Una estratègia de detecció de patògens innats que implica la ubiqüitinació de proteïnes superficials bacterianes Part 2

DISCUSSIÓ

Els metazous utilitzen la ubiqüitinació com a mecanisme versàtil per mantenir l'homeòstasi citosòlica, evitant l'acumulació de proteïnes/orgànuls danyats i defensant-se dels patògens invasors (40, 41). Donada la varietat de patògens i diversos conjunts de proteïnes danyades que es troben, la identificació de motius comuns per al reconeixement de substrats i la posterior ubiqüitinació representa una estratègia intel·ligent per a l'optimització dels recursos. Les proteïnes de les cèl·lules eucariotes que es destinen a la proteòlisi s'identifiquen normalment mitjançant un motiu degron tripartit (24).

La immunitat és la capacitat del cos per combatre malalties, incloses les respostes a bacteris, virus i altres substàncies nocives. Si el sistema immunitari del cos està compromès, no serà prou fort per fer front a l'atac de la malaltia. Els estudis han demostrat que la desnutrició té un impacte en la funció del sistema immunitari, fent que el cos sigui més susceptible a infeccions i malalties. Les proteïnes són una de les substàncies importants per mantenir la immunitat.

Les proteïnes estan fetes d'aminoàcids, alguns dels quals s'anomenen aminoàcids essencials perquè han de ser aportats pels aliments i no poden ser sintetitzats per l'organisme. Aquests aminoàcids essencials inclouen triptòfan, leucina, fenilalanina, lisina, isoleucina, metionina, valina i histidina. Si el cos no obté prou aminoàcids essencials, pot provocar un deteriorament del metabolisme de les proteïnes, que pot afectar la funció del sistema immunitari.

A més, una ingesta de proteïnes d'alta qualitat ajuda a mantenir un sistema immunitari i les funcions corporals normals. Quan el cos no té proteïnes, pot provocar un sistema immunitari compromès i el cos és més susceptible a les malalties. Si el cos humà no té proteïnes durant molt de temps, pot causar danys a llarg termini al sistema immunitari, fent que les persones siguin susceptibles a diverses malalties.

Per tant, una dieta equilibrada i l'exercici adequat són les claus per mantenir la ingesta de proteïnes. Les persones poden satisfer les necessitats de proteïnes del seu cos menjant aliments més rics en proteïnes, com ara carn, aus, peix, fesols, ous, productes lactis, cereals, fruits secs i llavors. A més, l'exercici moderat també pot augmentar la demanda del cos de proteïnes i l'eficiència d'absorció. Una alimentació equilibrada i variada i un estil de vida saludable són les claus per mantenir la immunitat, mantenir el cos sa i estable, i resistir la invasió de malalties. Des d'aquest punt de vista, hem de millorar la nostra immunitat. Cistanche pot millorar significativament la immunitat perquè els polisacàrids de la carn poden regular la resposta immune del sistema immunitari humà, millorar la capacitat d'estrès de les cèl·lules immunitàries i millorar la immunitat de les cèl·lules immunitàries. Efecte bactericida.

Feu clic al suplement cistanche deserticola

Això ens va impulsar a explorar si es podrien trobar motius similars a les superfícies de patògens, on podrien funcionar com a intermediari per al reconeixement de substrats. Aquí, demostrem que les lligases d'ubiquitina host utilitzen signatures moleculars similars per detectar patògens filogenèticament diferents. El reconeixement de patògens mitjançant patrons/motivs moleculars comuns (PAMP) és una característica ben caracteritzada de la immunitat innata (42). Els nostres resultats suggereixen que les seqüències semblants a degrons dins de proteïnes de superfície bacteriana actuen d'una manera equivalent als PAMP, per impartir vigilància de patògens intracel·lulars. Aquest modus operand podria ser explotat encara més per l'amfitrió per a la presentació d'antígens de proteïnes microbianes al complex principal d'histocompatibilitat I per induir una forta resposta CD8 dirigida contra patògens intracel·lulars.

La importància potencial de la detecció de patògens mediada per ubiquitina per a les defenses de l'hoste es destaca encara més per la substancial ubiquitinació residual detectada en SPN mutant que no tenen tant BgaA com PspA. Això indica que hi ha més substrats no identificats de la maquinària d'ubiquitina, amb la redundància resultant que garanteix una intercepció robusta dels patògens. En particular, algunes preguntes immediates sobre el motiu del degron i la seva importància per als bacteris (a part de ser una unitat reconeixible) proporcionen un angle evolutiu interessant.

