Propietats antitirosinases de diferents espècies de cúrcuma i aïllament de compostos actius de la cúrcuma amada

Jesmin Akter1 ● Md. Zahorul Islam1,2 ● Md. Amzad Hossain1 ● Kensaku Takara1

1 Facultat d'Agricultura, Universitat de Ryukyus, Okinawa, Japó

2 Departament de Farmacologia, Facultat de Ciències Veterinàries, Universitat Agrícola de Bangla Desh, Mymensingh, Bangla Desh

Per a més informació:Scotty.Wang@wecistanche.com

Resum

La cúrcuma s'utilitza tradicionalment com a cosmètica per a la pell en algunes ocasions religioses i culturals al subcontinent indi. En aquest estudi, hem comparat les propietats inhibidores de la tirosinasa de quatre Curcuma spp., és a dir, C. xanthorrhiza, C. aromatic, C. amada i C. zedoaria. Aïllament i purificació guiats per bioassaig d'inhibidors de tirosinasa mitjançant columna de gel de sílice i cromatografia líquida d'alt rendiment. La identificació estructural dels compostos es va realitzar mitjançant 1H RMN, 13C

RMN i cromatografia líquida-espectrometria de masses en tàndem. C. amada va mostrar la major activitat inhibidora de la tirosinasa, amb una IC50 de 53,4 ug/mL. Per tant, es va triar per a l'aïllament i la purificació d'inhibidors de la tirosinasa. Els compostos purificats eren zederona (1), furanodienona (2), 1,5-epoxi-3-hidroxi{-1-(3,4-dihidroxi-5-metoxifenil){ {13}}(4-hidroxifenil) heptans (3),5-dihidroxi-1-(3,{4-dihidroxifenil)-7-({{22 }}hidroxi-3-metoxifenil) heptans (4) i 1,5- epoxi 3-hidroxi{-1-(3,4-dihidroxi-5-metoxifenil) -7-({4-hidroxi-3-metoxifenil) heptans (5). Els valors IC50 per al boletanti-tirosinasaL'activitat dels compostos 1, 2, 3, 4 i 5 va ser de 108,2, 89,2, 92,3, 21,7 i 41,3 µM, respectivament. Aquests compostos també van inhibir l'activitat intracel·lular de la tirosinasa, reduint així la síntesi de melanina a les cèl·lules de melanoma B16F10. El compost 4 va mostrar significativament més fortanti-tirosinasaactivitat que la de l'arbutina (un fàrmac de control positiu). No es va observar cap diferència significativa en l'efecte inhibidor de la tirosinasa entre el compost 5 i l'arbutina. Les nostres troballes suggereixen fermament que C. Amanda és una font prometedora d'inhibidors naturals de la tirosinasa per prevenir la melanogènesi i que es podria utilitzar com a cosmètic blanquejador.

Paraula clau: Curcuma amada ● Compostos actius ● RMN ● Antitirosinasa ● Antimelanogènic

Cllepar a Cistanche per a anti-tirosinasa

Introducció

La melanina és el pigment negre del cabell i la pell i és essencial per protegir la pell de la radiació UV. El pigment és produït per cèl·lules melanòcites, presents a la capa basal de la dermis mitjançant un procés fisiològic anomenat melanogènesi. Tanmateix, la producció anormal de melanina provoca trastorns dermatològics com ara pigues, melasma, lentigins, taques de l'edat, efèlids i hiperpigmentació postinflamatòria [1]. A la indústria alimentària, la hiperpigmentació de fruites i verdures provoca pèrdues significatives de qualitat nutricional i valor de mercat [2]. La melanogènesi es pot controlar mitjançant la inhibició de l'activitat de la tirosinasa, un enzim que limita la velocitat per a la síntesi de melanina en mamífers, plantes, microorganismes i fongs [3]. Per tant, la inhibició de l'activitat de la tirosinasa prevé la hiperpigmentació i condueix al blanquejament de la pell. També controla la qualitat de verdures i fruites regulant l'enrossament no desitjat de verdures i aliments. La majoria d'agents per aclarir la pell, com la hidroquinona, l'àcid azelaic, l'àcid cògic i l'arbutina són potents inhibidors de la tirosinasa. No obstant això, tenen diversos efectes indesitjables com ara citotoxicitat, ocronosi, vitiligen, irritació, descamació de la pell i enrogiment [4]. A més, l'àcid cògic i l'arbutina demostren una mala estabilitat de la formulació i una capacitat de penetració a la pell i una baixa eficàcia in vivo [5]. Algunes sals de mercuri orgàniques i inorgàniques tenen efectes anti-melanogènics i s'utilitzen en agents per blanquejar la pell. No obstant això, mitjançant l'absorció cutània, els compostos mercurials poden causar efectes tòxics com la decoloració de la pell, danys renals, reaccions al·lèrgiques i cicatrius [6]. Per tant, es necessita la investigació d'inhibidors de la tirosinasa menys tòxics i més efectius. La cúrcuma (família: Zingiberaceae; gènere: Curcuma), una planta medicinal tradicional que creix predominantment a les regions tropicals i subtropicals d'Àsia i Àfrica, té un ampli espectre de funcions farmacològiques. S'ha utilitzat tradicionalment en rituals prematrimonials durant milers d'anys al subcontinent indi com a agent per il·luminar la pell. Es creu que la cúrcuma millora la pell de la pell reduint el creixement del pèl facial, l'acne i l'envelliment de la pell [7, 8]. Per tant, els productes per a la cura de la pell complementats amb cúrcuma estan disponibles comercialment al mercat [9]. S'han identificat més de 70 espècies/varietats de cúrcuma amb diferents propietats químiques i farmacològiques. No obstant això, hi ha una manca d'informació científica sobre les propietats anti-melanogèniques de diferents espècies de cúrcuma i els possibles components actius presents a la cúrcuma. Els curcuminoides són els principals compostos actius responsables de la majoria de les activitats biològiques de la cúrcuma. Els curcuminoides tenen potencial en cosmecèutics com aantioxidant, antiinflamatori,i agent per aclarir la pell [7, 8]. Tanmateix, en un estudi anterior, vam trobar variacions significatives en el contingut de curcuminoides a la cúrcuma i algunes espècies (C. amada, C. zedoaria) ni tan sols contenien curcumina [10]. També vam informar de l'antifúngic,antioxidanti activitats vasodilatadores de diferents espècies i varietats de cúrcuma [10–13]. Per tant, aquest estudi pretenia avaluar els efectes de diferents espècies de cúrcuma, concretament, C. xanthorrhiza, C. aromatica, C. amada i C. zedoaria, sobre l'enzim tirosinasa i identificar els compostos químics específics responsables de laanti-tirosinasaactivitat. També es va avaluar l'activitat inhibidora de la tirosinasa i els efectes anti-melanogènics dels compostos actius purificats sobre la síntesi de melanina en cèl·lules de melanoma B16F10.

