Activitats antioxidants i antimelanogèniques de l'extracte de regalèssia tractada tèrmicament (Wongam, Glycyrrhiza Glabra × G. Uralensis)
Mar 26, 2022
Contacte: Audrey Hu Whatsapp/hp: 0086 13880143964 Correu electrònic:audrey.hu@wecistanche.com
Min Hye Kang 1,2, Gwi Yeong Jang 1, Yun-Jeong Ji 1, Jeong Hoon Lee 1, Su Ji Choi 1, Tae Kyung Hyun 2* i Hyung Don Kim 1*
Resum:La melanina és un pigment marró o negre que protegeix la pell de la radiació ultraviolada i les espècies reactives d'oxigen (ROS). Tanmateix, la sobreproducció de melanina s'associa amb lentigins, melasma, pigues i càncer de pell.regalèssiaha demostratantioxidant, activitats antitumorals, antiplaquetàries, antiinflamatòries i immunomoduladores i s'utilitza com a tractament natural per a la pellblanqueig.Vam confirmar el potencial de Wongam, un nou conreu de regalèssia desenvolupat per l'Administració de Desenvolupament Rural (RDA), com ablanqueigagent en cosmètica. A més, vam comprovar l'efecte del tractament tèrmic sobre la bioactivitat de la regalèssia mitjançant la comparacióantioxidantianti-melanogènicactivitats de l'extracte de regalèssia abans i després de l'escalfament (130 ◦C). L'extracte de regalèssia tractat tèrmicament (WH-130) va mostrar activitats d'eliminació de radicals més altes a l'ABTS més (2,20-azino-bis-({3-etil benzotiazolina-6-sulfònic) àcid) sal diamoni) i assaigs de DPPH (2,2-difenil-1-picrilhidrazil). A més, WH-130 va inhibir la melanogènesi de manera més eficaç a causa de la regulació a la baixa de la tirosinasa a les cèl·lules del melanoma B16F10 que no pas escalfades.regalèssiaextracte. A més, el tractament tèrmic va augmentar el contingut fenòlic total. En particular, l'isoliquiritigenina, anantioxidantianti-melanogèniccompost de regalèssia, es va produir mitjançant tractament tèrmic. En conclusió, el WH-130, amb nivells més elevats de fenòlics bioactius, com la isoliquiritigenina, té potencial per desenvolupar-se en una pell nova.blanqueigmaterial amb aplicacions en cosmètica.
Paraules clau: anti-melanogènicactivitat; tractament tèrmic;regalèssia; cèl·lules de melanoma murí (B16F10)
1. Introducció
regalèssia(espècie Glycyrrhiza), una herba perenne amb usos medicinals de la família Leguminosae, està àmpliament distribuïda per Àsia Central, Xina, Rússia, Manxúria, Mongòlia i Europa [1]. S'ha utilitzat durant molt de temps com a aromatitzant i edulcorant. Les arrels seques i els estolons de regalèssia s'han utilitzat per al tractament del refredat, la tos, l'asma, la fatiga i les infeccions del tracte respiratori a causa de les activitats biològiques de la regalèssia, com araantioxidantActivitats antimicrobianes, antitumorals, antiplaquetàries, antiinflamatòries i immunomoduladores [2,3]. El gènere Glycyrrhiza consta d'unes 22 espècies de regalèssia, entre elles G. uralensisFisch, G. glabra L. i G. inflata Batal.
Wongam, un nou conreu híbrid interespecífic de regalèssia, va ser desenvolupat per l'Administració de Desenvolupament Rural com un híbrid de Glycyrrhiza glabra x G. uralensis (G. korshinskiGrig). Wongam té rendiments més alts i una millor resistència a les malalties que G. uralensis. S'han realitzat nombrosos estudis sobre les activitats biològiques de G. uralensis, mentre que la investigació existent sobre Wongam, un nou conreu, es limita a les seves activitats antial·lèrgiques, immunomoduladores i anti-úlceres [1,2]. Per tant, cal investigar l'àmplia bioactivitat de Wongam.