El motiu degron és prescindible in vivo i, en tot cas, la mutació o l'eliminació del motiu millora la persistència intracel·lular i augmenta la virulència. Això es demostra amb els nostres resultats que els patògens podrien utilitzar la mutació en el motiu degron per escapar del reconeixement mediat per la ubiquitina, tal com es veu per al serotip 19F de SPN. Tanmateix, la naturalesa conservada del motiu degron a BgaA a la majoria dels serotips SPN podria suggerir una contraestratègia adoptada pels bacteris per ser menys letal per a l'hoste.

Això podria oferir una oportunitat perquè el patogen augmenti els seus hàbitats ocupables. Simultàniament, la ubiqüitinació de la superfície bacteriana o de les proteïnes secretades al motiu degron podria modular-les funcionalment per amortir o reconnectar la resposta de l'amfitrió per a un eventual benefici (43). Per tant, la presència o absència de dominis o motius funcionals semblants als eucariotes (com ara els degrons) podria dependre d'un nínxol patogènic i adaptar-se per evadir o modular les respostes immunes de l'hoste.

Un mecanisme de detecció de patògens similar que implica proteïnes d'unió de guanilat també s'ha implicat en l'eliminació bacteriana; tanmateix, a diferència de la ubiquitinació, s'informa que el seu paper està restringit als patògens gramnegatius (44–47). La ubiquitinació s'adreça al patogen independentment de l'origen Gram, per exemple, s'ha documentat que RNF213 s'adreça a Listeria spp. independentment de l'absència de LPS (48). Per tant, tampoc eliminem la possibilitat de la seva acció antimicrobiana contra SPN.

Una superfície patògena es pot ubiquitinar amb múltiples tipus de cadena per diferents lligases E3 amb interaccions entre cadenes (41). En particular, en el cas de Mtb, Smurf1 i Parkin s'ha demostrat que formen tipus de cadenes K48 i K63 que funcionen de manera sinèrgica per degradar el patogen (12). La comprensió del paper mecanicista de la ubiqüitinació de K48 i de les lligases E3 implicades durant els escenaris d'infecció encara està poc estudiada. En el cas de STm, s'ha representat una única E3 lligasa ARIH1 per orientar STm citosòlic amb cadenes d'ubiquitina K48 que condueixen a la seva eliminació del sistema (15). Segons les nostres troballes i les d'altres, els patògens marcats amb K48-Ub es degraden finalment mentre s'associen amb la maquinària proteasòmica.

Tanmateix, aquest estudi mostra la decoració K48-Ub de proteïnes superficials bacterianes específiques. Se sap que alguns patògens modifiquen activament les seves proteïnes superficials, protegint-les de la ubiquitinació i la posterior mort, posant l'accent en la importància de la localització superficial del substrat de la ubiquitina (10). A més, múltiples patògens intracel·lulars obligats han desenvolupat estratègies per desubiquitinar-se, o components reguladors de l'hoste, per evadir l'eliminació mediada per la ubiquitina (5). En conjunt, aquestes troballes subratllen la importància de l'alarma mediada per la ubiquitina com a mecanisme fonamental de detecció de patògens intracel·lulars central per a les defenses de l'hoste.

El nostre estudi va demostrar encara més el paper central de la lligasa SCF E3, especialment amb FBXW7, en la ubiquitinació bacteriana que augmenta la degradació dels patògens. Les mutacions heterozigotes a la variant FBXW7, particularment R505C (un residu crític a la butxaca de reconeixement de substrats), desencadenen múltiples carcinomes i leucèmia limfocítica en humans (49, 50). Un estudi recent basat en cohorts va indicar que gairebé el 43 per cent dels pacients amb leucèmia limfocítica crònica (LLC) sucumbeixen a pneumònia bacteriana i sèpsia, seguida d'infeccions per fongs (51).

Això corrobora la nostra observació de la capacitat abrogada de les cèl·lules hostes que porten la mutació FBXW7 per detectar i eliminar patògens. Per tant, els nostres resultats proporcionen una explicació molecular inesperada del risc augmentat d'infeccions en pacients amb LLC. El vincle entre el polimorfisme genètic en els gens de la lligasa E3 i la susceptibilitat a les infeccions bacterianes també està demostrat pels pacients amb malaltia de Parkinson, que són vulnerables a la febre tifoide o la lepra (14), cosa que suggereix la contribució destacada de les lligases E3 en la immunitat de l'hoste contra les infeccions bacterianes i el manteniment. d'estat estacionari cel·lular.

