en un termociclador. Els fragments es van separar al 8-dispositiu microcapil·lar ABI 3500 (Applied Biosystems, Waltham, MA, EUA). Les seqüències es van exportar i visualitzar mitjançant el programari Chromas (Technelysium Pty Ltd., South Brisbane, Austràlia). Els fitxers FASTA es van penjar a BLAST (Eina de cerca d'alineació local bàsica) i es van alinear amb el genoma humà de referència (versió GRCh38.p12).

La predicció dels llocs d'unió del factor de transcripció i les seves alteracions es va realitzar mitjançant l'eina en línia ConSite [disponible a: http://consite.genereg.net/ (consultat el 3 de setembre de 2020)] [38]. Es van carregar seqüències amb l'al·lel principal i l'al·lel menor i es van generar espectres dels factors de transcripció (TF). L'anàlisi es va realitzar sense una especificitat mínima prèvia. Els canvis en els perfils d'unió de TF basats en la presència de variants es resumeixen a la taula 2.

4.5. Anàlisi RFLP (Restriction Fragment Length Polymorphism).

Els components de la barreja de reacció i les condicions de PCR de la PCR amplificada es resumeixen a SA6 i SA7. L'eina en línia in silico NEBCutter 2.0 [http://nc2.neb.com/NEBcutter2 / (consultat el 14 de febrer de 2020)] es va utilitzar per dissenyar restriccions dels amplicons. Es van triar els següents enzims de restricció per a l'anàlisi RFLP: Hpy166II (detecció de rs9438393), NIaIII (detecció de rs56152218) i BmrI (detecció de rs61822602). Tots els enzims es van comprar a New England Biolabs. Per a la variant rs144056491, no vam poder dissenyar un experiment RFLP, ja que no hi havia cap enzim adequat disponible. Després de la restricció, esperàvem que els fragments resumits a SA8 formin el rendiment. Després de la restricció, els productes es van separar mitjançant electroforesi en gel d'agarosa (NIaIII i Hpy166II 1% gel; BmrI 2% gel) i després es van visualitzar en un instrument PharosFX (Bio-Rad Laboratories). Es van determinar els genotips per a cada SNV.

4.6. Anàlisi de dades

Les dades es van explorar i analitzar mitjançant R [R Core Team (2021); R: un llenguatge i un entorn per a la computació estadística. R Foundation for Statistical Computing, Viena, Àustria. URL https://www.R-project.org/, ver. 4.0.5 (2021-03-31)]. Es va realitzar un estudi d'associació genètica (GAS) i una anàlisi de potència mitjançant biblioteques R HardyWeinberg [Jan Graffelman (2015); Explorant els marcadors genètics dial·lèlics: el paquet HardyWeinberg. Journal of Statistical Software, 64(3), 1-23. URL https://www.jstatsoft.org/v64/i03/], DescTools [Andri Signorelli et al. (2021); DescTools: Eines per a l'estadística descriptiva. Versió del paquet R 0.99.41.], epitools [Tomas J. Aragon (2020); epitools: Eines d'epidemiologia. Paquet R versió 0.5-10.1. URL https://CRAN.R-project.org/package=epitools], pwr [Stephane Champely (2020); pwr: Funcions bàsiques per a l'anàlisi de potència. Paquet R versió 1.3-0. URL https://CRAN.R-project.org/package=pwr] i un codi desenvolupat internament. El modelatge predictiu de RandomForest es va realitzar amb la biblioteca R randomForestSRC [Ishwaran H. i Kogalur UB (2021); Fast Unified RandomForests for Survival, Regression, and Classification (RF-SRC), versió del paquet R 2.11.0.]. Les dades van ser visualitzades per la biblioteca R beeswarm [Aron Eklund (2021); beeswarm: The Bee Swarm Plot, una alternativa a Stripchart. Paquet R versió 0.3.1. URL https://CRAN.R-project.org/package=beeswarm]. Es va utilitzar ANOVA unidireccional per provar la hipòtesi nul·la d'igualtat de l'edat mitjana d'inici de la població per a les tres subpoblacions de genotips per a cada SNP. Les troballes amb un valor p inferior a 0,05 es van considerar estadísticament significatius.