Els principals components bioactius enregalèssiaLes arrels són flavonoides i saponines de triterpès, incloses liquiritina, liquiritigenina, isoliquiritigenina (ISL) i glicirrizina (o àcid glicirricic) [4,5]. L'ISL és un flavonoide que es troba a la regalèssia que ha mostrat diverses activitats farmacèutiques, com ara antiplaquetàries, antial·lèrgiques, antitumorals, antiinflamatòries iantioxidantactivitats [6–8]. ISL és un producte d'hidròlisi a partir d'isoliquiritina a l'arrel de regalèssia. Pot inhibir la melanogènesi mitjançant la degradació del factor de transcripció associat a la microftàlmia (MITF) mitjançant l'activació de la via de senyalització de la proteïna cinasa regulada per senyal extracel·lular (ERK). En conseqüència, la degradació del MITF va suprimir l'expressió dels gens de la tirosinasa (TYR) i les proteïnes relacionades amb la tirosinasa (TRP-1 i TRP{-2) a les cèl·lules SK-MEL-2 [9,10].ISL. pot inhibir les activitats mono- i difenolases del TYR dels bolets, així com la melanogènesi als melanòcits [11].
La melanina, un pigment important que imparteix el color de la pell, es sintetitza en melanòcits epidèrmics i s'emmagatzema en orgànuls intracel·lulars anomenats melanosomes [12]. Els pigments de melanina consisteixen en dos tipus: eumelanina marró o negra i feomelanina vermella o groga [12]. La melanogènesi pot ser induïda per estímuls externs, com ara la radiació ultraviolada (UV), les espècies reactives d'oxigen (ROS) i productes químics com l'hormona estimulant dels melanòcits (-MSH) i l'isobutilmetilxantina (IBMX), que eleva els nivells de monofosfat d'adenosina cíclica (cAMP). La melanina protegeix la pell contra aquests estímuls, mentre que la seva sobreproducció provoca hiperpigmentació de la pell, que pot provocar malalties com el càncer de pell [13–17]. Pellblanqueigagents com l'àcid cògic, la hidroquinona, l'arbutina i l'àcid ascòrbic, que són inhibidors de TYR, s'han utilitzat per tractar la hiperpigmentació en diversos productes cosmètics [13,18]. La melanogènesi es regula mitjançant una varietat de vies de senyalització, i aquests senyals estan relacionats amb la regulació de MITF. L'activació de MITF promou l'expressió de TYR i TRP (TRP-1, TRP-2). Aleshores, TYR catalitza l'oxidació de la L-tirosina a 3,4-dihidroxi-L-fenilalanina (L-DOPA), que s'oxida posteriorment en DOPAquinona. El TRP-2 converteix el dopacrom en 5,6-dihidroxiindol-2-àcid carboxílic (DHICA) o 5,6-dihidroxiindol (DHI). Finalment, DHICA i DHI s'oxiden per TRP-1, donant lloc a una inmelanogènesi [19].
Els processos tèrmics afecten les propietats fisicoquímiques i biològiques dels extractes vegetals. Destrueixen les parets cel·lulars i tallen enllaços covalents, donant lloc a l'alliberament de compostos bioactius [20,21]. El tractament tèrmic dels extractes de cereals gastats dels cervesers per sobre de 130 ◦ Augmenta els nivells de contingut fenòlic total (TPC) i flavonoides totals (TFC), amb els corresponents augments de les activitats antioxidants [16,20,21]. L'escalfament de les pells de cítrics pot provocar l'alliberament de compostos fenòlics i augmentarantioxidantactivitat [17].
El nostre objectiu principal és confirmar el potencial de Wongam com a pell naturalblanqueigmaterial en cosmètica. A més, aquest estudi també pretén demostrar si el tractament tèrmic pot millorar les activitats antioxidants i anti-melanogèniques deregalèssia. Vam investigarantioxidantactivitats, juntament amb els extractes del TPC de Wongam.Anti-melanogènicEls efectes dels extractes de Wongam es van verificar mitjançant l'activitat d'inhibició de TYR i el contingut de melanina en cèl·lules d'inmelanoma.
