Poli i oligosacàrids Ulva Sp. Les fraccions de l'extracció assistida per enzims modulen el metabolisme 2

Siusplau contactaoscar.xiao@wecistanche.comper a més informació

3. Discussió

El nostre objectiu principal és avaluar les activitats biològiques potencials de les fraccions de poli i oligosacàrids d'Ulon sp. obtingut després d'un innovador procés d'extracció assistida per enzims (EAE), que se sap que millora el rendiment d'extracció [5] i permet un enriquiment significatiu de fraccions en ulvans en comparació amb la maceració [36], sobre el metabolisme dels fibroblasts dèrmics de la pell humana en cultura.

Feu clic aquí per saber-ne més

Es va centrar en l'expressió dels components de la matriu extracel·lular de la pell (ECM) implicats en la via anabòlica (especialment col·lagens tipus I i Ⅲ, GAG i TIMP-1) i en la via catabòlica (MMP-1). a nivell proteòmic i transcriptòmic. En aquest treball, vam suposar que a causa de l'alta composició en hidrats de carboni i àcids urònics de les fraccions, l'activitat està relacionada amb la composició d'ulvans (poli i oligosacàrids). No obstant això, els autors no han de descuidar que els ulvans de polisacàrids de l'Uloa sp. La paret cel·lular està estretament relacionada amb les proteïnes, que també se sap que promouen la producció de col·lagen total i àcid hialurònic in vitro en fibroblasts dèrmics humans [39]. Així, els autors suggereixen que aquestes activitats podrien estar relacionades amb una sinergia entre ulvans i proteïnes, tot i que en aquest manuscrit l'atenció es centra en les ulvans. 3.1.Acció de les fraccions d'uloa de poli i oligosacàrids de l'EAE sobre el metabolisme dels fibroblasts de l'ECM

Estudis anteriors han demostrat que les fraccions d'Uloa sp.Extracte de Cistanche Anti Radiació(ulvans bruts i ulvans de baix pes molecular) tenen la capacitat de modular la proliferació normal de fibroblasts dèrmics humans [36-38]. Els nostres resultats van indicar que les fraccions de poli i oligosacàrids de l'EAE van induir un augment significatiu de l'activitat metabòlica dels fibroblasts (fins a més del 68 per cent). Aquests resultats van confirmar dades publicades preliminars anteriors dels autors [36] i treballs previs sobre l'extracte hidrolitzat d'Uloa pertusa a 250 ug/mL que va induir una proliferació significativa de fibroblasts pre i senescents [38]. L'augment de l'activitat metabòlica no va anar acompanyat de l'efecte de citotoxicitat de les fraccions (avaluat mitjançant assaig LDH), cosa que significa que els resultats de bioactivitat de les fraccions d'Uloa de poli- i oligosacàrids de l'EAE no estan esbiaixats per un efecte citotòxic en el rang de concentracions provades. El nostre resultat està d'acord amb estudis anteriors que destaquen els ulvans com a compostos no citotòxics en diferents tipus de cèl·lules (línies cel·lulars de macròfags, cèl·lules intestinals, fibroblasts, cèl·lules de ratolí i cèl·lules Vero)[13,14,4]

cistanche pot anti-envelliment

Com s'ha esmentat a la introducció, els col·lagens tipus I i III i els GAG interaccionen junts per establir una xarxa molecular per al muntatge de l'ECM a la dermis. Així, en aquest estudi, s'ha investigat la síntesi de proteïnes i l'expressió del nivell d'ARNm dels components principals de l'ECM de la dermis (col·lagens tipus I i Ⅲ i GAGs sulfatats i no sulfatats) en presència de poli i oligosacàrids Ullon sp. fraccions d'EAE. A més, la MMP-1, un enzim clau implicat en la degradació del col·lagen tipus I (via del catabolisme de l'ECM) i el seu inhibidor de teixit TIMP-1 implicat en la seva regulació també es van avaluar a nivells de proteïnes i ARNm.