En conclusió, vam desxifrar un llenguatge universal de detecció de patògens que viuen en el citosol que l'hoste podria aplicar de manera eficient per reconèixer els microorganismes per a la seva eliminació posterior. Col·lectivament, aquestes troballes aporten llum sobre la comprensió dels processos immunitaris cel·lulars rudimentaris, que es podrien aprofitar per intensificar la immunitat antibacteriana.

MATERIALS I MÈTODES

Cultiu cel·lular

Tant la línia cel·lular A549 de carcinoma alveolar de pulmó humà (pneumòcit tipus II) [American Type Culture Collection (ATCC) núm. CCL185)] i la línia cel·lular d'adenocarcinoma cervical HeLa (ATCC núm. CRM-CCL-2) es van cultivar en el medi d'Àguila modificat de Dulbecco (DMEM; HiMedia) complementat amb un 10 per cent de sèrum fetal boví (Gibco) a 37 graus i 5. percentatge de CO2.

Soques bacterianes i condicions de creixement

SPN (R6, serotip 2, regal de Tim J. Mitchell, Universitat de Birmingham, Regne Unit) es va cultivar en brou Todd-Hewitt complementat amb extracte de llevat a 1,5 per cent a 37 graus en un 5 per cent de CO2. Els antibiòtics següents es van utilitzar per fer créixer cultius de SPN quan calia: kanamicina (200 ug/ml), espectinomicina (100 ug/ml) i cloramfenicol (4,5 ug/ml). Es van barrejar nou-cents microlitres de cultiu SPN cultivat de 0,4 OD600 (densitat òptica a 600 nm) amb 600 ul de glicerol estèril al 80 per cent (concentració final de glicerol del 32 per cent) i es van emmagatzemar en un congelador de -80 graus. Aquestes reserves de glicerol es van utilitzar com a inòcul inicial per a tots els experiments.

Es van cultivar cultius d'Escherichia coli DH5 i STm (ATCC 14028) en brou Luria-Bertani (LB) a 37 graus en condicions de agitació (200 rpm) i, quan era necessari, es van utilitzar els antibiòtics següents: kanamicina (50 ug/ml), espectinomicina (100 ug/ml), cloramfenicol (20 ug/ml) i ampicil·lina (100 ug/ml). Per a tots els assajos d'infecció, els bacteris es van cultivar fins a OD600 ~ 0,4, seguit de la resuspensió en solució salina tamponada amb fosfat (PBS) a una densitat similar abans d'infectar les cèl·lules hoste.

Detecció de proteïnes diana putatives d'ubiquitina

Totes les proteïnes de superfície presents al proteoma STm i SPN es van identificar per primera vegada a partir de la literatura publicada. Es van obtenir seqüències de proteïnes completes de les proteïnes de superfície a partir d'UniProt, que després es van utilitzar per identificar la presència de motius degrons. Es va seleccionar un conjunt de 29 motius de degron putatius a partir de la literatura publicada (24, 52, 53) i la base de dades de motius lineals eucariotes. El mòdul regex de Python es va utilitzar per identificar la ubicació de tots aquests motius curats a les seqüències de proteïnes de superfície. A més, es va realitzar una cerca lineal per identificar la presència d'un residu de lisina a prop (de 8 a 14 residus d'aminoàcids) a cada motiu degron identificat. Es suposa que aquest residu de lisina actua com a lloc d'unió per a la part d'ubiquitina. Finalment, les seqüències de proteïnes preseleccionades es van introduir a IUPred (54), una eina de predicció de l'estructura de proteïnes, per localitzar la presència d'una regió desordenada entre el motiu degron i la lisina proximal. Les proteïnes resultants (BgaA i PspA per a SPN i RlpA per a STm) es van seleccionar per a la seva avaluació com a dianes d'ubiquitinació i descodificació del seu paper en l'eliminació de patògens.

Construcció de soca bacteriana

L'intercanvi al·lèlic per recombinació homòloga es va dur a terme mitjançant regions de flanqueig de gens que portaven un casset antibiòtic inserit per a la generació de soques mutants tant en SPN com en STm (taula S2).

