Efecte anti-envelliment de la urolitina A sobre els oòcits bovins in vitro

Siusplau contactaoscar.xiao@wecistanche.comper a més informació

Resum:L'estrès oxidatiu i la disfunció mitocondrial s'han associat amb la disminució de la qualitat dels oòcits relacionada amb l'edat i actualment es busquen estratègies per a la seva prevenció. La urolitina A (UA) és un metabòlit natural amb efectes pro-apoptòtics i antioxidants, capaç d'evitar l'acumulació de mitocondris disfuncionals en diferents cèl·lules envellides. La UA mai s'ha provat en oòcits bovins. El nostre objectiu era estudiar l'efecte de la UA sobre el potencial de desenvolupament dels complexos cúmulus-oòcits (COC) i l'expressió de cèl·lules de la granulosa (GC) de gens importants relacionats amb la competència reproductiva. Es va avaluar la progressió de la maduració nuclear, el potencial de membrana mitocondrial (MMP) i la competència de desenvolupament d'oòcits fisiològicament madurs (22 h) i envellits in vitro (30 h d'IVM) obtinguts de dones prepuberals i adultes, complementades amb UA o no. A més, es va quantificar la quantitat d'ARNm de diversos gens (NFE2L2, NQO1 i mt-DN5) i el nombre de còpies d'ADN mt-ND5 en GC cultivats de femelles prepuberals i adultes, complementades amb UA o no. El nostre estudi va confirmar l'efecte nociu de l'envelliment dels oòcits sobre la progressió de la maduració nuclear, la MMP, la competència del desenvolupament i els nivells d'expressió gènica. Es millora el tractament amb UA durant la maduració in vitro (pàg<0.05) the="" maturation="" rate="" and="" subsequent="" developmental="" capacity="" of="" aged="" oocytes.="" a="" positive="" effect="">< 0.05)="" of="" ua="" on="" physiological="" maturation,="" mmp,="" and="" embryonic="" development="" was="" also="" identified.="" ua="" also="" interfered="" with="" the="" expression="" profile="" of="" nfe2l2="" and="" nqo1="" genes="" in="" gcs="" cultures.="" our="" findings="" demonstrate="" that="" ua="" supplementation="" is="" an="" effective="" way="" to="" prevent="" oocyte="" aging="" and="" improves="" the="" subsequent="" bovine="" embryonic="">

Feu clic aquí per saber-ne més

Paraules clau:oòcit; envelliment; Urolitina A; tecnologies de reproducció assistida

1. Introducció

La disminució de la capacitat reproductiva femenina és una de les primeres funcions fisiològiques afectades negativament per l'envelliment i, per tant, es considera un problema de salut emergent a tot el món [1,2]. A més de diversos problemes patològics, la disminució de la fertilitat femenina associada a l'edat s'atribueix en gran mesura a una disminució de la reserva ovàrica d'oòcits [1,3-5] aliada a un deteriorament de la seva qualitat depenent del temps [2]. Aquest procés de deteriorament es pot produir a causa de l'exposició dels oòcits a un microambient ovàric envellit abans de l'ovulació. A més, el gàmet femení sovint està sotmès a un envelliment post-ovulatori quan el procés de fecundació no es produeix dins del millor període de temps òptim, i l'oòcit no fecundat roman a l'oviducte o in vitro abans de la inseminació durant períodes prolongats [6]El deteriorament de la La qualitat dels oòcits és un factor crític associat al fracàs de les tecnologies de reproducció assistida (ART) ja que la seva qualitat és el principal determinant del potencial de desenvolupament de l'embrió després de la fecundació [7,8]. Sovint es va informar que l'asincronia de l'ovulació i els oòcits envellits perjudicaven l'èxit dels programes d'inseminació artificial i de producció d'embrions a l'euga, el bestiar i les ovelles, la qual cosa implica pèrdues econòmiques importants [1,9,10]. Per tant, és de primordial importància estudiar els mecanismes subjacents a l'envelliment dels oòcits, per tal de dissenyar millors enfocaments terapèutics per rescatar la fertilitat en diverses espècies, inclosos els humans, i també com a eina de millora genètica en el bestiar.cistanche wirkungCal dedicar una atenció especial a la millora de la capacitat de desenvolupament dels oòcits del bestiar prepuberal, que sovint s'utilitzen per accelerar el guany genètic i escurçar els intervals de generació.