Els resultats van revelar que les fraccions Ulva de poli i oligosacàrids de l'EAE van millorar la síntesi total de col·lagen a 1000 ug/ml (fins a més un 2 per cent avaluat amb assaig Red sirius i resultats significatius excepte per DEP-AD PP-UE). Aquests resultats difereixen d'un estudi anterior on les furgonetes brutes i els ulvans de baix pes molecular no tenen cap efecte significatiu en la síntesi total de col·lagen [37]. Tanmateix, els nostres resultats estan d'acord amb els treballs anteriors, que van demostrar que els preparats de polisacàrids rics en L-ramnosa (ROP) de soques de pneumònia de Klebsiella estimulen la síntesi de col·lagen [45]. De fet, els fibroblasts dèrmics humans contenen un lloc de lectina que és capaç de reconèixer -L-ramnosa [46]. D'aquesta manera, la fracció ramnosa de la fracció ulvan pot ser reconeguda pel fibroblast dèrmic humà i, a continuació, promoure la síntesi de col·lagen. En particular, es va augmentar la síntesi de col·lagen de tipus I per a totes les fraccions en ELISA (significatiu per a UE i DS-UE) i en assajos Western blot (NS). Aquest resultat està d'acord amb la literatura anterior sobre extractes d'Ulva pertusa hidrolitzats [38] i galactofucans despolimeritzats (<10kda)from saccharina="" longicruris[47]="" which="" respectively="" increased="" the="" synthesis="" of="" type="" i="" pro="" and="" mature="" collagen.="" in="" our="" study,="" steady-state="" levels="" of="" col1al="" and="" col1a2="" were="" reduced="" after="" exposure="" to="" poly-and="" oligosaccharide="" ulva="" fractions(significant="" for="" col1a1="" at="" 1000="" ug/nnl="" for="" all="" fractions).expression="" in="" coordinated="" manner="" of="" col1al="" and="" col1a2="" genes="" complies="" with="" the="" fact="" they="" are="" both="" subunits="" of="" type="" i="" collagen="" protein="" [48].="" regulation="" between="" type="" i="" collagen="" protein="" production="" and="" mrna="" are="" different="" at="" the="" same="" observation="" time="" of="" 48="" h,="" which="" suggests="" a="" different="" potential="" time="" response="" regulation="" between="" protein="" and="" mrna[49].="" nevertheless,="" protein="" is="" the="" functional="" unit="" in="" ecm="" and="" exhibits="" an="" important="" increase="" after="" treatment="" with="" ulvans-derived="" eae="" fractions.="" col3a1="" mrna="" level="" expression="" was="" increased="" (significantly="" for="" ue="" and="" ds-ue="" at="" 1000="" ug/ml)="" and="" correlated="" to="" an="" ns="" increase="" of="" type="" iii="" collagen="" synthesis="" evaluated="" by="" wb.="" moreover,="" the="" results="" showed="" that="" polysaccharide="" uloa="" fractions="" from="" eae="" (ue="" and="" ds-ue)="" boosted="" significantly="" gags(sulfated="" and="" non-sulfated)="" synthesis="" at="" 1000="" ug/ml,="" while="" both="" oligosaccharide="" fractions="" had="" no="" effect.="" our="" observations="" are="" in="" partial="" accordance="" with="" the="" work="" of="" adrien="" etal.="" (2017)="" in="" which="" the="" increase="" in="" hyaluronic="" acid="" production="" in="" fibroblasts="" occurred="" with="" both="" ulvans="" extracts="" (crude="" and="" low="" molecular="" weight="" ulvans)="" [37].="">cistanche herbaDe fet, en el nostre estudi, els ulvans de baix pes molecular no van tenir cap efecte en la producció de GAG ​​(incloent l'àcid hialurònic de GAG ​​no sulfatats).

Atès que l'envelliment de la pell es caracteritza per un desequilibri dels components de l'ECM (disminució dels nivells de col·lagen tipus I i II i GAG), les fraccions de poli i oligosacàrids obtingudes d'Uloa sp. després del tractament amb EAE són d'interès en les estratègies anti-envelliment, ja que estimulen els col·lagens tipus I i III i la síntesi de GAG.

Tanmateix, els nostres resultats també van posar de manifest un augment de la síntesi, l'activitat i l'expressió gènica de MP-1 en presència de fraccions derivades de poli-i oligosacàrids Uloa EAE. L'augment dels nivells d'ARNm de MMP-1 es va correlacionar amb l'augment de la síntesi de MMP-1 en presència de fraccions EAE derivades d'Ulon i significativament per a fraccions de polisacàrids (UE i DS-UE). L'augment de MMP La síntesi de l'enzim -1 també està relacionada amb un augment no significatiu de l'activitat de la MMP-1 en presència de les fraccions. El nostre resultat difereix de la literatura anterior, ja que els extractes d'Uloa pertusa hidrolitzats van inhibir l'expressió i la secreció de MMP-1 en fibroblasts senescents[38], o els polisacàrids que contenen fucosa (anomenats fucoidans) inhibeixen l'expressió de MMP-1 induïda per UVB en fibroblasts de pell humana [50]. Tanmateix, el nostre resultat està d'acord amb l'estudi de FRioux et al. (2013), ja que els galactofucans bruts (638-1529 kDa) van augmentar les MMP d'activitat catalítica total (incloent la MMP-1) dels fibroblasts tractats durant 6 dies[47]. Les nostres dades sobre l'augment del nivell de MMP també estan d'acord amb el treball d'Andrés et al. (2006), ja que les RROP (preparacions d'oligos i polisacàrids riques en ramnosa a partir de soques de pneumònia de Klebsiella i K. planticola) regulen l'expressió de MMP-9 [45]La síntesi de MMP-1 millorada normalment provoca una disminució de l'ECM quantitat de components com el col·lagen de tipus I a causa de l'activitat degradativa de la MMP-1, però això no es va assenyalar en el nostre estudi, ja que es va produir un augment del col·lagen de tipus I. A més, les fraccions derivades d'Uloa EAE no van tenir cap impacte (augment o disminució de NS) en el nivell d'expressió de l'ARNm i la producció de proteïnes de TIMP-1, un inhibidor de teixits de MP-1 (excepte per DEP-HD PP- UE amb un augment significatiu de proteïnes, p<0.05,at 1000="" μg/ml）.it="" appears="" that="" the="" anabolic/catabolic="" balance="" of="" ecm="" could="" be="" in="" favor="" of="" collagen="" synthesis="" despite="" mmp-1="" synthesis="" stimulation="" and="" activity.="" in="" this="" study,="" the="" authors="" thus="" showed="" that="" both="" poly-="" and="" oligosaccharide="" fractions="" derived="" from="" ulloa="" sp.="" after="" eae="" treatment="" are="" promoting="" fibroblast="" metabolism="" activity,="" ecm="" protein="" synthesis,="" and="" skin="" matrix="" renewal="" and="" remodeling,="" which="" is="" of="" interest="" for="" dermo-cosmetic="" applications="" in="" anti-aging="">