Resultats i discussió

Entre les quatre espècies de cúrcuma diferents, l'extracte de MeOH de C. amada va mostrar el màxim efecte inhibidor de la tirosinasa de bolets amb un valor IC50 de 53, 4 ± 2, 7, seguit de C. xanthorrhiza, C. aromatic i C. zedoaria (Fig. 1a). La curcumina és el principal component actiu de la cúrcuma (Curcuma longa) i té una àmplia gamma d'activitats biològiques, incloses activitats anticancerígenes, antiinflamatòries, antibacterianes, antifúngiques i antioxidants. Va mostrar una activitat anti-tirosinasa 75- vegades més potent que l'arbutina i l'àcid cògic [14]. Tanmateix, en un estudi anterior, vam informar que hi havia variacions significatives en el contingut de curcumina en diferents espècies de cúrcuma [10].

La curcumina estava present a C. xanthorrhiza i C. aromàtica però absent a C. zedoaria i C. amada [10]. Les troballes interessants d'aquest estudi són que, sense curcumina, C. amada va mostrar una forta activitat inhibidora de la tirosinasa. Aquest resultat indica que hi ha d'haver alguns compostos actius de C. amada atribuïts al seu fort efecte anti-tirosinasa. L'activitat anti-tirosinasa de C. xanthorrhiza i C. aromatica podria ser deguda al seu contingut de curcumina. No obstant això, no vam poder descartar la possibilitat de la presència d'altres compostos. L'extracte de MeOH de C. amada es va fraccionar amb aigua, n-hexà i EtOAc. Entre aquestes tres fraccions, EtOAc va mostrar un efecte inhibidor significativament més fort que l'aigua i n-hexà (Fig. 1b). Per tant, es va prendre la part EtOAc per a un fraccionament posterior. Les activitats anti-tirosinasa de sis fraccions [n-hexà:EtOAc; 100:0 (F1), 80:20 (F2), 60:40 (F3), 40:60 (F4), 20:80 (F5) i 0:100 (F6)] de la part EtOAc de C. amada es van comparar. Entre aquestes sis fraccions, F6 i F3 van mostrar una activitat anti-tirosinasa significativament més alta que les altres (Fig. 1c). A continuació, es van identificar les estructures químiques dels cinc compostos de les fraccions F3 i F6 segons els seus espectres de RMN 1H i RMN 13C. Les dades màximes van ser les següents:

Compost 1:

Cristall incolor en forma d'agulla; UV λmax: nm 234, 285. ESI-MS ( més ) m/z: 247,3 [M més H] més , 229,4 [ M més H-H2O] més . 1H-RMN (CD3OD): δ 7,22 (1H, s, H-12), 5,59 (1H, br d, J=12 Hz, H{{2{0}}) , 3,99 (1H, s, H-5), 3,85 (1H, d, J=16 Hz, H{-9a), 3,69 (1H, d, J=16 Hz, H-9b), 2,57 (1H, dddd, J=13, 13, 12, 4 Hz, H{-2a), 2,26 (1H, m, H{{46 }}a), 2,20 (1H, m, H{{5{0}}b), 2,09 (3H, s, H{-13), 1,57 (3H, s, H-15), 1,32 (1H, ddd, J=13, 13, 4 Hz, H{-3b), 1,28 (3H, s, H{-14). 13C-RMN (CD3OD): δ 194,2 (C-6) 160,2 (C{-8), 139,7 (C12), 132,8 (C{-1), 132,0 (C{-10 ), 124,3 (C{-11), 123,0 (C{-7), 67,8 (C{-5), 65,2 (C{-4), 42,5 (C{-9 ), 39,0 (C{-3), 25,4 (C{-2), 15,7 (C{-15), 15,4 (C{-14), 10,7 (C{-13 ) (Dades complementàries). A partir de la comparació d'aquestes dades amb les informades a la literatura [15, 16], la substància es va identificar com a zederone (Fig. 2). És un sesquiterpè, anteriorment es va aïllar de C. amada i C. zedoaria i s'ha informat pels seus efectes analgèsics, antiinflamatoris, antifúngics i citotòxics [12, 17–20].