Una de les principals causes del deteriorament de la competència del desenvolupament en els oòcits envellits és l'augment de l'estrès oxidatiu, que indueix disfunció mitocondrial, danys a l'ADN i errors de formació del fus, que influeixen en la qualitat dels oòcits [1]. Està ben establert que l'augment de la producció de radicals lliures és una causa de l'envelliment cel·lular en diverses malalties cròniques i també en la biologia reproductiva, donant lloc a resultats de fertilitat pobres [12]. El microambient ovàric, que inclou oòcits i cèl·lules de la granulosa (GC), proporciona un mecanisme de defensa antioxidant capaç de regular les condicions oxidatives i mantenir l'equilibri oxidant/antioxidant [13]. Tanmateix, durant el procés d'envelliment, l'eficiència de les defenses antioxidants per neutralitzar les espècies reactives d'oxigen (ROS) s'atenua, augmentant així el nivell d'estrès oxidatiu. El factor 2 relacionat amb el factor nuclear E2-(Nrf2 o NFE2L2), també conegut com a via de la proteïna 1 associada a ECH-like Nrf2/Kelch (Keap1), és una cascada de resposta dominant activada per l'estrès oxidatiu[14]. Aquesta via és un mecanisme de defensa cel·lular que les cèl·lules han desenvolupat per fer front als efectes nocius de l'estrès oxidatiu. En condicions normals, Nrf2 està regulat negativament per Keap1, es manté al citoplasma i es manté a nivells baixos. Quan s'exposa a oxidants, Nrf2 es dissocia de Keapl, permetent la seva translocació al nucli on s'uneix a seqüències específiques d'ADN. Aquestes seqüències, anomenades elements de resposta antioxidant (ARE), condueixen a l'activació transcripcional de gens citoprotectors, com ara NAD(P)H:quinona-oxidoreductasa-1 (NQO1), hemoxigenasa-1 (HMOX1) , i la subunitat catalítica glutamat-cisteïna lligasa (GCLC) [15,16]. Estudis anteriors van demostrar que l'activació de la via de senyalització Nrf2-Keapl disminueix el dany de l'estrès oxidatiu augmentant els nivells d'antioxidants en els GC humans i els ovaris del ratolí[17,18]. No obstant això, el seu paper en el procés d'envelliment dels gàmetes femenins continua essent difícil, tot i que està clarament establert que els mitocondris són el principal lloc de producció de ROS durant aquest procés [9,10].

Cistanche pot anti-envelliment

Per contra, els mitocondris estan implicats en diverses funcions cel·lulars crítiques i són fonamentals per satisfer la demanda de producció d'energia necessària durant la maduració dels oòcits i el desenvolupament embrionari posterior [19]. L'activitat mitocondrial competent s'ha associat altament amb un contingut més elevat d'ADN mitocondrial (mt-DNA) i la generació d'ATP [20], un potencial de membrana mitocondrial més alt [21] i el manteniment de la qualitat i la quantitat dels mitocondris mitjançant la mitofàgia [22]. A més, s'ha suggerit que l'activitat mitocondrial està directament relacionada amb la viabilitat de l'embrió i millors resultats de fertilitat [23]. L'augment de l'evidència recolza que les alteracions mitocondrials relacionades amb l'edat condueixen a l'envelliment ovàric i, posteriorment, redueixen la viabilitat i el potencial d'implantació de l'embrió. Aquestes alteracions inclouen una disminució del nombre de còpies de l'ADN mt, una disminució de la generació d'ATP [20], alteracions en l'expressió gènica mitocondrial [24, danys a l'ADN mt [25] i una reducció del potencial de la membrana mitocondrial [26].