3.2. Paper de l'abundància d'Ulvan, la composició de sulfats i el pes molecular en la modulació de fibroblasts de l'ECM

Se sap que la característica estructural dels ulvans que inclou el seu grau de sulfatació, patró de sulfatació, composició de monosacàrids, enllaços glicosídics, grau de ramificació i el seu pes molecular afecta la seva activitat biològica [10,1,37,40,44,51] ].

Estudis anteriors han demostrat que el pes molecular de compostos bioactius com els polisacàrids o les proteïnes sembla ser un factor clau per al seu efecte sobre la proliferació de fibroblasts i la modulació de l'ECM [37,39,47]. En el nostre estudi, les fraccions de polisacàrids, UE i DS-UE, amb pesos moleculars elevats (Mw > 670 kDa) van augmentar la proliferació de fibroblasts. Tot i que les fraccions d'oligosacàrids (Mw<10 kda)="" also="" raise="" fibroblast="" proliferation,="" a="" dep-ad="" pp-ue="" fraction="" with="" lower="" molecular="" weight="" (mw="" of="" 1.5="" kda)="" has="" lower="" activity="" than="" dep-hd="" pp-ue="" (mw="" of="" 8="" kda).="" similar="" results="" were="" obtained="" on="" fibroblasts="" treated="" with="" rrops,="" since="" lower="" rrops="" exhibited="" similar="" or="" lower="" proliferation="" activity="" compared="" to="" higher="" mw="" rrops[45].="" polysaccharide="" fractions="" treatment="" also="" enhanced="" gags="" synthesis,="" total="" and="" especially="" type="" i="" and="" iii="" collagen="" synthesis,="" mp-1="" synthesis="" by="" human="" skin="" fibroblasts,="" whereas="" oligosaccharide="" fractions="" (low="" molecular=""><10 kda)="" and="" in="" particular="" dep-ad="" pp-ue="" (1.5="" kda)="" have="" lower="" capacities.="" only="" dep-hdpp-ue="" stimulated="" significatively="" total="" collagen="" synthesis="" and="" mp-1="" synthesis,="" while="" dep-ad="" pp-ue="" with="" lower="" molecular="" weight="" had="" no="" significant="" boost="" effect.="" these="" results="" are="" in="" accordance="" with="" work="" of="" kidgell="" et="" al.="" (2020)="" where="" higher="" molecular="" weight="" ulvan="" fractions="" elicited="" a="" greater="" biological="" activity="" (immunomodulatory="" response)="" compared="" to="" lower="" mw="" van="" fractions[44].="" these="" results="" are="" also="" in="" agreement="" with="" work="" of="" bodin="" et="" al.="" (20),="" since="" enzymatic="" hydrolyzed="" proteins="" from="" uloa="" intestinalis="" did="" not="" stimulate="" ecm="" material="" biosynthesis="" (collagen="" and="" hyaluronic="">

Els autors van assenyalar que la millor bioactivitat en la síntesi de GAG ​​es va atribuir a les fraccions d'alt pes molecular de polisacàrids sulfatats enriquides en ulvans bruts. Això podria estar relacionat amb la composició intrínseca dels ulvans en sulfats i el seu pes molecular, ja que l'oligosacàrid Ulva sp. les fraccions, parcialment lliures de sulfats, no tenen capacitat per estimular la síntesi de GAG.creixement del penis de cistancheUn altre estudi sobre Ulku sp. va mostrar la importància del grau de sulfatació d'ulvan en l'activitat biològica ja que la fracció d'Alvan sulfatada químicament, el contingut de sulfat duplicat del polisacàrid natiu, l'activitat anticoagulant fortament millorada [10] A més, DS-UE va augmentar més la modulació de l'ECM pel que fa als GAGs, col·lagen total i tipus I i Ⅲ síntesi, en comparació amb UE. Aquesta millor bioactivitat podria estar relacionada amb la major abundància d'ulvans i un major contingut de grups sulfat en la fracció dialitzada en comparació amb les altres fraccions.