5. Conclusions

En resum, les nostres dades suggereixen una associació feble, però significativa, d'A1 SNP rs708727 amb PD en models genètics dominants i sobredominants en una població eslovaca. Cap dels altres SNP A1 provats (rs11240569, rs823156, rs9438393, rs56152218 i rs61822602) es va associar amb la malaltia en cap dels models genètics provats. Les anàlisis RF-ML van identificar tots els SNP A1 provats com a classificadors/predictors deficients de la MP, de manera que el seu ús en la pràctica clínica com a marcadors de diagnòstic o pronòstic segueix sent insignificant. Tanmateix, l'associació de rs708727 amb PD ens va permetre especular que l'al·lel menor associat al risc de PD (G> A) a rs708727 contribueix a l'aparició i progressió de la malaltia mitjançant la alteració de la regulació epigenètica de l'expressió PM20D1, el mecanisme conegut per tenir un paper. en patobiologia de l'AD. Aquesta hipòtesi s'hauria de seguir examinant per fer una afirmació concloent. A més, s'hauria d'aclarir una possible associació entre la demència associada a PD i rs708727.

Contribucions de l'autor:

Conceptualització, MK; metodologia, MK, MC, MG (Marian Grendar) i MB; programari, MG (Marian Grendar); validació, MC, MB i MK; anàlisi formal, MK, MG (Marian Grendar), MC, AS, ZL, ZP, TS, SS i MG (Milan Grofik); investigació, MC i MB; curació de dades, MC, MB, MG (Marian Grendar), MG (Milan Grofik), JN, VN i EK; redacció: preparació de l'esborrany original, MK; redacció—revisió i edició, MC, MG (Marian Grendar) i ZP; visualització, MK, MC i MG (Marian Grendar); supervisió, MK; administració de projectes, MC, MK, MG (Milan Grofik), JN, JB, VH, VN, EK, MS i BV; adquisició de finançament, MK Tots els autors han llegit i han acceptat la versió publicada del manuscrit.

Finançament:

Aquest treball va comptar amb el suport de l'Agència d'Investigació i Desenvolupament d'Eslovàquia, número de subvenció APVV-19-0222, i l'Agència de subvencions científiques del Ministeri d'Educació, Ciència, Recerca i Esports de la República Eslovaca i l'Acadèmia de Ciències d'Eslovàquia, número de subvenció VEGA 1/0554/19, ambdues a MK

Declaració de la Junta de Revisió Institucional:

L'estudi va ser aprovat pel Comitè Ètic de la Facultat de Medicina Jessenius de la Universitat Comenius (JFM CU). L'aprovació s'ha registrat amb ID: EK 66/2019.

Declaració de consentiment informat:

Es va obtenir el consentiment informat de tots els subjectes implicats en l'estudi.

Declaració de disponibilitat de dades:

El conjunt de dades complet es troba a l'article. La naturalesa i l'abast de les dades incloses permeten una metaanàlisi posterior. Qualsevol informació sobre l'estudi està disponible a petició de l'autor corresponent.

Agraïments:

Donem les gràcies a tots els participants de l'estudi i als seus familiars. Agraïm també a Martin Marak (JFM CU) pel seu suport tècnic competent al projecte, a Jan Radvanszky i Rastislav Hekel (tots dos GENETON sro) pels consells útils sobre les anàlisis de promotors A1, i a Theresa Jones per l'edició lingüística del projecte. manuscrit.

Conflictes d'interès:

Els autors declaren no conflicte d'interessos.

Referències

1. Tatarkova, Z.; de Baaij, JHF; Grendar, M.; Aschenbach, JR; Racay, P.; Bos, C.; Sponder, G.; Hoenderop, JGJ; Röntgen, M.; Turcanova Koprusakova, M.; et al. La ingesta dietètica de Mg2+ i l'intercanviador de Na+/Mg2+ SLC41A1 influeixen en els components de l'energètica mitocondrial en els cardiomiòcits murins. Int. J. Mol. Ciència. 2020, 21, 8221. [CrossRef] [PubMed]

2. Yamanaka, R.; Tabata, S.; Shindo, Y.; Hotta, K.; Suzuki, K.; Soga, T.; Oka, K. L'homeòstasi del Mg2+ mitocondrial decideix el metabolisme energètic cel·lular i la vulnerabilitat a l'estrès. Ciència. Rep. 2016, 6, 30027. [CrossRef] [PubMed]

3. Dudev, T.; Grauffel, C.; Lim, C. Com els cations metàl·lics natius i aliens s'uneixen a l'ATP: Implicacions per al liti com a agent terapèutic. Ciència. Rep. 2017, 7, 42377. [CrossRef] [PubMed]