Cistanche és un naturalpellblanqueig herba
2. Materials i Mètodes
2.1. Preparació de la mostra
Les mostres es van preparar segons un mètode informat anteriorment [22].regalèssia(Wongam, Glycyrrhiza glabra x G. uralensis, identificat per Yun Ji Lee de NIHHS, RDA i registrat a l'herbari de recursos medicinals de Corea amb el número de val MPS006326) es va conrear i collir al Departament d'Investigació de Cultius d'Herbes (Eumsung, Chungcheongbuk, Corea). ) el 2018, i assecat a 60 ◦C durant 20 h. 10 kgregalèssiaes va collir i es va triturar 1 kg. Després de barrejar-los, es van obtenir 3 mostres de WC o WH, respectivament. La regalèssia mòlta (5 g) es va col·locar en un recipient de vidre amb 1 ml d'aigua destil·lada i es va tractar en un autoclau (Jisico, Seül, Corea) durant 1 h a 130 ◦C (WH-130). Regèssia control no tractada (WC). , 5 g) i WH-130 es van extreure per separat amb etanol al 70 per cent (mostra: dissolvent, 1:50, v:v) durant 24 h a temperatura ambient (RT). Després de la filtració, els extractes es van evaporar al buit, es van liofilitzar i es van emmagatzemar a -80 ◦ C. Tots els extractes es van solubilitzar en dimetilsulfòxid (DMSO) (Sigma, St. Louis, MO, EUA) i metanol (Sigma, St. Louis, MO, EUA).
2.2. Determinació de Browning
L'índex de dauració deregalèssiaEls extractes (WC i WH-130) es van registrar en funció del seu valor d'absorbància a 420 nm (A420) mesurat mitjançant un lector de microplaques (BioTek, Winooski, VT, EUA). Valors més alts d'absorbància a 420 nm corresponen a un índex de marronament més alt [23, 24].
2.3. Contingut fenòlic total (TPC)
Segons un mètode reportat anteriorment [25], el TPC es va mesurar basant-se en el principi que el reactiu de Folin-Ciocalteu es redueix a un cromòfor blau format per un complex afosfotúngstic-fosfomolibdè en funció de les condicions alcalines i de la concentració de compostos fenòlics. Cada mostra (10 µl) es va barrejar amb un 2% de carbonat de sodi (200 µl) i després el reactiu de Folin-Ciocalteu (10 µl). La mescla es va activar durant 30 min a RT. A continuació, es va mesurar l'absorbància a 750 nm mitjançant un lector de microplaques (BioTek, Winooski, VT, EUA). El TPC es va calcular a partir de la corba estàndard de l'àcid gàl·lic i els resultats es van expressar com a valors equivalents d'àcid gàlic, mg GAE g-1extracte.
2.4. Determinació de la capacitat antioxidant
L'activitat d'eliminació de radicals es va mesurar utilitzant 2,20-azino-bis-({3-etilbenzotiazolina 6-àcid sulfònic) sal diamoni (ABTS) segons un mètode descrit anteriorment amb una lleugera modificació [19, 26]. La solució de cations radicals ABTS es va produir barrejant persulfat de potassi 2, 6 mM i ABTS 7, 4 mM i deixant-los reaccionar durant 24 h atRT. A continuació, es va diluir la solució ABTS amb aigua destil·lada per ajustar l'absorbància a l'interval d'1.000-1.500. A continuació, es van fer reaccionar 20 µL de la mostra amb 180 µL de solució ABTS més, protegides de la llum, i la barreja de mostra i solució es va incubar durant 30 min atRT. Es va mesurar l'absorbància mitjançant un lector de microplaques (BioTek, Winooski, VT, EUA) a 735 nm. A partir d'una corba estàndard de Trolox, l'equivalent de TroloxantioxidantLa capacitat (TEAC) es va calcular i expressar en mg d'equivalent de trolox (TE) per g de mostra seca.
2, es va preparar una solució de radical 2-difenil-1-picrilhidrazil (DPPH) dissolent 0,2 mM de DPPH en etanol al 99 per cent. La solució de DPPH es va diluir amb aigua destil·lada fins a anabsorbància a 520 nm de 1000-1500. A continuació, es van barrejar 50 µL de la mostra amb 200 µL de solució de DPPH i es van fer reaccionar durant 30 min a RT. Després de la reacció, es va determinar l'absorbància de la mescla a 520 nm. A partir de la corba estàndard de Trolox, es va calcular el TEAC i es va expressar en mg TE per g de mostra seca.