Les nostres dades van mostrar que els poli-i oligosacàrids Uloa sp. les fraccions van mostrar diferents activitats metabòliques, que es poden atribuir a l'abundància d'ulvan, el seu grau de sulfatació i l'estructura química. Aquest treball també va destacar una millor activitat per a furgonetes d'alt pes molecular que mostren grups sulfat. El fet que les fraccions de polisacàrids riques en ulvans bruts (és a dir, no despolimeritzats) tinguin el major efecte sobre el metabolisme dels fibroblasts de l'ECM és ideal per a propers estudis i les seves futures aplicacions potencials en la cura dermocosmètica, ja que un processament mínim disminueix els costos i el temps de producció.

4. Materials i Mètodes

4.1.Material de macroalgues

Alga verde, Ulva sp. (Chlorophyta, Ulvales, Ullvaceae), es va obtenir a la platja intermareal de Landrezac (47 graus 30 graus 17,9 "N grau 2 grau 42 graus 37,1" O) a Sarzeau (Bretanya, França) el 28 de maig de 2018 durant la tarda amb la marea baixa. El material es va rentar amb aigua de l'aixeta, es va triturar fins a un diàmetre de 3 mm, es va congelar a -25 grau, es va liofilitzar (Alpha 1-4LSC, Martin Christ Gefriertrocknungsanlagen GmbH, Osterode am Harz, Alemanya) i es va emmagatzemar a l'habitació. temperatura a la foscor.

4.2.Producció i caracterització de fraccions de poli i oligosacàrids

En un treball anterior de Fourniere et al. (2019), es va descriure la producció detallada de fraccions de poli i oligosacàrids a partir de l'extracció assistida per enzims (EAE) (vegeu la figura 9 i la taula 3)[36].

Per resumir breument, l'endo-proteasa Protamex [(Novozymes, Bagsverd, Dinamarca) es va utilitzar al 6 per cent (p/p) sobre Uloa sp. algues. La hidròlisi enzimàtica es va realitzar durant 3 h a 50 graus. A continuació, l'extracte aquós es va sotmetre a una precipitació etanòlica (1:5, v Fisher Scientific, Illkirch, França) a 4 graus durant 244 h per tal d'obtenir la fracció rica en ulvans bruts (UE).

A continuació, es va produir la fracció DS-UE després de la diàlisi d'una fracció rica en Evans brut (10 mg/mL) durant 7 dies a 4 graus (tall 12-14 kDa, membrana de diàlisi Spectra/Por94, Spectrum Laboratories, Fisher Scientific). , Illkirch, França).

Es van realitzar dos procediments de despolimerització (despolimerització radical per H-OZ i despolimerització de resina d'intercanvi iònic) sobre una solució de precipitat etanòlic d'una fracció rica en ulvans bruts (25 mg/mL). Per a la despolimerització radical, peròxid d'hidrogen (8 per cent, v/v). , Fisher Scientific, Illkirch, França) es va barrejar amb la solució durant 24 h a 50 graus, i el producte es va sotmetre a una diàlisi de 48 h a 4 graus (tall de 500-1000 Da, Biotech CE Tubing , Spectra/Por@, Fisher Scientific, IIllkirch, França). Per a la despolimerització àcida, la resina Amberlite" FPC23H (equivalent a 10 ml, Sigma-Aldrich, Saint Quentin Fallavier, França) es va barrejar amb la solució durant 24 h a 80 graus, i el producte es va neutralitzar amb NaOH (0, 1 i 1 M) abans de passar 48 h. diàlisi a 4 graus (tall de 500-100 Da, Biotech CE Tubing, Spectra/Por", Fisher Scientific, Illkirch, França).Beneficis de salsa cistancheAquests dos procediments van conduir a fraccions d'oligosacàrids anomenades DEP-HD PP-UE i DEP-AD PP-UE per a H2OZ i procediment de resina àcida, respectivament.

Totes les fraccions es van liofilitzar (Alpha 1-4LSC, Martin Christ Gefriertrocknungsanla-gen GmbH, Osterode am Harz, Alemanya) i es van emmagatzemar a 4 graus abans de l'anàlisi. Caracterització d'aquestes fraccions: distribució del pes molecular de polisacàrids per cromatografia d'exclusió de mida d'alta pressió (HPSEC, UHPLC Ultimate 300, Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, EUA), composició bioquímica, composició de monosacàrids per cromatografia d'intercanvi aniònic d'alt rendiment amb amperometria polsada. detecció (HPAEC-PAD, Dionex" ICS-5000* DC, Thermo Fisher Scientific, Illkirch, França) i espectrometria de masses de ionització per desorció làser assistida per matriu en temps de vol (MALDI-TOF, Bruker, Billerica, Waltham, MA , EUA) també es van realitzar en un estudi anterior [36].