Compost 2:

oli incolor; UV λmax: nm 243, 280. ESIMS ( més ) m/z: 231.0 [M més H] més , 223,3 [M més H-H2O] més . 1H-RMN (CD3OD): δ 7,16 (1H, s, H-12), 5,83 (1H, s, H{-5), 5,21 (1H, dd, J=12 Hz , 5 Hz, H-1), 3,73 (1H, d, J=16 Hz, H{-9a), 3,63 (1H, d, J=16 Hz, H -9b), 2,45 (1H, ddd, J=15 Hz, 11 Hz, 4 Hz, H{-3a), 2,31 (1H, m, H{-2a) ), 2,20 (1H, dddd, J=12 Hz, 12 Hz, 12 Hz, 4 Hz, H{-2b), 2,06 (3H, s, H{{57} }), 1,92 (3H, s, H-14), 1,89 (1H, m, H{-3b), 1,25 (3H, s, H{-15). 13C-RMN (CD3OD): δ 191,8 (C-6), 158,6 (C{-8), 147,6 (C{-4), 140,0 (C{-12), 136,1 ( C-10), 133,3 (C{-5), 132,0 (C{-1), 124,6 (C{-11), 123,1 (C{-7), 42,4 ( C-9), 41,4 (C{-3), 27,3 (C{-2), 19,3 (C{-14), 15,9 (C{-2), 9,9 ( C-13) (dades complementàries). A partir de la comparació d'aquestes dades amb les informades a la literatura [21], la substància es va identificar com a furanodienona (Fig. 2). Es va aïllar de Lindera pulcherrima (Nees.) Benth. ex ganxo. f [22], Curcuma zedoaria [19], Curcuma amada [12] i Curcuma wenyujin [23]. És un furanosesquiterpenoide que presenta activitats antifúngiques [12], antiinflamatòries [19], anticancerígenes [24], antibacterianes i antioxidants [22].

Compost 3:

oli groguenc; UV λ màx: nm 275. ESIMS ( més ) m/z: 383,3 [M més Na] més , 361,3 [M més H] més , 343,2 [M més H-H2O] més . 1H-RMN (CD3OD): δ 6,99 (2H, dd, J=9, 2 Hz, H{-2´´, -6´´), 6,67 (2H, d, J=9 Hz, H-3´´, -5´´), 6,52 (2H, s, H-2´, -6´), 4,63 (1H , br b, J=12 Hz, H{-1), 4,21 (1H, m, H{-3), 3,89 (1H, m, H{-5), 3,85 ( 3H, s, 5´-OCH3), 2,63 (2H, m, H-7), 1,82 (1H, m, H{-2a), 1,78 (1H, m, H{{6{{ {107}}}}a), 1,73 (1H, m, H-2b), 1,69 (1H, m, H{-4a), 1,68 (1H, m, H{{72} }b), 1,53 (1H, m, H-4b). 13C-RMN (CD3OD): δ 156,3 (C-4´´), 149,5 (C{-5´), 146,4 (C{-3´), 134,5 (C{-4 ´), 134,44 (C{-1´), 134,41 (C{-1´´), 130,4 (C{-2´´, {-6´´), 116,1 (C{-2´´ {104}}´´, -5´´), 108,0 (C{-2´), 102,8 (C{{-6´), 75,2 (C{-1), 72,6 ( C-5), 65,6 (C3), 56,6 (5´-OCH3), 41,1 (C{-2), 39,5 (C{-4), 39,2 (C{-6) 31.8 (C-7) (dades complementàries). A partir de la comparació d'aquestes dades amb les informades a la literatura [25], la substància es va identificar com 1,5-epoxi-3-hidroxi-1-(3,4-dihidroxi{ {145}} metoxifenil)-7-(4-hidroxifenil) heptans (Fig. 2). Es va aïllar dels rizomes de Zingiber officinale i es van estudiar les seves propietats antioxidants [25].

Compost 4:

Xarop viscós; UV λ màx: nm 281. ESIMS ( més ) m/z: 385,3 [M més Na] més , 363,3 [M més H] més , 345,2 [M més H-H2O] més . 1H-RMN (CD3OD): δ 6,75 (1H, d, J=2 Hz, H{-2´), 6,68 (1H, d, J=8 Hz, H{{21 }}´), 6,64 (1H, J=8 Hz, H{-5´´), 6,61 (1H, J=2 Hz, H{-2´´), 6,60 (1H, dd, J=8, 2 Hz, H-6´), 6,49 (1H, dd, J=8, 2 Hz, H{-6´´), 3,80 (3H, s, 3´-OCH3), 3,73 (2H, m, H-3, -5), 2,64-2,47 (4H, m, H{{59) }}a, -1b, -7a, -7b), 1.71-1,65 (4H, m, H-2a, {{ 68}}b, -6a, -6b), 1,61 (2H, m, H-4a, -4b). 13C-RMN (CD3OD): δ 148,8 (C-3'), 146,1 (C{{-3''), 145,4 (C{-4'), 144,2 (C{-4 ´´), 135,24 (C-1´ o C-1´´), 135,22 (C{-1´ o C{-1´´), 121,8 (C{{101 }}´), 120,6 (C{-6´´), 116,5 (C{{-2´´), 116,3 (C{{{-5´´), 116,1 (C{{-5´´) ), 113,2 (C{-2´), 70,94 (C{-3 o C{-5), 70,92 (C{-3 o C{-5), 56,4 (3 ´-OCH3), 44,9 (C{-4), 40,8 (C{-2, -6), 32,3 (C{-1), 32,1 (C{-7) (Dades complementàries). A partir de la comparació d'aquestes dades amb les informades a la literatura [26, 27], la substància es va identificar com a oli 3,5-dihidroxi-1-(3,4-dihidroxifenil){{150 }} (4-hidroxi-3-metoxifenil) heptans (Fig. 2). Es va aïllar dels rizomes de Tacca chantrieri [26] i Curcumalonga L. [27]. Són diarilheptanoides que presenten activitats citotòxiques [26] i antitumorals [27].