2.5. Anàlisi de cromatografia líquida d'alt rendiment (HPLC).
Es va aplicar un mètode HPLC modificat [22]. El contingut ISL deregalèssiaels extractes es van analitzar mitjançant HPLC amb un detector UV-visible (HPLC: sèrie 1200, Agilent Technologies, Santa Clara, CA, EUA; columna: SynergiTM, 250 × 4,6 mm, 4 µm, Fusion-RP 8{{40}} Å, Phenomenex, Torrance, CA, EUA). La fase mòbil constava del dissolvent A (0,1 per cent d'aigua d'àcid fòrmic) i de dissolvent B (0,1 per cent d'àcid fòrmic en acetonitril). El programa de gradients per a la fase mòbil es va operar amb el següent gradient: 0–8 min (20–20 per cent B), 8–30 min (20–38 per cent B), 30–42 min (38–50 per cent B), B), 42–47 min (50–90 per cent B), 47–53 min (90–90 per cent B), 53–54 min (90–20 per cent B) i 54–60 min (20–20 per cent B) . El cabal, la longitud d'ona de detecció i el volum d'injecció es van establir a 1, 0 mL/min, 360 nm i 10 µL, respectivament. Les solucions estàndard ISL es van analitzar amb quatre concentracions diferents (0,05, 0,1, 0,2, 0,4 mg/mL). La corba de calibratge (y=ax més b) es va utilitzar per determinar el contingut de l'ISL. A l'equació de regressió, x es refereix a la concentració de l'ISL (mg mL−1) i y significa l'àrea del pic.
2.6. Assaig d'activitat inhibidora de la tirosinasa de bolets
L'assaig d'activitat inhibidora de TYR es va realitzar mitjançant un kit de cribratge d'inhibidors de TYR (BioVision, Milpitas, CA, EUA). Cada extracte (WC i WH-130) es va dissoldre en DMSO fins a una concentració final de 250 µg/mL. L'àcid kòjic, utilitzat com a control positiu, també es va diluir a 250 µg/mL en DMSO. En resum, es van combinar 20 µL d'extracte o àcid cògic amb 50 µL de solució enzimàtica TYR. Després de la incubació a RT durant 10 min, es van afegir 30 µL de solució de substrat TYR a cada pou. La concentració final dels extractes i l'àcid cògic va ser de 50 µg/mL. A continuació, es va mesurar la densitat òptica dels pous a 510 nm en mode cinètic durant 1 h amb un lector de microplaques (BioTek, Winooski, VT, EUA).
cistanche en pols: antioxidació
2.7. Cultiu cel·lular
Les cèl·lules B16F10 de melanoma murí es van obtenir de la American Type Culture Collection (ATCC, Manassas, VA, EUA). Les cèl·lules B16F10 es van cultivar en el medi d'Eagle modificat de Dulbecco (DMEM) complementat amb un 10% de sèrum fetal boví (FBS), 100 unitats/mL de penicil·lina i 100 µg/mL d'estreptomicina (Gibco, Grand Island, NY, EUA) en una atmosfera humidificada. percentatge de CO2 a 37 ◦C.
2.8. Assaig de viabilitat cel·lular
La citotoxicitat deregalèssiaEls extractes (WC i WH-130) a cèl·lules B16F10 es van determinar mitjançant el MTT [3-(4,5-dimetiltiazol{-2-il)-2,{{8 }}assaig de bromur de difeniltetrazoli]. Les cèl·lules B16F10 es van cultivar a 4 × 103 cèl·lules/pou en una placa de 96-pous durant 24 h. A continuació, es van afegir extractes a les cèl·lules a concentracions de 50, 100 i 200 µg/mL i es van incubar a 37 ◦ C durant 48 h. A continuació, es va afegir solució MTT a cada pou (500 µg/mL) i la placa es va incubar durant 1 h a 37 ◦C. El medi de cada pou es va descartar i es van afegir 100 µL de DMSO. Després d'agitar durant 30 min, es va mesurar l'absorbància a 540 nm amb un lector de microplaques. Totes les proves es van realitzar per triplicat.
2.9. Mesurament del contingut de melanina cel·lular
El contingut de melanina intracel·lular es va mesurar mitjançant una versió lleugerament modificada del mètode descrit anteriorment [27]. Les cèl·lules de melanoma B16F10 es van sembrar en plaques 6-pous amb una densitat de 8 × 104 cèl·lules/pou i es van incubar durant 24 h. Les cèl·lules es van exposar als extractes (WC i WH-130, 100 µg/mL), àcid cògic (100 µg/mL) o ISL (10 µM, Millipore Sigma, Burlington, MA, Estats Units) durant 48 h en la presència de 100 µM d'3-isobutil-1-metilxantina (IBMX). Després del tractament, les cèl·lules es van rentar amb solució salina tamponada amb fosfat de Dulbecco (DPBS) i es van dissoldre en 200 µL de NaOH 1 N durant 2 h a 90 ◦ C. L'absorbància a 405 nm es va mesurar mitjançant un lector de microplaques.