4.3.Cultura cel·lular

Les mostres de fibroblasts dèrmics humans van ser proporcionades per "Laboratoire Interactions Ep-itheliums Neurones" (LIEN, EA 4685), Brest, França. Es van obtenir mostres dèrmiques humanes a partir de biòpsies de pell de donants sans sotmesos a una cirurgia d'abdominoplàstia. L'estudi es va dur a terme d'acord amb la Declaració d'Hèlsinki i tots els pacients van signar un formulari d'acord de consentiment informat. Col·leccions de mostres adherides al comitè de l'acord local ("Comité de protection des personnes" Ouest VI) i referides a DC 2016-2833.

Els fibroblasts dèrmics humans normals (NHDF) es van cultivar al medi d'àguila modificat de Dulbecco (DMEM, Lonza, Basilea, Suïssa) amb un 10 per cent (v/v) de sèrum boví fetal (FBS, Gibco, Fisher Scientific, Illkirch, França). ), una solució antibiòtica a l'1 per cent (v/v) (penicil·lina, estreptomicina 10,000 U/ml, Gibco, Fisher Scientific, Illkirch, França) i un 1 per cent d'antifúngics (v/v) (Fungizone, amfotericina). B, Gibco, Fisher Scientific, Illkirch, França), en una incubadora de temperatura controlada amb un 5% de CO2 a 37 graus (Forma Steri-Cyclei160, Thermo Fisher Scientific Langenselbold, Alemanya). Les cèl·lules es van subcultivar mitjançant tripsinització (0,05 per cent) i solució d'EDTA (àcid etilendiaminotetraacètic) ((Gibco, Fisher Scientific, Illkirch, França) després d'arribar a la confluència. Tots els experiments es van realitzar entre el tercer i el vuitè passatge.

Les cèl·lules es van sembrar en microplaques de 96-pous a una densitat de 400 cèl·lules/pou per a assaigs de WST-1 i LDH (lactat deshidrogenasa) en plaques de 12-pous, a una densitat de 5{{8 }} cèl·lules/pou per a la tinció de Red sirius i Blue Alcian i assaig RT-qPCR, i a 6-plaques de pou a una densitat de 200.000 cèl·lules/pou per a assajos ELISA i Western blot.

En tots els experiments, després d'arribar al 80 per cent de confluència, les cèl·lules es van incubar en DMEM amb un 2 per cent de FBS en absència o presència de les fraccions de poli i oligosacàrids durant 48 h a 50 i 1000 ug/mL.

4.4.Assaig de proliferació cel·lular WST-1

El WST-1, in vitro, l'assaig es basa en la conversió de sal de tetrazoli WST-1 (4-[3-({4-lodofenil){{5 }}(4-nitrofenil)-2H-5-tetrazol]-1,3-disulfonat de benzè) en formazà (colorant taronja) per les deshidrogenases mitocondrials cel·lulars. El canvi de color és directament proporcional a la viabilitat i proliferació de cèl·lules en el cultiu.

Després de 48 h d'incubació, es va eliminar el medi i es van treure 100 uL de reactiu WST-1 (kit de proliferació cel·lular WST-1, Roche Diagnostics, Meylan, França; dilució 1:40 en DMEM amb un 2% de FBS) afegit a cada pou. Després de 45 minuts d'incubació a 37 graus amb un 5 per cent de CO2, es va mesurar l'absorbància a 450 contra 630 nm amb un lector de microplaques (Varioskan Lux, Thermo Fisher Scientific, Vantaa, Finlàndia). 4.5.Assaig de citotoxicitat de LDH

L'assaig de citotoxicitat de LDH es basa en la mesura de la lactat deshidrogenasa (LDH), que és un enzim citosòlic estable que s'allibera després de la lisi cel·lular. La LDH alliberada en sobrenedants de cultiu es mesura mitjançant la conversió d'una sal de tetrazoli (violeta de iodonitrotetrazoli) en producte de formazan vermell.dosificació de cistanche tubulosa redditLa quantitat de formazà vermell mesurada és proporcional al nombre de cèl·lules lisades.

L'assaig de LDH (CytoTox96@, Promega, Madison, WI, EUA) es va realitzar segons les instruccions del proveïdor. El control positiu (alliberament màxim de LDH) es va realitzar afegint 10 uL de solució de lisi 10 × (Triton X-100 al 0,8 per cent) durant 45 minuts abans d'afegir el reactiu CytoTox969. Després de la incubació, es van transferir 50 μL de sobrenedant de cultiu cel·lular a una nova microplaca de 96-pou (no estèril). A continuació, es van afegir 50 μL de reactiu CytoTox96 grau. La microplaca es va incubar durant 30 minuts a temperatura ambient a la foscor. Aleshores, la reacció es va aturar afegint 50 μL de "Stop solution". L'alliberament de LDH es va mesurar mitjançant la quantificació d'absorbància amb un lector de microplaques a 490 nm (Varioskan Lux, Thermo Fisher Scientific, Vantaa, Finlàndia).