Per a SPN, les regions 500-bp aigües amunt i aigües avall de bgaA, pspA i els seus gens es van amplificar a partir del genoma amb cebadors adequats (taula S3) i es van reunir al vector pBKS. Després de la clonació d'aquests fragments, es va inserir un casset de resistència als antibiòtics (espectinomicina per a la bossa, així com pspA i cloramfenicol per a hysA) en aquesta construcció. A continuació, els plasmidis recombinants lineals es van transformar en WT SPN mitjançant el pèptid estimulant de la competència 1 (GenPro Biotech), es van seleccionar recombinants mitjançant antibiòtics respectius i es va confirmar la substitució gènica mitjançant la reacció en cadena de la polimerasa (PCR) i la seqüenciació dels loci gènics respectius. Per a STm, es va utilitzar el mètode de recombinasa λ-vermell per a la generació de mutants de supressió de gens (55).

Breument, es van afegir seqüències homòlogues als extrems del gen de la corda a les seqüències d'imprimació que s'utilitzen per a l'amplificació del casset de resistència a la kanamicina. A continuació, el casset es va electroporar a la soca WT STm i es van seleccionar els knockouts generats per recombinació homòloga en funció de la resistència a la kanamicina. La supressió del gen es va confirmar mitjançant PCR i seqüenciació del locus del gen. Es van clonar pspA, hysA de longitud completa i un bgaA-T truncat (1 a 3168 pb) sota el promotor P23 al vector llançadora pIB166 (56) i es van utilitzar per a la complementació.

Aquests plasmidis recombinants també es van utilitzar per a la mutagènesi dirigida al lloc per generar diferents variants de bgaA-T (bgaA-TK96R, bgaA-TK97R, bgaA-TK96R, K97R i bgaATΔDegron), pspA (pspAK314R, pspAK314R, pspAKs, pspAK315R, pspAK315R, pAK315R, pspAK315R, pspAK315R, K97R i bgaATΔDegron). n ), i els seus (hysADegron-BgaA i hysADegron-PspA) utilitzant conjunts d'imprimadors adequats (taula S3) i transformats en mutants ΔbgaA i ΔpspA. Tots els clons es van verificar mitjançant la seqüenciació d'ADN. L'expressió de diferents variants de BgaA, PspA i HysA es va confirmar mitjançant Western blot mitjançant anticossos adequats.

Anticossos i reactius

Sèrum anti-enolasa i anti-PspA (S. Hammerschmidt, Universitat de Greifswald, Alemanya); sèrum anti-BgaA (S. King, The Ohio State University, EUA); i anticossos específics per a His6 (Invitrogen, MA1-21315), enllaç K48-Ub (Millipore, 05-1307), enllaç K{63-Ub (Millipore, 14-6077-80 ), Ply (Santa Cruz Biotechnology, sc-80500), FBXW7 (Bethyl Laboratories, A301-721A), SKP1 (Invitrogen, MA5-15928), Cullin1 (Invitrogen, {{15} }), gliceraldehid fosfat deshidrogenasa (Millipore, MAB374), GSK3 [Cell Signaling Technology (CST), D5C5Z], fosfotreonina (CST, 9381S), IgA, Kappa del mieloma murí, clon TEPC-15 (Sigma-Aldrich, M1421) i PSMB7 (Invitrogen, PA5-111404) es van adquirir. Es van utilitzar els següents anticossos secundaris: anti-conill etiquetat per peroxidasa de rave picant (HRP) (BioLegend, 406401), anti-ratolí etiquetat amb HRP (BioLegend 405306), anti-conill Alexa Fluor 488 (Invitrogen, A27206), anti-conill Alexa Fluor 555 (Invitrogen, A31572), immunoglobulina A anti-ratolí conjugada amb biotina (Life Technologies, M31115), Alexa Fluor anti-ratolí (Invitrogen, A31570), Alexa Fluor 488 anti-ratolí (Invitrogen, A21202), anti-cabra Alexa Fluor 633 (Invitrogen, A21082) i FM4-64 (Thermo Fisher Scientific, T13320).

Expressió i purificació de proteïnes

BgaA-T i les seves variants es van clonar a pET28 mitjançant llocs de restricció Xba I/Not I. Els plasmidis recombinants que codifiquen BgaA-T amb l'etiqueta His N-terminal es van transformar en cèl·lules E. coli BL21 (DE3) per a l'expressió de proteïnes. Les colònies acabades de transformar es van cultivar en LB que contenia kanamicina (50 ug/ml) a 37 graus en una incubadora agitadora durant 12 hores. L'un per cent del cultiu primari es va afegir a 1 litre de brou LB i es va incubar a 37 graus en una incubadora agitadora fins que la OD600nm va arribar entre 0,6 i 0,8. L'expressió de proteïnes es va induir afegint 100 μM d'isopropil- -D-tiogalactopiranòsid (IPTG) i fent créixer el cultiu encara més a 37 graus durant 5 a 6 hores amb agitació a 150 rpm.