2.10. Assaig d'activitat de la tirosinasa cel·lular
L'activitat intracel·lular de TYR es va mesurar mitjançant una versió lleugerament modificada d'un mètode descrit anteriorment [27]. Les cèl·lules de melanoma B16F10 (8 × 104 cèl·lules/pou) es van tractar amb els extractes (100 µg/mL) o àcid cògic (100 µg/mL) en presència de 100 µM IBMX durant 48 h, es van recollir i es van rentar amb DPBS. Les mostres de proteïnes es van lisar en un 1% de TrionX-100 (MilliporeSigma, Burlington, MA, EUA) amb tampó de fosfat sòdic (pH 6,8) i després es van centrifugar a 15,000 rpm durant 10 min. Es va recollir la fracció sobrenedant i es va determinar la concentració de proteïnes mitjançant el kit d'assaig d'àcid bicinconínic (BCA) (Waltham, MA, EUA). Es va afegir una barreja de reacció formada per 30 µg de proteïna (ajustada a 100 µl amb l'1 per cent de Trion X-100) i 100 µl de L-DOPA 10 mM a cada pou d'una placa de pous 96-. Després de la incubació a 37 ◦ C durant 1 h, es va controlar el dopacrom mesurant l'absorbància a 490 nm mitjançant un lector de microplaques. L'activitat TYR es va calcular amb la fórmula següent:
Activitat de la tirosinasa (percentatge)=(DO405 de la mostra/DO405 del control) × 100
2.11. Reacció en cadena de la polimerasa en temps real (RT-PCR)
Els nivells d'expressió d'ARNm dels gens relacionats amb la melanogènesi, inclosos MITF, TYR, TRP-1 i TRP-2 es van determinar mitjançant un assaig RT-PCR modificat [28]. Breument, les cèl·lules B16F10 es van sembrar en plaques 6-pous a una densitat de 8 × 104 cèl·lules per pou i es van cultivar durant 24 h. A continuació, les cèl·lules es van tractar amb extractes (100 µg/mL), àcid cògic (100 µg/mL) o ISL (10 µM) durant 48 h. L'ARN total es va aïllar de les cèl·lules mitjançant el reactiu TRIzol (Ambion, Austin, TX, EUA) i després es va quantificar la concentració d'ARN mitjançant un microplatereader. Després de preparar l'ADNc (2 µg) mitjançant el kit de premescla de transcriptasa inversa (ElpisBiotech, Daejeon, Corea) segons els protocols del fabricant, es va realitzar PCR en temps real mitjançant MITF, TYR, TRP-1, TRP-2 i primers d'actina (Taula 1, Bioneer, Daejeon, Corea) amb un kit SYBR Green (ProGEN, Heidelberg, Alemanya) en un instrument PCR en temps real CFX96 (Bio-Rad, Hercules, CA, EUA). Totes les dades es van normalitzar als nivells de -actinmRNA com a gen de referència.
2.12. Preparació de Lisats Cel·lulars i Anàlisi Western Blot
Les cèl·lules B16F10 es van sembrar en plaques 6-pous a una densitat de 8 × 104 cèl·lules per pou, es van incubar durant 24 h i després es van exposar a extractes (100 µg/mL), àcid cògic (100 µg/mL). ) o ISL (10 µM) durant 48 h. Després de rentar-se amb DPBS, les cèl·lules es van recollir i lisar en tampó Triton X-100(MilliporeSigma, Burlington, MA, EUA) que contenia un 1% de proteasa i còctel inhibidor de la fosfatasa. Les concentracions de proteïnes dels lisats de cèl·lules senceres es van mesurar mitjançant un kit d'assaig aBCA (Waltham, MA, EUA). Es van carregar quantitats iguals de proteïna (20 µg) en gels de poliacrilamida de dodecil sulfat de sodi al 10 per cent, que es van fer funcionar durant 4 h a 70 V. Després, les proteïnes es van transferir a una membrana de fluorur de polivinilidè (PVDF). La membrana es va rentar tres vegades amb solució salina tamponada amb Tris [50 mM Tris-HCl (pH 7, 5), 150 mM NaCl] que contenia un 0, 1 per cent de Tween 20 (TBST) i es va bloquejar amb un 2 per cent d'albúmina sèrica bovina (GenDEPOT) durant 1 h. A continuació, les membranes es van incubar durant la nit a 4 ◦ C amb els anticossos primaris (dilució 1:1000) durant 4 h a temperatura ambient. MITF, TYR, TRP-1, TPR-2 i -actin es van detectar amb anticossos policlonals anti-MITF de conill (Abcam, Cambridge, Regne Unit); anticòs anti-TYR policlonal de cabra (Santa Cruz, Dallas, TX, EUA); i anticossos monoclonals antiTRP-1, anti-TRP-2 i anti- -de ratolí (Santa Cruz, Dallas, TX, EUA), respectivament. Després, les membranes es van rentar diverses vegades amb TBST i es va incubar amb anticossos secundaris (dilució 1:2000) durant 1 h, és a dir, IgG anti-ratolí de conill, IgG anticabra de ratolí i IgG anti-ratolí de cabra (Santa Cruz, Dallas, TX, EUA), seguit de diversos rentats amb TBST. Les proteïnes diana es van detectar mitjançant un reactiu de quimioluminescència millorada (ECL) (Bio-Rad, Hercules, CA, EUA) amb el sistema d'imatges ChemiDoc (Bio-Rad, Hercules, CA, EUA). La quantificació de la banda de proteïnes es va realitzar mitjançant el programari ImageJ (versió 1.52a per a Windows; NIH, Rockville, MD, EUA) [28].