4.6.Tinció amb blau d'Alcià per quantificació de glicosaminoglicans

La tinció de blau alcià és un mètode de coloració que permet quantificar dos tipus de glicosaminoglicans (GAG): sulfatats (sulfat d'heparà, sulfat de queratà, sulfat de condroitina i sulfat de dermatà) i no sulfatats (àcid hialurònic). La solució de blau alcià a pH 1 colorea els GAG sulfatats, mentre que la solució a pH 2,5 colorea els GAG no sulfatats.

Al final de la incubació, es va eliminar el medi de cultiu i es van esbandir les cèl·lules dues vegades amb PBS 1X (Fisher Scientific, Illkirch, Irance). A continuació, es van esbandir les cèl·lules durant 5 min amb 0.1N HCl (pH1, Fisher Scientific, Illkirch, França) o amb àcid acètic 3M (pH2.5, Fisher Scientific, Illkirch, França) per tal de disminuir el pH i revelen glicosaminoglicans sulfatats i no sulfatats, respectivament. A continuació, les cèl·lules es van tacar amb un 1% de blau d'Alcian (8GX, Sigma-Aldrich, Saint Quentin Fallavier, França) en solució HC10.1N (pH1) o en una solució d'àcid acètic al 3% (pH2.5) durant 30 min. Les cèl·lules es van esbandir dues vegades amb aigua de l'aixeta durant 5 minuts, es van assecar sota la caputxa i es van esbandir amb aigua destil·lada durant 5 minuts. A continuació, el colorant lligat es va solubilitzar amb una solució de clorhidrat de guanidina 6M (Sigma-Aldrich, Saint Quentin Fallavier, França) durant 5 min sota agitació a temperatura ambient. La solució de color es va transferir a una nova microplaca de 96-pou, i es va fer una lectura d'absorbància a 600 nm (Varioskan Lux, Thermo Fisher Scientific, Vantaa, Finlàndia).

4.7.Tinció vermella de Sirius per a la quantificació del col·lagen total

El procediment de tinció de Red Sirius permet quantificar el col·lagen total. Picrosirius vermell, un colorant aniònic lineal fort que inclou sis grups sulfonats, s'associa al llarg de les fibres de col·lagen catiònics.

Després de la incubació, es va eliminar el medi de cultiu i les cèl·lules es van esbandir dues vegades amb PBS 1X (Fisher Scientific, Illkirch, França). A continuació, es va afegir 1 ml de solució de Bouin Gigma-Aldrich, Saint Quentin Fallavier, França) a cada pou i les cèl·lules es van tacar durant 1 h a temperatura ambient. A continuació, les cèl·lules es van esbandir dues vegades amb aigua destil·lada i es van assecar sota la caputxa. Les cèl·lules es van tacar amb 1 ml de solució de Red Sirius (Sirius Red 80 en solució aquosa saturada d'àcid pícric, Sigma-Aldrich, Saint Quentin Fallavier, França) durant 1 h. Després de la tinció, es va eliminar la solució i es van esbandir les cèl·lules successivament amb aigua destil·lada i HC10.01N per eliminar el colorant no lligat. El colorant lligat es va solubilitzar amb NaOH0.1N durant 30 min. La solució de color es va transferir a una nova microplaca de 96-pou, i es va fer una lectura d'absorbància a 550 nm (Varioskan Lux, Thermo Fisher Scientific, Vantaa, Finlàndia). 4.8.Els ELISA de col·lagen de tipus I i MMP-1

Després de la incubació, les cèl·lules es van rentar dues vegades amb PBS 1X (Fisher Scientific, Illkirch, França). Els fibroblasts es van lisar en tampó RIPA (assaig de radioimmunoprecipitació) (Sigma-Aldrich, Saint Quentin Fallavier, França) complementat amb còctel inhibidor de la proteasa (Sigma-Aldrich, Saint Quentin Fallavier, França) a 4 graus durant 1 h. Les cèl·lules es van raspar i les mostres es van vortexar durant 30 min i es van centrifugar (12, 00 xg durant 30 min a 4 graus). Els sobrenedants que contenien proteïnes intracel·lulars es van recollir i després es van emmagatzemar a -80 grau fins a l'anàlisi per a la determinació de proteïnes i l'anàlisi de Western blot. La concentració de proteïnes es va determinar mitjançant l'assaig de proteïnes Pierce BCA (Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, EUA) utilitzant l'albúmina sèrica bovina (BSA) com a estàndard.

El sobrenedant de cultiu cel·lular es va recollir i es va centrifugar per eliminar les restes cel·lulars (200 × g durant 10 minuts a 4 graus) i es va emmagatzemar a -80 graus fins a l'anàlisi.