Els enfocaments terapèutics dirigits als mitocondris van provocar un gran interès en diverses patologies associades a l'envelliment a causa del seu gran potencial per millorar la funció mitocondrial [27]. En aquest marc, s'ha demostrat que la Urolitina A (UA), un metabòlit natural obtingut després de la ingestió d'aliments com les magranes i la seva conversió per la microbiota intestinal, evita l'acumulació de mitocondris disfuncionals amb l'edat, induint la mitofàgia i també mantenint la mitocondria. biogènesi i capacitat respiratòria [28,29]. La UA s'ha aplicat com a fàrmac terapèutic prometedor per prevenir alguns càncers, com el càncer colorectal i de pròstata[30,31]. A més, la UA també té propietats antiinflamatòries [32], antiobesitat [33], antioxidants [34] i antienvelliment [35].bioflavonoides cítricsUn estudi recent ha posat de relleu els efectes de la suplementació amb UA als fibroblasts de pell humana senescents en l'activació de la via Nrf2-Keapl millorant la seva capacitat antioxidant. Aquesta activació de la via Nrf2-Keapl mitiga eficaçment el nivell de ROS, mitjançant la regulació a l'alça de l'expressió dels gens de resposta ARE Nrf2 aigües avall (SOD, NQO1, GCLC i HMOX1), cosa que indica un efecte anti-envelliment prometedor. 35].

S'han realitzat diversos estudis amb l'objectiu de retardar l'envelliment dels ovaris i, en conseqüència, millorar la qualitat dels oòcits i els resultats de fertilitat. A causa de la contribució de l'estrès oxidatiu al procés d'envelliment ovàric, així com a la disfunció mitocondrial, la suplementació amb antioxidants ha aparegut com una teràpia prometedora [36,37]. Tanmateix, es desconeix si la suplementació amb Urolitina A pot restaurar el dany que es produeix durant l'envelliment ovàric contribuint a prevenir problemes d'infertilitat. Per tant, l'objectiu d'aquest estudi era: (1) demostrar que l'envelliment podria alterar el potencial de desenvolupament dels complexos cúmuls-oòcits (COC) i l'expressió de GC de gens importants implicats en la via de senyalització Nrf2; (2) per determinar si la UA pot rescatar fertilitat femenina que demostra un efecte anti-envelliment en COC i GC envellits; i (3) avaluar l'efecte de la UA sobre el nivell d'expressió dels gens implicats en la via de senyalització Nrf2, així com sobre la qualitat dels oòcits.

2. Materials i Mètodes

2.1. Disseny experimental

Aquest estudi va ser aprovat pel Comitè de Cura dels Animals de l'Autoritat Veterinària Nacional (grau N 08965DGAV), seguint les directrius de la Unió Europea (núm. 86/609/EEC). Per investigar l'efecte de l'envelliment en l'alteració de la qualitat dels oòcits i el potencial efecte anti-envelliment de la UA, es va utilitzar un model que utilitza AOC recollits de vaques prepúberes i adultes sotmeses a envelliment in vitro (30 h de maduració) o a la maduració fisiològica (22). h) S'han aplicat processos.