2.13. Anàlisi estadística Les dades es van analitzar mitjançant Microsoft Excel 2016 i tots els resultats experimentals es presenten com a mitjana ± desviació estàndard (DE) de tres mesures independents. La prova t de dues mostres de l'estudiant es va utilitzar per avaluar les diferències entre el control i les mostres. L'anàlisi de variància unidireccional (ANOVA) i la prova de Duncan es van realitzar mitjançant Rsoftware (versió 3.6.3) per determinar la significació de cada comparació a nivells de p < 0.05="" (*),="" p="">< 0,01="" (**)="" i="" p="">< 0,001="" (***).="" l'anàlisi="" de="" correlació="" es="" va="" realitzar="" mitjançant="" prism5.02="" (graphpad="" software,="" san="" diego,="" ca,="">
3. Resultats
3.1. Índex de Browning dels extractes de regalèssia
El grau de dauració deregalèssiaextractes es mostren a la figura 1a. Aquests resultats van confirmar que l'extracte tractat tèrmicament (WH-130, 0,965 ± 0.025 AU [unitats d'absorbància]) tenia valors d'índex d'enrossament molt més alts que els no escalfats. extracte (WC, 0,758 ± 0,005 UA). Esperem que el processament tèrmic augmenti la formació de melanoidina en WH-130 i que aquest canvi pugui estar relacionat amb diverses activitats biològiques.
3.2. Contingut fenòlic total (TPC) dels extractes de regalèssia
La figura 1b mostra el TPC deregalèssiaextractes. Hem trobat una diferència de TPC entre WC i WH{{0}}, ja que WC tenia un TPC de 12.093 ± 0,061 mg GAE/g d'extracte, mentre que WH{-130tenia un TPC de 14,098 ± 0,781 mg GAE/g d'extracte. El tractament tèrmic va augmentar el TPC dels extractes de regalèssia.
3.3. Activitat eliminadora de radicals dels extractes de regalèssia
Elantioxidantactivitat deregalèssiaextractes es presenten a la figura 1c, d. L'ABTS més la capacitat d'eliminació de radicals va ser més gran per a l'extracte WH-130 (6,086 ± 0,3{04 mg TEAC/gextract) que l'extracte WC (3,542 ± 0,093 mg TEAC/g extracte). En l'assaig DPPH, es va observar una tendència similar. L'extracte de WH-130 (7,442 ± 0,292 mg TEAC/g d'extracte) va mostrar una activitat d'eliminació de radicals DPPH més gran que l'extracte de WC (4,033 ± 0,160 mg de TEAC/gextract). Aquests resultats indiquen que l'escalfament pot augmentar l'activitat antioxidant dels extractes.
3.4. Contingut d'isoliquiritigenina dels extractes de regalèssia
Els resultats van mostrar que el contingut d'ISL de WC va augmentar notablement després del tractament tèrmic (taula 2, figura 2), cosa que indica que el processament tèrmic pot afectar el contingut d'aquestantioxidantianti-melanogèniccompost.
cistanche tubolosa
3.5. Viabilitat cel·lular
Com es mostra a la figura 3,regalèssiaels extractes no van afectar la viabilitat cel·lular a 50 o 100 µg/ml en relació amb el control tractat amb IBMX. En els tractaments de 50 i 100 µg/mL de tots els extractes, la viabilitat cel·lular es va mantenir superior al 100 per cent. Per tant, es van realitzar més experiments amb concentracions d'extracte de regalèssia de fins a 100 µg/mL.