Les mesures de col·lagen tipus I i MMP-1 es van avaluar en medis de cultiu amb kits Abcam (ab210966 Human Pro-Collagen I alfa 1 SimpleStep ELISA Kit i ab215083 Human MMP1 SimpleStep ELISA Kit, Cambridge, MA, EUA) segons les instruccions del fabricant. . L'absorbància es va mesurar a 450 nm amb un lector de microplaques (Varioskan Lux, Thermo Fisher Scientific, Vantaa, Finlàndia). Els resultats es van normalitzar amb les concentracions de proteïnes cel·lulars determinades prèviament. 4.9.Western BlotL'extracció de mostres de proteïnes es va descriure a la secció anterior 4.8. Les mostres de proteïnes amb tampó Laemmli (Bio-Rad, Marnes-La-Coquette, França) es van bullir 5 min a 95 graus i després es van centrifugar a 16, 000 × g durant 1 min. Es van carregar quantitats iguals de proteïna (10 ug) en pous d'un 7,5 per cent o 4-15 per cent de gel TGX Stain-Free (Bio-Rad, Marnes-La-Coquette, França), juntament amb Precision Plus Protein "Unstained Protein". estàndard (Bio-Rad, Marnes-La-Coquette, França) El gel es va fer funcionar a 200 V durant 30 min (PowerPac" Basic amb Mini-PROTEAN Tetra System, Bio-Rad, Marnes-La-Coquette, França). La transferència de proteïnes del gel a una mini membrana de PVDF (fluorur de polivinilidè) (Bio-Rad, Marnes-La-Coquette, França) es va realitzar amb un sistema de transferència Trans-Blot Turbo (Bio-Rad, Marnes-La-Coquette, França). La membrana es va bloquejar amb un 3 per cent de BSA Gigma-Aldrich, Saint Quentin Fallavier, França) o un 5 per cent de llet seca sense greix en TBST (Bio-Rad, Marnes-La-Coquette, França) durant 1 h a temperatura ambient i rentat amb TBST. La membrana es va sondar amb col·lagen tipus I (Novotec, Reuver, Països Baixos), col·lagen tipus III (Novotec, Reuver, Països Baixos), MMP-1 (EnoGene, Nova York, NY, EUA) o TIMP{{43} }} anticossos (RayBiotech, Peachtree Corners, GA, EUA); després, es va rentar diverses vegades amb TBST i es va incubar durant 1 h a temperatura ambient amb anticossos secundaris conjugats amb peroxidasa (Jackson ImmunoResearch, Ely, Regne Unit). A continuació, es va obtenir un substrat ECL occidental clar (Bio-Rad, Marnes-La-Coquette, França). aplicat durant 5 min a les membranes i la revelació es va realitzar mitjançant ChemiDoc XRS més Molecular Imager (Bio-Rad, Marnes-La-Coquette, França). El nivell de proteïnes es va quantificar mitjançant el programari ImageLab v6.01.1.

4.10.Zimografia

Es va realitzar una zimografia per analitzar la forma activa de col·lagenasa MMP-1 segons Inanc et al. (2017) mètode adaptat [52].

Els gels SDS-PAGE (10 per cent de poliacrilamida, Bio-Rad, Marnes-La-Coquette, França) es van copolimeritzar amb 1 mg/mL de cua de rata de col·lagen tipus I Gibco, Fisher Scientific, Illkirch, França). Proteïna les mostres (5 ug) es van barrejar amb tampó de mostra no reductor (62,5 mM Tris HCl pH 6,8,20 per cent de glicerol, 4 per cent de SDS, 0,01 per cent de blau de bromofenol), es van centrifugar 1 min a 4 graus, carregat en pous. del gel, juntament amb Precision Plus Protein" All Blue Standards (Bio-Rad, Marnes-La-Coquette, França), i després es va electroforitzar a 110 V a 4 graus durant 2 h. El gel es va rentar dues vegades en un 2,5 per cent de Triton X{26 }} (v/v) durant 15 min cada cop per eliminar SDS. Després, el gel es va incubar en Zymogram Development Buffer (Bio-Rad, Marnes-La-Coquette, França) durant 48 h a 37 graus. Després de la incubació , el gel es va tacar durant 1 h amb una solució al 0,5 per cent de Coomassie Blue R-250 (Bio-Rad, Marnes-La-Coquette, França) (p/v) i després es va descolorir en un 40 per cent de metanol i un 10 per cent d'àcid acètic glacial solució (Sigma-Aldrich, Saint Quentin Fallavier, França). L'activitat MMP-1 es va detectar com una banda clara sobre un fons de gel tenyit de blau Coomassie. La quantificació es va realitzar amb ChemiDoc XRS plus Molecular Imager (Bio-Rad, Marnes-La-Coquette, França) amb el programari Image Lab versió 6.01.1 (Bio-Rad). 4.11.Aïllament de l'ARN i RT-PCR en temps real

Després de 48 h d'incubació, l'ARN total es va extreure amb TRIzol (Invitrogen, Carlsbad, CA, EUA) i cloroform (Acros Organics, Fisher Scientific, Illkirch, França), precipitat amb isopropanol (Fisher Scientific, Illkirch, França), rentat amb etanol 75 percentatge, assecat sota el capó abans de la resuspensió en aigua tractada amb DEPC (dietilpirocarbonat) (Fisher Scientific, IIlkirch, França). La quantitat i el nivell de puresa d'ARN (entre 1,8 i 2.0) es van estimar amb la mesura de l'absorbància en un lector de microplaques (Varioskan Lux, Thermo Fisher Scientific, Vantaa, Finlàndia) a 260 i 280 nm mitjançant Drop TM Plate (Thermo Fisher). Scientific, Waltham, MA, EUA).