Compost 5:

oli incolor; UV λ màx nm: 279. ESI-MS ( més ) m/z: 413,3 [M més Na] més , 391,3 [M més H] més , 373,3 [M més HH2O] més . 1H-RMN (CD3OD): δ 6,76 (1H, s, H-2´´), 6,67 (1H, d, J=8 Hz, H{{20}} ´´), 6,21 (1H, dd, J=8, 2 Hz, H{-6´), 6,53 (2H, s, H{-2´, -6´´ ), 4,63 (1H, br d, J=12 Hz, H{-1), 4,21 (1H, m, H{-3), 3,83 (3H, s, 5´-OCH3) , 3,78 (3H, s, 3-OCH3), 2,65 (2H, m, H{-7), 1,84 (1H, m, H{-2a), 1,79 (1H, m, H-6a), 1,74 (1H, m, H{-2b), 1,69 (1H, m, H{-4a), 1,68 (1H, m, H{{ 75}}b), 1,53 (1H, m, H-4b). 13C-RMN (CD3OD): δ 149,5 (C-5'), 148,8 (C{{-3''), 146,4 (C{-3'), 145,4 (C{-4 ´´), 135,3 (C{-1´), 135,2 (C{{-1´´), 134,4 (C{{-4´), 121,9 (C{{{-6´´), 116,1 (C{-5´´), 113,4 (C{{-2´´), 108,0 (C{{-2´), 102,7 (C{{-6'), 75,2 (C{-2´') {121}}), 72,5 (C{-5), 65,6 (C{-3), 56,6 (5´-OCH3), 56,3 (3´´-OCH3), 41,2 (C{{140} }), 39,4 (C{-4), 39,3 (C{-6), 32,2 (C{-7) (dades suplementàries). A partir de la comparació d'aquestes dades amb les informades a la literatura [20], la substància es va identificar com 1,5-epoxi-3-hidroxi-1-(3,4-dihidroxi{ {157}}metoxifenil)- 7-(4-hidroxi-3-metoxifenil) heptans (Fig. 2) i no hi ha informació sobre la seva activitat biològica. Vam aïllar els compostos 3, 4 i 5 per primera vegada de C. amada. Tots els compostos van mostrar activitat inhibidora contra la tirosinasa de bolets

Cinc compostos, a saber, zederona, furanodienona, 1,5-epoxi-3-hidroxi-1-(3,{4-dihidroxi-5-metoxifenil)- 7-( 4-hidroxifenil) heptans, 3,5-dihidroxi-1-(3,4-hidroxifenil){-7-({4-hidroxi{-3- metoxifenil) heptans i 1,5-epoxi-3-hidroxi{-1-(3,{4-dihidroxi-5-metoxifenil){- 7-(4- els hidroxi-3-metoxifenil) heptans, es van aïllar de les fraccions F3 i F6. Els compostos aïllats van mostrar activitat anti-tirosinasa de manera dependent de la concentració. Entre els cinc compostos, el compost 4 va mostrar una activitat anti-tirosinasa significativament més forta que l'arbutina. No hi va haver diferències significatives en els efectes anti-tirosinasa entre el compost 5 i l'arbutina (Fig. 3). Els efectes del compost aïllat sobre la viabilitat cel·lular es van estudiar en cèl·lules de melanoma murí B16F10. Les cèl·lules es van tractar amb concentracions de 50, 100, 200 i 400 μM del compost durant 48 h. Els compostos aïllats no van mostrar efectes citotòxics fins a 200 μM, tanmateix, al voltant del cinquanta per cent de les morts cel·lulars es van observar en tots els casos a una concentració de 400 μM (Fig. 4). Així, es van utilitzar concentracions de fins a 200 μM per avaluar els seus efectes antitirosinasa intracel·lular i anti-melanogènics.