3.6. Efectes dels extractes de regalèssia sobre la producció de melanina a les cèl·lules de melanoma B16F10
El contingut de pigmentació i melanina de les cèl·lules B16F10 es mostra a la figura 4a,b. El contingut de melanina de les cèl·lules B16F10 va augmentar fins a 3.4- vegades amb el tractament IBMX en relació amb el control no tractat. WC i WH-130 van mostrar una disminució significativa de la pigmentació i el contingut de melanina en comparació amb el grup tractat amb IBMX (figura 4a, b). Tant el WC com el WH{{10}} presentaven un contingut de melanina més baix que les cèl·lules tractades amb KA. L'efecte inhibidor de la síntesi de melanina a les cèl·lules B16F10 tractades amb WH{-130 va ser més gran que la WC. Les quantitats de melanina presents després del tractament amb 100 µg/mL de WC i WH-130 es van reduir fins a aproximadament 0,59-vegades i 0,51- vegades, respectivament, del nivell del tractament amb IBMX. group.ISL (10 µM) i KA (100 µg/mL) van suprimir la producció de melanina fins a 0,59-vegades i 0,67- vegades, respectivament del nivell de les cèl·lules tractades amb IBMX.
Aquest resultat demostra que tractat tèrmicamentregalèssiaL'extracte (WH-130) pot inhibir la producció de melanina de manera més eficient que l'extracte no escalfat (WC). A més, vam observar que el tractament amb extracte de WH-130 a 25, 50 i 100 µg/mL (figura 4c) va donar lloc a una disminució depenent de la concentració del contingut de melanina de les cèl·lules de melanoma B16F10. En conjunt, aquests resultats mostren que la calefacció va milloraranti-melanogènicactivitat de l'extracte de regalèssia.
3.7. Efectes dels extractes de regalèssia sobre l'activitat de la tirosinasa
3.7.1. Activitat tirosinasa de bolets
L'efecte deregalèssiaEls extractes sobre l'activitat TYR de bolets es mostren a la figura 5a. Hem confirmat que l'efecte dels extractes (WC i WH-130) sobre l'oxidació de substrats per TYR de bolets es va produir en condicions lliures de cèl·lules. A 50 µg/ml, l'extracte de WC va inhibir l'activitat enzimàtica al 81,33%, mentre que WH-130 va suprimir l'activitat TYR al 65,95% del nivell EC. Mentrestant, l'àcid kojic (KA), un inhibidor de TYR, va provocar la inhibició de l'activitat enzimàtica fins al 47,09 per cent del nivell d'EC. La inhibició de l'activitat TYR va ser més gran en la regalèssia tractada tèrmicament (WH-130) que en la regalèssia no escalfada (WC).
3.7.2. Activitat de la tirosinasa cel·lular
Com es mostra a la figura 5b, l'activitat TYR de les cèl·lules tractades amb IBMX va augmentar fins al 233 per cent en relació amb el control no tractat (100 per cent). WC va reduir l'activitat de TYR al 82,17 per cent en comparació amb el grup tractat amb IBMX. L'extracte de WH-130 va inhibir l'activitat cel·lular TYR al 59,88 per cent en comparació amb les cèl·lules tractades amb IBMX. KA va reduir l'activitat cel·lular TYR al 74,07 per cent de les cèl·lules tractades amb nivelin IBMX. En conjunt, aquests resultats mostren que els extractes de regalèssia (WC i WH-130) suprimeixen l'activitat TYR i que WH-130 té una activitat inhibidora de TYR més potent que WC i KA.