4. Kolisek, M.; Zsurka, G.; Samaj, J.; Weghuber, J.; Schweyen, RJ; Schweigel, M. Mrs2p és un component essencial del principal sistema d'afluència electroforètica de Mg2+ als mitocondris. EMBO J. 2003, 22, 1235–1244. [CrossRef] [PubMed]

5. Schindl, R.; Weghuber, J.; Romanin, C.; Schweyen, RJ Mrs2p forma un canal selectiu de Mg2+ d'alta conductància als mitocondris. Biofísica. J. 2007, 93, 3872–3883. [CrossRef] [PubMed]

6. Kolisek, M.; Sponder, G.; Pilchova, I.; Cibulka, M.; Tatarkova, Z.; Werner, T.; Racay, P. Magnesium Extravaganza: un compendi crític de la investigació actual en transportadors cel·lulars de Mg2+ diferents de TRPM6/7. Reverent Physiol. Bioquímica. Pharmacol. 2019, 176, 65–105. [Ref creuat]

7. Kubota, T.; Shindo, Y.; Tokuno, K.; Komatsu, H.; Ogawa, H.; Kudo, S.; Kitamura, Y.; Suzuki, K.; Oka, K. Els mitocondris són magatzems intracel·lulars de magnesi: investigació mitjançant imatges fluorescents simultànies en cèl·lules PC12. Biochim. Biofísica. Acta 2005, 1744, 19–28. [Ref creuat]

8. Sponder, G.; Abdulhanan, N.; Fröhlich, N.; Mastrototaro, L.; Aschenbach, JR; Röntgen, M.; Pilchova, I.; Cibulka, M.; Racay, P.; Kolisek, M. La sobreexpressió de l'intercanviador de Na+/Mg2+ SLC41A1 atenua la senyalització favorable a la supervivència. Oncotarget 2017, 9, 5084–5104. [CrossRef] [PubMed]

9. Yamaguchi, H.; Wang, HG La proteïna quinasa PKB/Akt regula la supervivència cel·lular i l'apoptosi mitjançant la inhibició del canvi conformacional de Bax. Oncogen 2001, 20, 7779–7786. [Ref creuat]

10. Vauzou, D.; Vafeiadou, K.; Rice-Evans, C.; Williams, RJ; Spencer, JP L'activació de les vies de senyalització Akt i ERK1/2 pro-supervivència és la base dels efectes anti-apoptòtics de les flavanones a les neurones corticals. J. Neurochem. 2007, 103, 1355–1367. [Ref creuat]

11. Muddapu, VR; Dharshini, SAP; Chakravarthy, VS; Gromiha, MM Malalties neurodegeneratives: la deficiència metabòlica és la causa principal? Davant. Neurosci. 2020, 14, 213. [CrossRef] [PubMed]

12. Pathak, D.; Berthet, A.; Nakamura, K. Falla energètica: contribueix a la neurodegeneració? Ann. Neurol. 2013, 74, 506–516. [CrossRef] [PubMed]

13. Dharshini, SAP; Taguchi, YH; Gromiha, MM Investigant la crisi energètica en la malaltia d'Alzheimer mitjançant l'estudi del transcriptoma. Ciència. Rep. 2019, 9, 18509. [CrossRef] [PubMed]

14. Rameta, G.; Shirihai, OS La interacció entre la dinàmica mitocondrial i la mitofagia. Antiòxid. Senyal redox. 2011, 14, 1939–1951. [CrossRef] [PubMed]

15. Zhao, W.; Zhang, W.; Ma, H.; Yang, M. NIPA2 regula la funció dels osteoblasts mitjançant la modulació de la mitofagia en l'osteoporosi de la diabetis tipus 2. Ciència. Rep. 2020, 10, 3078. [CrossRef]
16. Nadler, MJ; Hermosura, MC; Inabe, K.; Perraud, AL; Zhu, Q.; Stokes, AJ; Kurosaki, T.; Kinet, JP; Penner, R.; Scharenberg, AM; et al. LTRPC7 és un Mg. Canal de cations divalents regulat per ATP necessari per a la viabilitat cel·lular. Natura 2001, 411, 590–595. [Ref creuat]

17. Kolisek, M.; Nestler, A.; Vormann, J.; Schweigel-Röntgen, M. El gen humà SLC41A1 codifica per a l'intercanviador Na+/Mg2+. Am. J. Physiol. Physiol cel·lular. 2012, 302, C318–C326. [Ref creuat]

For more information:1950477648nn@gmail.com