Per determinar les activitats anti-melanogèniques i anti-tirosinasa dels compostos aïllats, es van avaluar els seus efectes sobre el contingut de melanina i l'activitat de la tirosinasa en cèl·lules de melanoma B16F10. Tal com es mostra a la taula 1, els nostres compostos aïllats van inhibir en funció de la dosi el contingut intracel·lular de melanina i l'activitat de la tirosinasa. El compost 4 era significativament més fort que el fàrmac de control positiu arbutina tant en els efectes inhibidors de la melanina com de la tirosinasa. No es va observar cap diferència significativa entre el compost 5 i l'arbutina. Com que la tirosinasa cel·lular millora la producció de melanina, la reducció de l'activitat de la tirosinasa és una estratègia eficient per al desenvolupament d'agents anti-melanogènics. Per a això, es van avaluar les propietats inhibidores de l'activitat de la tirosinasa intracel·lular i la melanogènesi en cèl·lules de melanoma B16F10. De manera similar a les troballes de l'activitat inhibidora de la tirosinasa dels bolets, els compostos aïllats inhibeixen l'activitat de la tirosinasa intracel·lular i la melanogènesi de manera dependent de la dosi. Els efectes anti-tirosinasa dels compostos aïllats van donar lloc a les seves propietats anti-melanogèniques. L'ordre de l'activitat anti-tirosinasa i anti-melanogènica d'aquests compostos era el compost 4 > arbutina > 5 > 2 > 3 > 1. El valor IC50 calculat del compost 4 era significativament inferior al de l'arbutina. L'eficàcia del compost 4 va ser d'1.9- a 5- vegades més gran que la dels altres quatre compostos. El compost 5 també va mostrar una forta activitat anti-tirosinasa que era comparable a la de l'arbutina. Els nostres resultats van indicar que els compostos 4 i 5 es podrien utilitzar com a possibles inhibidors naturals de la tirosinasa i cosmètics per blanquejar la pell. S'ha proposat que l'estrès oxidatiu estigui implicat en el mecanisme subjacent de la sobreproducció de melanina [28]. Per tant, el paper antioxidant s'ha investigat en una àmplia gamma de trastorns de la pell, incloent la fotocarcinogènesi o el melanoma [9]. Nosaltres i altres vam informar anteriorment de les propietats antioxidants de C. amada [13, 29] que podrien ser responsables dels efectes antimelanogènics dels compostos aïllats. En aquest estudi, es van detectar efectes inhibidors dels compostos aïllats sobre la síntesi intracel·lular de melanina i l'activitat de la tirosinasa induïda per -MSH. Així, els nostres compostos aïllats es poden utilitzar com a agents en cosmètica funcional per desenvolupar tractaments efectius per blanquejar la pell.

Conclusió

Suggerim fermament que C. amada pot tenir un paper important com a inhibidor eficaç de la tirosinasa. C. amada i els seus compostos bioactius es podrien utilitzar a la indústria cosmètica com a agents blanquejants naturals, la indústria alimentària com a agents antimarronament i l'àmbit mèdic per al tractament de la hiperpigmentació. No obstant això, es necessiten més estudis per investigar els efectes anti-melanogènics dels compostos aïllats en models animals.

Materials i mètodes

Productes químics

La tirosinasa de bolets i l'arbutina es van comprar a Sigma–Aldrich Chemical Co. (St. Louis, MO, EUA). La L-tirosina era de Wako pure chemical industries Ltd. (Osaka, Japó). Es van comprar metanol (MeOH), acetat d'etil (EtOAc) i n-hexà a Nacalai Tesque (Kyoto, Japó). Es van comprar gel de sílice (63–200 μm, Kanto Chemical Co. Tokyo, Japó) i MeOH-d4 (CD3OD, Merck KGaA, Alemanya).

Preparació del material vegetal Quatre espècies diferents de cúrcuma, a saber C. xanthorrhiza, C. aromatica, C. amada i C. zedoaria es van conrear en un camp de sòl gris (sorra gruixuda 3,6 per cent, sorra fina 30,9 per cent). , llim 24,3 per cent, argila 32,8 per cent, pH 7,4, NO{{10}}N 0,07 per cent, NH{4-N 0,08 per cent, P 4,6 ng/g, K 42,9 ng/g) a el Subtropical Field Science Center, Universitat de Ryukyus, Okinawa, Japó. La temperatura mitjana mensual, la humitat i la precipitació durant el període de cultiu van ser de 17-29 graus, 61-83 per cent i 22-369 mm, respectivament. Es van oferir pràctiques agronòmiques comunes, com ara adob i reg. Els rizomes es van collir quan tots els brots de l'espècie es van marcir completament. Els rizomes es van rentar, es van tallar i es van assecar en un forn d'aire calent a 50 graus durant 72 h.

Extracció de mostres

Les extraccions es van dur a terme mitjançant la dissolució de diferents pols de cúrcuma (300 g) en MeOH (3 L) a temperatura ambient (25 graus) i pressió atmosfèrica i es van mantenir durant dos dies amb agitació magnètica contínua per evitar l'oxidació per l'aire i la protecció de la llum solar. Els compostos solubles en dissolvents es van filtrar amb paper de filtre (núm. 2, Advantec, Tokyo Roshi Kaisha Ltd., Tòquio, Japó). Es van afegir dissolvents frescos (MeOH) al material vegetal utilitzat i el procés es va repetir tres vegades. Les solucions filtrades que contenien compostos vegetals es van assecar mitjançant un evaporador rotatiu a pressió reduïda a 40 graus. El rendiment de tots els extractes es va mantenir a la nevera a 4 graus per a anàlisis experimentals.