Les cèl·lules es van recollir per centrifugació a 6000 rpm durant 10 min a 4 graus. El pellet de cèl·lules es va resuspender al tampó A [25 mM tris (pH 8, 0) i 300 mM NaCl] i es va lisar per sonicació. Els residus cel·lulars es van separar per centrifugació (14, 000 rpm, 50 min, 4 graus), i el sobrenedant es va aplicar a una columna Ni-NTA, equilibrada amb el tampó A. La columna es va rentar amb 10 volums de columna de tampó. A, i les proteïnes marcades amb His es van eluir amb imidazol (250 mM) al tampó A. Totes les variants de BgaA-T es van expressar i purificar mitjançant el mateix procediment. FBXW7 es va subclonar al vector pGEX-4 T{-1 amb una etiqueta de glutatió S-transferasa (GST) N-terminal del vector pCMV6-Entry-FBXW7 mitjançant l'enzim de restricció Eco RI.

FBXW7 etiquetat amb GST es va expressar en cèl·lules d'E. coli BL21 (DE3) després de la inducció de l'expressió de proteïnes amb 0.1 mM IPTG i el creixement a 30 graus durant 4 hores. GST-FBXW7 de l'extracte brut d'E. coli es va purificar mitjançant cromatografia en columna de glutatió-sefarosa (GE HealthCare). Les fraccions que contenien proteïnes purificades es van reunir i es van concentrar fins a 0,5 mg/ml mitjançant un filtre de tall de pes molecular de 10-kDa (Amicon) per centrifugació a 4700 rpm a 4 graus. La puresa de les proteïnes es va comprovar amb electroforesi en gel SDS-poliacrilamida (SDS-PAGE) seguida de la tinció amb blau Coomassie.

Transfeccions de cèl·lules hostes

BgaA-T es va clonar en el vector pAK_Tol2_TRE{_Blast (Addgene núm. 130261) inducible per doxiciclina (Addgene núm. 130261) mitjançant un kit de clonació per infusió (Takara). Es va confirmar un clon positiu mitjançant la seqüenciació de Sanger. La mutació FBXW7R505C es va dur a terme mitjançant mutagènesi dirigida al lloc utilitzant pMRX-GFP-FBXW7 com a plantilla i es va confirmar mitjançant la seqüenciació de Sanger. Totes les transfeccions es van realitzar amb el reactiu Lipofectamine 3000 (Thermo Fisher Scientific) i les seleccions es van fer en presència de clorhidrat de blasticidina (2 ug/ml; HiMedia).

derrocament del gen dirigit per siRNA

Per a la derrota de gens específics mediada per la interferència d'ARN, es van utilitzar els siRNA següents: siFBW7 (Dharmacon ON-TARGET SMARTpool L-004246-00-0005), siCullin1 (Qiagen, 1027423), siSKP1 (Qiagen, SI00301819) i siGSK3 (Dharmacon ON-TARGET) SMARTpool L-003010-00-0005). Breument, les cèl·lules A549 cultivades en una placa de 24-pou es van transfectar de manera transitòria amb siRNAs o scramble (siControl) específics de gens (150 pmol) mitjançant Lipofectamine 3000 segons les instruccions del fabricant. Trenta-sis hores després de la transfecció, les cèl·lules es van processar per a assajos de Western Blotting i immunofluorescència o protecció de penicil·lina-gentamicina.

Predicció i modelització d'estructures

Totes les estructures es van predir per AlphaFold (Protein Homology/analogy Recognition Engine V 2.0) (57) i es van visualitzar mitjançant PyMOL (The PyMOL Molecular Graphics System, versió 2.0 Schrödinger, LLC). Les estructures es van codificar per colors a PyMol basant-se en puntuacions IUPred (54) que van des d'ordenades (blau) fins a desordenades (vermell) passant pel blanc.