Es va tractar un microgram d'ARN total amb DNaseI (iScript Dnase Master Mix, Bio-Rad, Marnes-La-Coquette, França) durant 5 minuts a 25 graus per eliminar els contaminants d'ADN. L'enzim es va inactivar durant 5 minuts a 75 graus.

La transcripció inversa es va realitzar en 1 ug d'ARN total, prèviament tractat amb DNasa I, mitjançant iScript Reverse Transcription (RT) Supermix (Bio-rad, Marnes-La-Coquette, França). Els passos seguits per a la síntesi d'ADNc van ser de 5 minuts a 25 graus. ,20 min a 46 graus, i 1 min a 95 graus.

Es van incloure controls de no plantilla als experiments de PCR. La qPCR es va realitzar en 96-plaques de pous per a un volum total de 20 μL que contenia 1 uL de 1∶15 mostres d'ADNc diluïdes de RT, 1 μL d'imprimació (vegeu la taula 4, Bio-Rad, Marnes). -La-Coquette, França), 10 μL d'iTaq Universal SYBR Green Supermix (Bio-Rad, Marnes-La-Coquette, França) i 8 μL d'aigua sense nucleases. Les condicions d'amplificació van ser de 2 minuts a 95 graus seguits de 40 cicles de 5 s a 95 graus i 30 s a 60 graus, i acaben amb 5 s a 95 graus i 5 s a 65 graus abans del protocol per a la corba de fusió: augment de 0,5 graus de 65 graus a 95 graus. Els experiments de PCR es van realitzar al sistema CFX 96 (Bio-Rad, Marnes-La-Coquette, França) i els resultats es van recollir del programari Bio-Rad CFX Manager v3.1 (Marnes-La-Coquette, França). Les quantitats d'ARNm es van normalitzar a l'ARNm de RPL13A i es va calcular l'anàlisi de l'expressió gènica relativa mitjançant el mètode 2-AACt.

4.12. Anàlisi estadística

Tots els valors es van expressar com la mitjana de n experiment ± error estàndard (SE).

Les anàlisis estadístiques es van realitzar mitjançant Addinsoft (2020). L'avaluació de la distribució normal de les dades es va avaluar mitjançant la prova de Shapiro-Wilk. Les diferències significatives entre mostres de control i experimentals es van analitzar mitjançant la prova t de Student (independent, de dues cares), quan es va produir una distribució normal, i per la prova de Mann-Whitney, quan es va rebutjar la distribució normal. Les diferències significatives en comparació amb el control segons la prova estadística s'indiquen amb asteriscs (*p<><0.01 and=""><0.001). differences="" that="" are="" not="" statistically="" significant="" are="" named="" "ns"="" in="" the="" text="" and="" are="" characterized="" by="" the="" absence="" of="" asterisks="" on="" the="">

5. Conclusions

Aquest treball demostra que les fraccions de poli i oligosacàrids, enriquides en ulvans, recuperades després de la nova tecnologia verda EAE de l'alga verda Uloa sp., influeixen en la proliferació de fibroblasts, la síntesi de proteïnes ECM, la renovació de la matriu i la remodelació. Podria sorgir una aplicació potencial en estratègies cosmètiques anti-envelliment, ja que l'envelliment de la pell es caracteritza per una disminució de la síntesi de col·lagen. Per tant, la renovació de la matriu de la pell és beneficiosa en aquest context. Així, ulvans, de Ulva sp. Les fraccions obtingudes després de l'EAE són biològicament actives sobre el metabolisme dels fibroblasts de la pell dèrmica humana. Els autors suggereixen que aquesta activitat és una funció de l'abundància d'ulvans, la composició de sulfats i el pes molecular de les fraccions. Els autors especulen que aquestes molècules riques en ramnosa sulfatades corresponen a molècules de senyalització, que són reconegudes pels llocs de lectina dels fibroblasts de membrana i, posteriorment, estimulen la seva activitat metabòlica tant des del punt de vista anabòlic com catabòlic. Tanmateix, calen més investigacions per avaluar profundament el mecanisme molecular activat pel poli i oligosacàrids Ulou sp. fraccions a nivell de factors de transcripció, la capacitat de penetració d'ulvans de pes molecular alt i baix en models de pell 3D o d'explant de pell ex vivo, i confirmen aquests resultats de la modulació ECM amb fraccions derivades d'Uloa EAE en aquests models per a un objectiu anti-envelliment.

Aquest article està extret de Mar. Drugs 2021, 19, 156. https://doi.org/10.3390/md19030156 https://www.mdpi.com/journal/marinedrugs