Assaig d'inhibició de la tirosinasa

L'activitat d'inhibició de la tirosinasa es va determinar segons el mètode anterior [30], mesurant la concentració de crom DOPA produïda per l'acció de l'enzim tirosinasa sobre el substrat de la tirosina. Breument, la mostra de prova es va dissoldre en un 80 per cent de MeOH per obtenir diferents concentracions (25, 50 i 100 µg/mL). La placa de 96-pou es va configurar en l'ordre següent: 120 μL de tampó de fosfat (20 mM, pH 6,8), 20 μL de la mostra i 20 μL de tirosinasa de bolets (500 U/mL en 20 mM de fosfat buffer). Després de la incubació durant 15 min a 25 graus, la reacció es va iniciar afegint 20 μL de solució de L-tirosina 0,85 mM i després es va incubar durant 10 min a 25 graus. L'activitat de la tirosinasa es va determinar mesurant l'absorbància a 470 nm mitjançant un lector de microplaques (espectrofotòmetre Biotek Powerwave XS2). L'arbutina es va utilitzar com a control positiu, mentre que el 80 per cent de MeOH es va utilitzar com a control negatiu. El percentatge d'inhibició de la tirosinasa es va calcular de la següent manera:

on C és l'absorbància del control negatiu, B és l'absorbància del blanc i S és l'absorbància de la mostra de prova.

Aïllament de compostos bioactius de l'extracte brut de Curcuma amada

Tenint en compte els resultats dels quatre extractes de cúrcuma, C. amada va mostrar una activitat anti-tirosinasa significativament més alta que els altres. Per tant, es va realitzar una purificació guiada per bioassaig de compostos actius a partir de l'extracte brut de C. amada. Per identificar els compostos anti-tirosinasa, es va realitzar el fraccionament de l'extracte brut de C. amada tal com es descriu a la figura 5. L'extracte brut es va diluir amb aigua destil·lada i després es va extreure amb n-hexà, seguit d'EtOAc. A continuació, es van barrejar volums iguals de cada dissolvent i solució d'extracte brut agitant-se durant 3 min en un embut de separació. Totes les fraccions es van concentrar fins a sequedat mitjançant un evaporador rotatiu a 40 graus. Les activitats anti-tirosinasa d'aquestes tres fraccions es van determinar segons el procediment anterior. Com que la fracció EtOAc mostrava la més alta activitat anti-tirosinasa, es va seleccionar per a l'aïllament i purificació del compost bioactiu. La fracció EtOAc activa es va evaporar fins a sequedat i es va sotmetre a cromatografia en una columna de gel de sílice (75 g) (30 × 3 cm). L'elució es va dur a terme amb n-hexà i EtOAc amb quantitats creixents d'EtOAc [100:0 (F1), 80:20 (F2), 60:40 (F3), 40:60 (F4), 20:80 (F5) , i 0:100 (F6)]. L'activitat anti-tirosinasa d'aquestes sis fraccions es va dur a terme segons el procediment anterior, i la majoria de les activitats es van trobar a F3 i F6. Les fraccions F3 i F6 es van purificar mitjançant HPLC de fase inversa C18 (COSMOSIL 5C18-AR-II; Nacalai Tesque, Inc., Kyoto, Japó) equipat amb aigua i acetonitril com a fase mòbil amb un cabal de 2,5 ml. min-1, detectat a 280 nm.

Tres pics de F3 van eluir a 9,55, 13,66 i 16,47 min, i quatre pics de F6 van eluir a 11,56, 12,20, 12,75 i 15.03 min com a substàncies blanques incolores, de les quals inhibidores es va detectar l'activitat en cinc fraccions màximes eluïdes a 9, 55 i 16, 47 min de F3 i 11, 56, 12, 75 i 15. 0 3 min (dades suplementàries) de F6 (figura 5). Els compostos aïllats (~ 10 mg) es van dissoldre en MeOH-d4 i després es van sotmetre a anàlisi espectral. Els espectres de ressonància magnètica nuclear (RMN) es van registrar en espectròmetres BRUKER RMN (500 MHz per 1 H i 125 MHz per 13 C) a temperatura ambient. Els canvis químics (δ) es van registrar com a parts per milió (ppm) en relació amb el tetrametilsilà (TMS) com a estàndard intern. Els experiments d'espectrometria de masses es van dur a terme en un espectròmetre de masses Waters utilitzant una sonda d'ionització per electrospray (ESI - MS) en les següents condicions instrumentals: Columna: COSMOSIL 5C18-AR-II, (2 × 150) mm. Dissolvent A: aigua (0,1 per cent d'àcid fòrmic), dissolvent B: acetonitril, cabal: 4 ml/min, volum d'injecció: 100 µl, temps d'execució: 35 min, programa de temps per a F3: 75 per cent B (0 min) → 75 per cent B (20 min) → 100 per cent B (20,1 min) → 100 per cent B (27 min) → 75 per cent B (27,1 min) → 75 per cent B (35 min). Programa de temps per a F6: 45 per cent B (0 min) → 45 per cent B (14 min) → 100 per cent B (14,1 min) → 100 per cent B (20 min) → 45 per cent B (20,1 min) → 45 per cent B (25 min). Mode de bomba: gradient binari. Detalls del forn: CTO-20AC, temperatura 40 graus. Mode d'ionització MS: ES (plus), tensió capil·lar: 4,0 kV, tensió del con: 20 V, temperatura de la font: 120 graus, temperatura de desolvació: 350 graus, cabal de gas del con: 100 L/h, flux de gas de desolvació: 800 L /h (Dades complementàries).

Activitat antitirosinasa dels compostos aïllats

Els compostos aïllats es van dissoldre en MeOH a concentracions de 5, 10, 30, 50, 100 i 200 μM per a cada compost. L'activitat anti-tirosinasa es va determinar mitjançant el procediment descrit anteriorment.