Western blotting

Els cultius SPN crescuts a {{0}}.4 OD600nm es van lisar per sonicació i es van recollir extractes bruts després de la centrifugació (15, 000 rpm, 30 min, 4 graus). Per als A549, les monocapes es van rentar diverses vegades amb PBS i es van lisar en tampó d'assaig de radioimmunoprecipitació (RIPA) fred amb gel [tris-Cl 50 mM (pH 7,89), NaCl 150 mM, 1 per cent de Triton X-100, 0,5 per cent de sodi desoxicolat i 1 per cent de SDS] que conté còctel inhibidor de la proteasa (Promega), fluorur de sodi (10 mM) i EDTA (5 mM). La suspensió cel·lular es va sonicar breument i es va centrifugar per recollir lisats cel·lulars. Les proteïnes presents en els lisats de cèl·lules bacterianes o A549 (10 o 20 ug) es van separar en gels SDS-PAGE del 12 per cent i es van transferir a una membrana de difluorur de polivinilidè activada. Després del bloqueig en un 5% de llet desnatada, es van sondar les membranes amb anticossos secundaris primaris i etiquetats amb HRP adequats. Les taques es van desenvolupar finalment utilitzant un substrat de quimioluminescència millorat (Bio-Rad).
Assaig de protecció de penicil·lina-gentamicina

Les soques SPN cultivades fins a OD600nm 0.4 en brou Todd-Hewitt suplementat amb 0,2 per cent d'extracte de llevat (THY) es van granular, es van tornar a suspendre en PBS ( pH 7,4), i es va diluir en medi d'assaig per a la infecció de monocapes A549 amb una multiplicitat d'infecció (MOI) de 10. Després d'1 hora d'infecció, les monocapes es van rentar amb DMEM i es van incubar amb un medi d'assaig que contenia penicil·lina (10 ug/ml). ) i gentamicina (400 ug/ml) durant 2 hores per matar la SPN extracel·lular. A continuació, es van lisar les cèl·lules amb un 0,025 per cent de Triton X-100, i el lisat es va sembrar en plaques d'agar Brain Heart Infusion per enumerar SPN viable. El percentatge d'invasió es va calcular com a [unitats formadores de colònies (CFU) en el lisat/CFU utilitzat per a la infecció] × 100. Per avaluar la supervivència intracel·lular, a les 9 hores després de la infecció (des de l'inici del tractament amb penicil·lina-gentamicina), es van preparar lisats cel·lulars com esmentat anteriorment, i es van enumerar els bacteris escampats i supervivents. L'eficiència de supervivència (per cent) es va representar com un canvi de vegades en el percentatge de supervivència respecte al control en el moment indicat (normalitzat a 0 hores).

Immunofluorescència

Per a l'assaig d'immunofluorescència, es van cultivar cèl·lules A549 o HeLa sobre cobertors de vidre i es van infectar amb soques SPN o STm a MOI ~ 25 durant 1 hora seguit d'un tractament amb antibiòtics durant 2 hores. En els moments desitjats després de la infecció (9 hores per a la infecció per SPN a A549 i 3 hores per a la infecció amb STm a HeLa), les cèl·lules es van rentar amb DMEM i es van fixar amb metanol refrigerat amb gel a -2 0 graus durant 10 min. A més, els cobertors es van bloquejar amb un 3% d'albúmina sèrica bovina (BSA) en PBS durant 2 hores a temperatura ambient (RT). Aleshores, les cèl·lules es van tractar amb un anticòs primari adequat a l'1 per cent de BSA en PBS durant la nit a 4 graus, es van rentar amb PBS i es van incubar amb un anticòs secundari adequat a l'1 per cent de BSA en PBS durant 1 hora a temperatura ambiente. Finalment, es van rentar els cobreobjectes amb PBS i es van muntar sobre portaobjectes juntament amb VECTASHIELD amb o sense 4′,6-diamidino{-2-fenilindol (Vector Laboratories) per a la seva visualització mitjançant un microscopi confocal d'escaneig làser (LSM 780, Carl Zeiss). ) per sota d'objectius de petroli de 40× o 63×. Les imatges es van adquirir després de la secció òptica i després es van processar amb el programari ZEN lite (versió 5.0). La microscòpia de superresolució es va realitzar de manera similar amb Elyra 7 (Carl Zeiss) en mode SIM. Per a l'anàlisi de colocalització, els bacteris es van puntuar mitjançant un recompte visual de n> 100 bacteris per rèplica.