2.1.1.Assaig previ—Estudi de dosi-resposta

Es va realitzar un assaig previ per determinar la concentració d'UA que s'hauria d'utilitzar durant el procés de maduració dels COC bovins basat en un estudi dosi-resposta en quatre sessions. Com que la UA mai s'ha provat en oòcits bovins, es van utilitzar dosis anteriors amb èxit per a la prevenció i mitigació d'alguns càncers i per demostrar l'efecte anti-envelliment de la UA en diferents línies cel·lulars [28,39]. Els COC obtinguts de vaques adultes prepuberals i madures (n=978) es van seleccionar i després es van dividir aleatòriament en cinc grups per provar diferents dosis d'UA: control, 1,10,25 i 50 uM durant la maduració fisiològica in vitro. Després del període de maduració, es van tacar alguns oòcits (n=154) per determinar la configuració cromosòmica i les etapes de maduració. Els oòcits madurs restants es van sotmetre a inseminació in vitro amb semen congelat/descongelat. Es van cultivar zigots presumptes i es van determinar les taxes de clivage i blastocist el dia 2 i el dia 7 de cultiu, respectivament. A partir dels resultats obtinguts, és a dir, l'absència d'efectes nocius i la promoció de la maduració i el desenvolupament del blastocist, es va seleccionar la concentració d'1 uM d'UA.

2.1.2.Experiment1

En aquest experiment, realitzat en sis sessions, tant AOC de prepuberal (edat mitjana=9 mesos, n=660) com d'adult (edat mitjana =39mesos, n=674) es van recollir vaques per avaluar la qualitat dels oòcits i el potencial de desenvolupament dels oòcits envellits i madurs fisiològicament, així com l'efecte UA per rescatar la fertilitat femenina. Els AOC es van dividir aleatòriament en 8 grups: (1) grup prepuberal control, AOC de vedells prepuberals madurats durant 22 hores (n=148); (2) Grup prepuberal UA, AOC de vedells prepuberals madurats en medi suplementat amb 1 uM de UA durant 22 h (n=155); (3) control de 30 h grup prepúber, AOC de vedells prepúbers de fins a 30 h de maduració in oitro (n{=149); (4) UA de 30 h grup prepuberal, AOC de vedells prepúbers envellits in vitro durant 30 h en medi de maduració suplementat amb 1 uM d'UA(n=144);(5) grup d'adults control, AOC de vaques adultes madurat durant 22 h (n=155 );(6) grup d'adults UA, AOC de vaques adultes madurades en medi suplementat amb 1 uM d'UA durant 22 h (n=129); (7) grup d'adults control de 30 h, AOC de vaques adultes de fins a 30 h de maduració in oitro (n=148); i (8) UA grup d'adults de 30 h, COC de vaques adultes envellides en oitro durant 30 h en medi de maduració suplementat amb 1 uM d'UA (n=138).beneficis del cynomoriumDesprés dels respectius períodes de maduració in vitro, els oòcits es van inseminar amb semen de toro capacitat descongelat. Posteriorment, es va avaluar el desenvolupament embrionari, avaluant tant la taxa d'embrions escindits i produïts, com la seva qualitat.

A més, en aquest experiment, es van recuperar els COC de cada grup per avaluar la seva etapa de maduració nuclear (grup prepuberal control, n=7; grup prepuberal UA, n =7; grup prepuberal control de 30 h, n{ {3}}; UA grup prepuberal de 30 h, n=6; grup d'adults control, n=16; grup d'adults UA, n{=21; grup d'adults control de 30 h, n{ {9}}; grup d'adults UA de 30 h, n=18). També es va avaluar el potencial de membrana mitocondrial (MP) dels AOC (grup prepuberal control, n=10; grup prepuberal UA, n{ {13}};grup prepuberal de 30 h de control, n=9; grup prepuberal de 30 h d'UA, n=9; grup d'adults control, n=15; grup d'adults de UA, n{ {19}}; grup d'adults de 30 h de control, n=10; grup d'adults de 30 h de UA, n=14).