Inhibició intracel·lular de la tirosinasa i la melanogènesi pels compostos aïllats

Cultiu cel·lular

Les cèl·lules de melanoma B16F10 es van cultivar en el medi d'àguila modificat de Dulbecco (DMEM) complementat amb un 10% de sèrum fetal boví (FBS) inactivat per calor i un 1% de penicil·lina (10,000 U/mL)/estreptomicina (100 ug/mL) a 37 graus en una atmosfera humidificada que conté un 5 per cent de CO2.

Viabilitat cel·lular

Les cèl·lules B16F10 es van xapar a una densitat de 5 × 104 cèl·lules/pou en una placa 96-pou. Després de 24 h, les cèl·lules es van exposar a diverses concentracions del compost aïllat i es van incubar durant 48 h addicionals a 37 graus. Després de la incubació, es va determinar la viabilitat cel·lular mitjançant l'assaig MTS. Es van afegir vint microlitres de solució MTS i es van incubar durant 60 min. Després de la incubació, es va determinar l'absorbància de les cèl·lules a 490 nm mitjançant un lector de microplaques (Benchmark Plus).

Activitats anti-tirosinasa i anti-melanogènica dels compostos aïllats

La determinació del contingut de melanina cel·lular i els assajos d'activitat de la tirosinasa es van dur a terme tal com es va descriure anteriorment [31], amb lleugeres modificacions. Les cèl·lules de melanoma B16F10 es van xapar a una densitat de 5 × 104 cèl·lules/pou en una placa 96-pou. Després de 24 h, les cèl·lules es van exposar a diverses concentracions del compost aïllat o arbutina. Després d'1 h, es va afegir 100 nM d'hormona estimulant de melanòcits (-MSH) i les cèl·lules es van incubar durant 48 h addicionals a 37 graus. Per a l'estudi de l'activitat anti-tirosinasa, les cèl·lules es van rentar amb tampó de fosfat fred amb gel i es van lisar amb tampó de fosfat (pH 6, 8) que contenia 1 per cent de Triton-X (90 μL/pou). Les plaques es van congelar a -80 graus durant 30 minuts. Després de descongelar i barrejar, es van afegir 10 μL d'1 per cent de L-DOPA a cada pou. Després de la incubació a 37 graus durant 2 h, es va mesurar l'absorbància a 490 nm. Per a l'assaig de contingut de melanina, les cèl·lules es van rentar dues vegades amb tampó fosfat i després es van dissoldre en 100 μL de NaOH (1 N) que contenia un 10 per cent de DMSO. Les mostres es van incubar a 80 graus durant 1 h i es van barrejar per solubilitzar la melanina. La densitat òptica de l'homogeneïtat barrejat es va mesurar a 490 nm.

Anàlisi estadística

Els resultats s'expressen com a mitjana ± SEM. Les diferències estadístiques entre les dues mitjanes es van avaluar mitjançant la prova t de Student. Es van realitzar múltiples comparacions mitjançant una anàlisi de variància unidireccional seguida de la prova de Bonferroni. Les diferències es van considerar significatives a P <>

Aquest és el nostre producte antifatiga! Feu clic a la imatge per a més informació!

Referències

1. Solano F, Briganti S, Picardo M, Ghanem GH. Agents hipopigmentats: una revisió actualitzada sobre aspectes biològics, químics i clínics. Pigment Cell Res. 2006;19:550–71.

2. Loizzo MR, Tundis R, Menichini F. Inhibidors de la tirosinasa naturals i sintètics com a agents antimarronament: una actualització. Compr Rev Food Sci Food Saf. 2012;11:378–98.

3. Lin YS, Chen HJ, Huang JP, Lee PC, Tsai CR, Hsu TF, et al. Cinètica de l'activitat inhibidora de la tirosinasa utilitzant extractes de fulles de vinífera de Viti. Biomed Res Int. 2017: 5232680.

4. Manini P, Napolitano A, Westerhof W, Riley PA, d' Ischia M. Una orto-quinona reactiva generada per l'oxidació catalitzada per tirosinasa de l'agent despigmentant de la pell monobenzone: reaccions d'autoacoblament i conjugació de tiol i possibles implicacions per als melanòcits toxicitat. Chem Res Toxicol. 2009;13:1398–405.

5. Couteau C, Coiffard L. Overview of skin whitening agents: drugs and cosmetic products. Cosmètics. 2016;3:27.

6. Al-Saleh I, Shinwari N, El-Doush I, Billedo G, Al-Amodi M, Khogali F. Comparació dels nivells de mercuri en diversos teixits de ratolins albins i pigmentats tractats amb dues marques diferents de cremes per aclarir la pell de mercuri. Biometalls: Int J rol Met ions Biol, Biochem, Med. 2004;17:167–75.

7. Gopinath H, Karthikeyan K. La cúrcuma: un condiment, cosmètica i cura. Indian J Dermatol Venereol Leprol. 2018;84:16–21.

8. Vaughn AR, Branum A, Sivamani RK. Efectes de la cúrcuma (Curcuma longa) sobre la salut de la pell: una revisió sistemàtica de l'evidència clínica. Phytother Res. 2016;30:1243–64.

9. Baliga MS, Katiyar SK. Quimioprevenció de la fotocarcinogènesi mitjançant botànics dietètics seleccionats. Photochem Photobio Sci. 2006;5:243–53.