Microscòpia electrònica de transmissió

Després de la infecció per SPN i STm, les cèl·lules es van rentar amb tampó de cacodilat de sodi {{{0}}, 1 M, fixat amb glutaraldehid al 2, 5 per cent (Sigma-Aldrich) en tampó de cacodilat de sodi {{{{0}}, 1 M ( Sigma-Aldrich) durant 3 hores a 4 graus. Després de la fixació, les cèl·lules es van recollir a través d'un rascador de cèl·lules i es van sedimentar a 2000 rpm durant 10 min. A continuació, es van rentar les cèl·lules amb tampó de cacodilat de sodi 0, 1 M i es van fixar posteriorment amb 1 per cent de tetròxid d'osmi en tampó de cacodilat de sodi 0, 1 M durant 20 min a 4 graus. Després de rentats posteriors amb tampó de cacodilat i aigua destil·lada, les cèl·lules es van deshidratar en concentracions creixents d'etanol (50, 70, 95 i 100 per cent) i òxid de propilè durant 30 min i finalment es van incrustar en resina epoxi (Electron Microscopy Sciences, 14300) polimerització a 75 graus durant 45 min. Posteriorment, les càpsules es van transferir a un forn a 95 graus durant 45 min. Les seccions ultrafines (70 nm) es van tallar amb un ganivet de diamant en un Ultramicrotome Leica EM UC7 i es van tacar amb un 2% d'acetat d'uranil i un 1% de citrat de plom i es van veure amb un microscopi electrònic de transmissió (Talos L120 C, Thermo Fisher Scientific) a 120 KV.

Ubiqüitinació ex vivo

A549-que expressava BgaA-T i les seves variants es van tractar amb MG132 (5 μM) i es van induir expressions de proteïnes amb doxiciclina (100 ug/ml) durant 24 hores. A continuació, es van lisar les cèl·lules al tampó RIPA i les mostres es van electroforitzar mitjançant SDS-PAGE (8 per cent). La confirmació de l'expressió de proteïnes i la ubiqüitinació de BgaA-T i les seves variants es va demostrar mitjançant Western blot després de sondejar amb anticossos anti-BgaA i anti-K48-Ub, respectivament.

Ubiqüitinació in vitro

Per als assajos d'ubiqüitinació in vitro, les proteïnes recombinants es van purificar tal com es va descriure anteriorment (58). El complex de lligasa SCFFBW7 E3 es va incubar amb E1 recombinant 0,1 mM (UBE1; Boston Biochem), 0,25 mM E2 (cdc34; Boston Biochem) i ubiquitina (2,5 ug/ml; Boston Biochem) en presència de BgaA-T purificat i les seves variants. Les reaccions d'ubiquitilació es van realitzar en tampó d'assaig [50 mM tris (pH 8), 5 mM MgCl2, 5 mM d'adenosina trifosfat (ATP), 1 mM de mercaptoetanol i 0,1 per cent de Tween 20] durant 2 hores a 25 graus. . Les reaccions es van aturar amb tampó Laemmli 5 ×, es van resoldre en gels SDS-PAGE i es van analitzar mitjançant immunoblot mitjançant un anticòs anti-BgaA.

Assaig de quinasa in vitro

Per realitzar un assaig de quinasa in vitro, es va utilitzar el sistema enzimàtic de la cinasa GSK3 (Promega) segons el protocol del fabricant amb les modificacions següents. Breument, es van afegir 3 ug de BgaA-T recombinant a 0,5 ug de GSK3 actiu amb 400 μM d'ATP en tampó de reacció compost per 40 mM de tris, (pH 7,5), 20 mM de MgCl2 , BSA (0,1 mg/ml) i ditiotreitol 50 μM. La reacció es va incubar durant 2 hores a 30 graus i es va aturar afegint 1 × tampó Laemmli. A continuació, les mostres es van bullir i es van electroforitzar per a Western blotting, com s'ha esmentat anteriorment. Es va detectar BgaA-T fosforilada amb un anticòs anti-fosfotreonina.

Model in vivo

All animal experiments were performed at the University of Liverpool in strict accordance with U.K. Home Office guidelines, under project license PP2072053, following approval from local animal welfare and ethics committees. For infection studies, 7- to 8-week female CD1 mice were purchased from Charles River Laboratories, United Kingdom, and allowed to acclimatize for 7 days before use. Briefly, mice were placed into a restraint tube, and S. pneumoniae was administered by intravenous injection into the tail vein (1 × 106 CFU in 100 μl of PBS). Mice were periodically scored for clinical signs of disease and culled when they showed signs of advanced pneumococcal disease or else at predetermined times after infection. Severity endpoints were defined as one or more of the following: substantially elevated or reduced respiratory rate, substantial reduction in natural behavior or moderate reduction in provoked behavior, loss of >20 per cent de pes corporal inicial i secreció nasal o ocular pronunciada. Es van obtenir mostres de sang mitjançant punció cardíaca sota anestèsia terminal i es van extirpar la melsa post mortem per a l'enumeració bacteriana. Les mostres de teixit es van processar amb un homogeneïtzador de teixits de mà i els homogeneïtats es van diluir en sèrie en PBS abans de posar-los a les plaques d'agar sang. Les plaques es van incubar durant la nit a 37 graus, un 5% de CO2 i es van avaluar el nombre de colònies bacterianes l'endemà.