2.1.3.Experiment2

Com que els GC tenen un paper essencial en el creixement fol·licular i el desenvolupament dels oòcits, es va realitzar un segon experiment en cinc sessions per estudiar més l'efecte de l'edat i la UA sobre l'expressió de NFE2L2, NQO1 i mt-ND5. També es va avaluar el nombre de còpies del gen mt-ND5. Els GC es van obtenir després de la centrifugació del líquid fol·licular aspirat d'ovaris de vaques prepúberes (edat mitjana=10 mesos) i adultes (edat mitjana =62 mesos). Aquestes cèl·lules es van cultivar en les condicions següents: (1) control prepuberal, cultiu de GC de vedells prepuberals; (2) UA prepúber, cultiu de GC de vedells prepúbers complementat amb 1 uM UA; (3) control d'adults, cultiu de GC de vaques adultes; i (4) UA adulta, el cultiu de GC de vaques adultes complementat amb 1 uM UA. Després de la confluència dels GC el 5è dia de cultiu, es van congelar en nitrogen líquid i, posteriorment, es van extreure l'ADN i l'ARN, permetent la quantificació posterior de les transcripcions d'ARNm de NFE2L2, NQO1 i mt-ND5 i també el nombre de còpies mt-ND5.

2.2. Recollida d'òvuls i maduració in vitro

Els ovaris de vaques adultes i prepúberes (assaig previ, n {{0}} i exp. 1, n=1334) es van recollir en un escorxador local i es van mantenir a 35-37 grau, en una solució salina tamponada amb fosfat (PBS) complementada amb 0,15 per cent d'albúmina sèrica bovina (p/v, BSA) complementada amb 0,05 mg mL-l de kanamicina. Al laboratori, es van aspirar fol·licles ovàrics de 2-8 mm de diàmetre amb una agulla de calibre 19-. Només els COC amb almenys tres capes de cèl·lules de cúmul compactes i un ooplasma homogeni es van rentar i seleccionar per a la maduració segons el disseny experimental.jacint del desertLa maduració es va aconseguir en una incubadora a 38,8 graus, 5 per cent de CO2 en aire humidificat durant 22 o 3 0 h en un medi de maduració compost de medi de cultiu de teixits 199 (TCM) amb un 10 per cent de sèrum boví fetal, sodi 0,2 mM. piruvat, 10 ng mL-l de factor de creixement epidèrmic i 10 μL mL-l de gentamicina【40】.

2.3.Recollida i Cultiu de Cèl·lules de Granulosa

Les cèl·lules de la granulosa es van obtenir del líquid fol·licular recuperat després de la centrifugació durant 1 0 min a 200x g[41]. El pellet es va suspendre en 1 ml de medi de cultiu (TCM199 més un 10 per cent de sèrum) per realitzar una altra centrifugació durant 5 min. El nou pellet es va tornar a suspendre en 1 ml de medi de cultiu complementat amb 1 uM d'UA o no segons el disseny experimental i es va homogeneïtzar amb una xeringa connectada a una agulla 19G, almenys 30 vegades per separar les cèl·lules. Després de l'avaluació de la viabilitat de GC (colorant blau tripà, 0,4 per cent p/v), les cèl·lules es van sembrar a una concentració de 2 × 105 cèl·lules viables mL-1 i es van cultivar durant cinc dies a 38,8 graus, 5 per cent de CO2 en un ambient humidificat. ambient fins a la confluència. Cada 48 h, el medi de cultiu es va donar d'alta i es va refrescar amb un de nou. Per a l'extracció d'ADN i ARN, es van recollir GC i es van rentar per centrifugació a 200 x g durant 10 min. Els pellets de cèl·lules es van tornar a suspendre en 1 ml de PBS, es van congelar immediatament en nitrogen líquid i es van emmagatzemar a -80 graus.

2.4. Maduració nuclear dels oòcits

Les etapes de maduració nuclear es van avaluar després del període de 22 h o 30 h de maduració in vitro.Mètode d'extracció de flavonoides pdfEls oòcits denudats es van fixar en una solució d'àcid acètic/etanol (1:3, v/v) i es van mantenir a 4 graus durant 48 h. A continuació, els oòcits es van tacar amb una solució acetolacmoide a l'1 per cent, es van muntar en una cambra Neubauer i es van observar amb un microscopi de contrast de fase (Olympus BX41). Els oòcits es van classificar de la següent manera: vesícula germinal (GV), cromosomes de condensació I (CCI), cromosomes de condensació II (CCII), diacinesi, anafase-I/telofase-I (AI/TI) i MII (metafase-II) . Només es van tenir en compte els oòcits amb tinció de cromatina visible [42].