10. Akter J, Hossain MA, Sano A, Takara K, Islam MZ, Hou DX. Activitat antifúngica de diverses espècies i soques de cúrcuma (Curcuma spp.) contra Fusarium Solani Sensu Lato. Pharm Chem J. 2018;52:292–7.

11. Akter J, Islam MZ, Hossain MA, Kawabata S, Takara K, Nguyen H, et al. Relaxació independent de l'endoteli i dels canals de calci de l'artèria cerebral porcina per diferents espècies i soques de cúrcuma. J Tradit Complement Med. 2018;9:297–303.

12. Akter J, Takara K, Islam MZ, Hossain MA, Sano A, Hou DX. Aïllament i elucidació estructural de compostos antifúngics de Curcuma amada. Asian Pac J Trop Med. 2019;12:123–9.

13. Akter J, Hossain MA, Takara K, Islam MZ, Hou DX. Activitat antioxidant de diferents espècies i varietats de cúrcuma (Curcuma spp): Aïllament de compostos actius. Comp Biochem Physiol C Toxicol Pharm. 2019;215:9–17.

14. Khunlad P, Tundulawessa Y, Supasiri T, Chutrtong W. Activitat inhibidora de la tirosinasa dels curcuminoides a partir de la pols de cúrcuma (Curcuma longa Linn.). J SWU Sci. 2008;24:125–39.

15. Giang PM, Son PT. Aïllament de sesquiterpenoides dels rizomes de la cúrcuma vietnamita Salisb aromàtica. J Chem. 2000;38:96–9.

16. Asem SD, Laitonjan SW. Investigació de la relació estructura-no linealitat de zederone del rizoma de Curcuma caeca Roxb. Ind J Chem. 2012;51:1738–42.

17. Faiz Hossain C, Al-Amin M, Rahman KM, Sarker A, Alam MM, Chowdhury MH, et al. Principi analgèsic de Curcuma amada. J Etnofarmacol. 2015;163:273–7.

18. Ahmed Hamdi OA, Syed Abdul Rahman SN, Awang K, Abdul Wahab N, Looi CY, Thomas NF, Abd Malek SN. Components citotòxics dels rizomes de Curcuma zedoaria. Sci World J. 2014;2014:321943.

19. Makabe H, Maru N, Kuwabara A, Kamo T, Hirota M. Sesquiterpenes antiinflamatoris de Curcuma zedoaria. Nat Prod Res. 2006;20:680–5.

20. Kikuzaki H, Nakatani N. Diarilheptanoides cíclics de rizomes de Zingiber officinale. Fitoquímica. 1996;43:273–7.

21. Dekebo A, Dagne E, Sterner O. Furanosesquiterpenes de Commiphora sphaerocarpa i adulterants relacionats de la mirra veritable. Fitoteràpia. 2002;73:48–55.

22. Joshi SC, Mathela CS. Activitats antioxidants i antibacterianes de l'oli essencial de la fulla i la furanodienona i curzerenona dels seus components de Lindera pulcherrima (Nees.) Benth. ex ganxo. f. Pharmacogn Res. 2012;4:80–4.

23. Yang FQ, Li SP, Zhao J, Lao SC, Wang YT. Optimització de les condicions GC-MS basades en la resolució i l'estabilitat dels analits per a la determinació simultània de nou sesquiterpenoides en tres espècies de rizomes de Curcuma. J Pharm Biomed Anal. 2007;43:73–82.

24. Li YW, Zhu GY, Shen XL, Chu JH, Yu ZL, Fong WF. La furanodienona inhibeix la proliferació i la supervivència cel·lular suprimint la senyalització ER a les cèl·lules MCF-7 de càncer de mama humà. J Cell Biochem. 2011;112:217–24.

25. Tao QF, Xu Y, Lam RY, Schneider B, Dou H, Leung PS, et al. Diarilheptanoides i un monoterpenoide dels rizomes de Zingiber officinale: propietats antioxidants i citoprotectores. J Nat Prod. 2008;71:12–17.

26. Yokosuka A, Mimaki Y, Sakagami H, Sashida Y. Nous diarilheptanoides i glucòsids diarilheptanoides dels rizomes de Tacca chantrieri i la seva activitat citotòxica. J Nat Prod. 2002;65:283–9.

27. Jiang JL, Jin XL, Zhang H, Su X, Qiao B, Yuan YJ. Identificació de constituents antitumorals en curcuminoides de Curcuma longa L. a partir de la relació composició-activitat. J Pharm Biomed Anal. 2012;70:664–70.

28. Marrot L, Meunier JR. Fotodany a l'ADN de la pell i les seves conseqüències biològiques. J Am Acad Dermatol. 2008;58:139–48.

29. Policegoudra RS, Abiraj K, Channe Gowda D, Aradhya SM. Aïllament i caracterització del compost antioxidant i antibacterià del rizoma del gingebre mango (Curcuma amada Roxb.). J Chromatogr B Anal Technol Biomed Life Sci. 2007;852:40–8.

30. Tadtong S, Viriyaroj A, Vorarat S, Nimkuntat S, Suksamrarn S. Activitats antitirosinasa i antibacterianes de l'extracte de pericarpi de mangostà. J Salut Res. 2009;23:99–102.

31. Li X, Guo L, Sun Y, Zhou J, Gu Y, Li Y. La baicaleïna inhibeix la melanogènesi mitjançant l'activació de la via de senyalització ERK. Int J Mol Med. 2010;25:923–7.