Anàlisi estadística

Per a l'anàlisi estadística es va utilitzar GraphPad Prism versió 5. Les proves estadístiques realitzades per a experiments individuals s'esmenten a les respectives llegendes de figures. P < 0,05 es va considerar estadísticament significatiu. Les dades es van provar per a la normalitat i per definir la variància de cada grup provat. Totes les anàlisis multiparàmetres van incloure correccions per a comparacions múltiples i les dades es presenten com a mitjanes ± SD tret que s'indiqui el contrari.

REFERÈNCIES I NOTES

ME Bianchi, DAMPs, PAMPs i alarmins: tot el que hem de saber sobre el perill. J. Leukoc. Biol. 81, 1–5 (2007).

2. TH Mogensen, Reconeixement de patògens i senyalització inflamatòria en defenses immunitàries innates. Clin. Microbiol. Rev. 22, 240–273 (2009).

3. K. Ray, B. Marteyn, PJ Sansonetti, CM Tang, La vida a l'interior: l'estil de vida intracel·lular dels bacteris citosòlics. Nat. Rev. Microbiol. 7, 333–340 (2009).

4. X. Jiang, ZJ Chen, El paper de la ubiquitylation en la defensa immune i l'evasió de patògens. Nat. Reverent Immunol. 12, 35–48 (2011).

5. V. Vozandychova, P. Stojkova, K. Hercik, P. Rehulka, J. Stulik, The ubiquitination system within bacterial host-pathogen interactions. Microorganismes 9, 638 (2021).

6. E. Fiskin, T. Bionda, I. Dikic, C. Behrends, Anàlisi global de l'hoste i l'ubiquitinoma bacterian en resposta a la infecció per salmonella typhimurium. Mol. Cel·la 62, 967–981 (2016).

7. Q. Chai, X. Wang, L. Qiang, Y. Zhang, P. Ge, Z. Lu, Y. Zhong, B. Li, J. Wang, L. Zhang, D. Zhou, W. Li, W. Dong, Y. Pang, GF Gao, CH Liu, una proteïna de superfície de micobacterium tuberculosis recluta ubiquitina per desencadenar la xenofagia de l'hoste. Nat. Commun. 10, 1973 (2019).

8. EG Otten, E. Werner, A. Crespillo-Casado, KB Boyle, V. Dharamdasani, C. Pathe, B. Santhanam, F. Randow, Ubiquitylation of lipopolysaccharide by RNF213 during bacterial infection. Nature 594, 111–116 (2021).

9. A. Yamada, M. Hikichi, T. Nozawa, I. Nakagawa, FBXO2/SCF ubiquitin-ligasa complex dirigeix ​​la xenofàgia mitjançant el reconeixement del glicà de la superfície bacteriana. EMBO Rep. 22, e52584 (2021).

10. P. Engstrom, TP Burke, CJ Tran, AT Iavarone, MD Welch, La metilació de la lisina protegeix un patogen intracel·lular de la ubiquitilació i l'autofàgia. Ciència. Adv. 7, eabg2517 (2021).

11. J. Celli, LRSAM1, una ubiquitina lligasa E3 amb sentit per als bacteris. Cell Host Microbe 12, 735–736 (2012).

12. LH Franco, VR Nair, CR Scharn, RJ Xavier, JR Torrealba, MU Shiloh, B. Levine, The ubiquitin ligase Smurf1 functions in selective autophagy of mycobacterium tuberculosis and anti-tuberculous host defense. Cell Host Microbe 21, 59–72 (2017).

13. J. Noad, A. von der Malsburg, C. Pathe, MA Michel, D. Komander, F. Randow, Les cadenes d'ubiquitina lineal sintetitzades LUBAC restringeixen els bacteris invasors del citosol activant l'autofàgia i NF-κB. Nat. Microbiol. 2, 17063 (2017).

14. PS Manzanillo, JS Ayres, RO Watson, AC Collins, G. Souza, CS Rae, DS Schneider, K. Nakamura, MU Shiloh, JS Cox, The ubiquitin ligase parkin mediates resistance to intracellular pathogens. Nature 501, 512–516 (2013).

15. M. Polajnar, MS Dietz, M. Heilemann, C. Behrends, Expanding the host cell ubiquitylation machinery targeting cytosòlic Salmonella. EMBO Rep. 18, 1572–1585 (2017).

For more information:1950477648nn@gmail.com