2.5. Avaluació del potencial de la membrana mitocondrial

Per mesurar el potencial de membrana mitocondrial (MP), un indicador de l'activitat mitocondrial, els mitocondris es van tenyir amb iodur de 5, 6, 6'-tetracloro-1, 1', 3, 3'tetraetilbenzimidazolcarbocianina (JC-1 , Invitrogen, Waltham, MA, EUA). Els oòcits denudats es van incubar amb 5 ug mL-l de JC-1 [37] en un medi de maduració durant 30 min a 38,8 graus i un 5% de CO2 en aire humidificat a la foscor. Els oòcits es van rentar dues vegades en PBS i es van transferir immediatament a un vidre portaobjectes preescalfat i es van observar sota un microscopi de fluorescència (Olympus BX51) mitjançant el filtre de fluorescència blau (BP 470-490 objectiu UPlanFI 20 ×/0, 50). A continuació, es va calcular el potencial de la membrana mitocondrial com la relació de la fluorescència vermella/verda mesurada mitjançant el programari Image] (Institut Nacional de Salut, Bethesda, MD, EUA). 2.6.Fecundació in vitro i cultiu d'embrions

La fecundació in vitro es va realitzar amb espermatozoides congelats-descongelats d'un toro Holstein-Fris, prèviament sotmès a capacitació mitjançant el mètode de gradient de Percoll (45 i 90), a una concentració de 2 x 10 graus d'esperma mL-4.COC i Els espermatozoides es van co-incubar durant 20 h a 38,8 graus i un 5% de CO2 en aire humidificat. Aleshores, els zigots presumptes es van transferir a gotes de medi de fluid oviductal sintètic (SOF) complementat amb aminoàcids BME i MEM, glutamina, glutatió i BSA [40]. Després de 48 h de la inseminació, es va superar la taxa de clivatge (embrions escindits per total d'oòcits inseminats) i els embrions escindits es van mantenir en SOF suplementat amb BSA i un 10 per cent de sèrum boví fetal (FBS). Els embrions es van cultivar durant 12 dies [41, 43] per avaluar la taxa de desenvolupament del blastocist (els dies 7, 9 i 12; embrions D7 per embrions escindits) i la taxa d'embrions eclosionats (embrions eclosions per embrions D7) i la seva qualitat [43]. Els embrions del dia 7 es van classificar com a grau 1 (bona qualitat), 2 (qualitat justa) i grau 3 (mala qualitat) [4].

2.7.Extracció i quantificació d'ADN i ARN

L'ADN i l'ARN totals es van aïllar dels GC mitjançant el kit de preparació de plantilles de PCR High Pure (Roche, Basilea, Suïssa) i el kit PureLinkTM RNA Mini (InvitrogenTM, Waltham, MA, EUA), respectivament, segons les instruccions del fabricant. Aquests protocols incloïen l'ús de columnes de spin utilitzades per aïllar l'ADN total i l'ARN i la DNasa d'alta qualitat com a tractament per eliminar l'ADN genòmic de l'ARN[40]. Després de l'extracció, les mostres es van emmagatzemar a -80 graus. La concentració i la qualitat de l'ADN i l'ARN es van determinar mitjançant un espectrofotòmetre NanoDropTM One/OneC (ThermoFisher ScientificTM, Waltham, MA, EUA).

2.7.1. Síntesi d'ADN complementària

La síntesi d'ADN complementari (ADNc) a partir d'aïllats d'ARN es va realitzar mitjançant el kit Xpert cDNA Synthesis Mastermix (GRiSP, Porto, Portugal, segons les instruccions del fabricant. L'ARN es va transcriure inversament utilitzant 500 ng d'ARN extret de cada mostra per realitzar la síntesi d'ADNc). que es va dur a terme amb un termociclador (T100 Thermal Cycler, Bio-Rad, Hercules, CA, EUA).Els ADNc resultants es van emmagatzemar a -20 graus fins al seu ús per a més assajos. 2.7.2.Disseny de la imprimació.

Per a aquest estudi, es van dissenyar primers per a l'objectiu (NFE2L2 i NQO1) i un gen de control endogen (6-actina) mitjançant el programari Primer-BLAST del National Center for Biotechnology Information (NCBI) (http://www. .ncbi.nlm.nih.gov/tools/primer-blast/, consultat el 6 de març de 2020). Les seqüències d'encebadors per als gens de referència i els gens diana es mostren a la taula 1. A més, en aquest treball es va utilitzar el gen mt-ND5 i es van recuperar detalls sobre els primers mt-ND5 d'un estudi anterior [45].

2.7.3.Reacció en cadena de la polimerasa de transcripció inversa quantitativa

Les anàlisis de PCR en temps real es van realitzar mitjançant el Xpert Fast SYBR Green Mastermix 2X amb ROX en un termociclador QuantStudio 3 (ThermoFisher ScientificTM, Waltham, MA, EUA), utilitzant cDNA a una concentració de 25 ng uL-l. L'avaluació del nombre de còpies d'ADN mitocondrial (mt-DNA) del gen ND5 es va dur a terme mitjançant qPCR a través de l'ADN extret prèviament, utilitzant el mateix equip que per a la quantificació de gens. Es va realitzar cada reacció optimitzada, que consistia en Xpert Fast SYBR Green Mastermix 2X amb ROX, imprimació (en endavant i enrere) de cada gen objectiu, mostra (cDNA/DNA) i aigua sense RNasa que suposa un volum total de 10 μL. Les mostres es van analitzar per duplicat i les reaccions que contenien aigua en lloc de plantilla es van incloure com a controls negatius. Les mostres es van sotmetre a un protocol d'amplificació que consistia en un cicle inicial a 95 graus durant 2 min de fase de desnaturalització, seguit de 40 cicles de desnaturalització a 95 graus durant 55 s, 40 cicles de recuit durant 30 s a 60 graus (depenent de la temperatura de fusió de seqüències de cebador), i una fase d'extensió a 72 graus durant 30 s i, finalment, un període d'extensió final a 72 graus durant 10 min.

Per a la quantificació de l'expressió gènica, es va utilitzar el mètode de quantificació relativa. Aquest mètode de quantificació relativa de l'expressió gènica es va dur a terme amb els nivells d'expressió dels gens diana en estudi, que es van normalitzar amb els gens domèstics, pel mètode comparatiu CT. Com que l'amplificació per RT-qPCR es va realitzar per duplicat, es van determinar els valors CT mitjans de cada gen i es van calcular els nivells d'expressió mitjançant la fórmula següent:

on △Ct=Ct gen objectiu -Ct gen de control endogen.

Per a la quantificació del nombre de còpies de l'ADN mt, es va utilitzar la quantificació relativa normalitzada amb el mètode de massa unitària. Aquest mètode es va dur a terme amb els valors de CT dels GC tractats amb UA (anomenats com a prova), que es van normalitzar amb mostres de control (actualment designades com a calibrador). Com que el nombre de còpies mt-ND5 es va avaluar per qPCR i es va realitzar per duplicat, es van determinar els valors CT mitjans de les mostres de proves i calibradors i es van calcular les proporcions mitjançant la fórmula següent:

on △Ct=Ct calibrador-Ct prova i E és l'eficiència.

Aquest article està extret de Animals 2021, 11, 2048. https://doi.org/10.3390/ani11072048 https://www.mdpi.com/journal/animals