A continuació, vam investigar les correlacions entre el contingut TPC, ISL,antioxidantactivitat i activitat anti-melanogènica (taula 3). El TPC es va correlacionar positivament amb el contingut ISL (0.827), així com amb les activitats d'eliminació de radicals ABTS plus i DPPH (0.886 i 0.896, respectivament), mentre que El TPC es va correlacionar inversament amb el contingut de melanina (–0.859). El contingut ISL es va correlacionar positivament amb les activitats d'eliminació de radicals ABTS plus i DPPH (0,977 i 0,985, respectivament), mentre que el contingut ISL es va correlacionar inversament amb TYRactivity (–0. 834) i contingut de melanina (–0.995). Les activitats antioxidants (ABTS plus i DPPH) es van correlacionar inversament amb l'activitat TYR (–{{20}},879 i –0,856, respectivament) i el contingut de melanina (–0. 974 i –0,984, respectivament). Aquests resultats indiquen que els compostos fenòlics com ISL de la regalèssia estan estretament associats amb l'antioxidant ianti-melanogènicactivitats dels extractes de regalèssia.
3.8. Efectes dels extractes de regalèssia sobre l'expressió d'ARNm de gens relacionats amb la melanogènesi
Hem examinat l'expressió de gens relacionats amb la melanogènesi a les cèl·lules B16F10 per dilucidar els efectes dels extractes de regalèssia sobre la melanogènesi. Tant WC com WH-130 van suprimir l'expressió d'ARNm de MITF, TYR, TRP-1 i TRP-2 (figura 6). El WC va inhibir l'expressió d'ARNm de MITF, TYR, TRP-1 i TRP-2 als nivells 0.{{10}}plegament, 0.{ {12}}plega, 0.71-plega i 0.{65-plega, respectivament, dels que es troben a les cel·les tractades amb IBMX. WH-130 va inhibir l'expressió d'ARNm de MITF, TYR, TRP-1 i TRP{{20}} fins a 0.43-plegar, {{33} }}.60-plegar, 0.62-plegar i 0.49-plegar, respectivament, dels nivells de grup tractats amb IBMX. L'extracte de WH{{30}} va tenir un efecte inhibidor més fort sobre l'expressió d'ARNm que l'extracte de WC. ISL també va suprimir l'expressió de MITF, TYR, TRP-1 i TRP-2 (0.42-fold, 0.59-fold, 0.68-fold i 0.44-plegament, respectivament, respecte a les cèl·lules tractades amb IBMX). En el grup tractat amb WH-130-, l'abast de la disminució de l'expressió d'ARNm dels gens relacionats amb la melanogènesi va ser més gran que en el grup tractat amb WC, cosa que indica queregalèssiaEls extractes inhibeixen la melanogènesi mitjançant la supressió de la transcripció de gens relacionats amb la melanogènesi i que el tractament tèrmic millora laanti-melanogènicactivitat de l'extracte de regalèssia.
3.9. Efectes dels extractes de regalèssia sobre l'expressió de proteïnes dels gens relacionats amb la melanogènesi
Com es mostra a la figura 7b, el tractament amb WC i WH-130 va reduir significativament els nivells d'expressió de proteïnes de MITF, TYR, TRP-1 i TRP-2. Els nivells d'expressió de MITF, TYR, TRP-1 i TRP-2 es van suprimir a les cel·les tractades amb WC (0.79-fold, 0.{{9 }}plegar, {{10}}.89-plegar i 0.67-plegar, respectivament, en relació amb les cèl·lules tractades amb IBMX). WH-130 va mostrar nivells reduïts d'expressió de proteïnes de MITF, TYR, TRP-1 i TRP-2 ({{20}}.74-plegament, {{24} }}.73-plegar, 0.80-plegar i {{30}}.48-plegar, respectivament, en relació amb les cèl·lules tractades amb IBMX) . ISL va disminuir els nivells d'expressió de proteïnes de MITF, TYR i TRP-2 (0,76-vegades, 0,83-vegades i 0,41-vegades, respectivament, en relació amb el tractament amb IBMX cèl · lules). WH-130 va suprimir l'expressió de proteïnes dels gens relacionats amb la melanogènesi amb més força que WC, demostrant queregalèssiaEls extractes inhibeixen la melanogènesi mitjançant la supressió de la traducció de gens relacionats amb la melanogènesi i que el tractament tèrmic millora laanti-melanogènicactivitat de l'extracte de regalèssia.
pols de cistanche per blanquejar la pell
4. Discussió
Els resultats d'aquest estudi demostren que el tractament tèrmic deregalèssiaafecta el TPC, l'activitat antioxidant ianti-melanogènicactivitat. WH-130 tenia un índex d'enrossament i valors de TPC més alts que WC. Les condicions de processament, incloses la temperatura i la pressió, afecten els components de les mostres. [29]. L'escalfament pot promoure reaccions de Maillard, que estan relacionades amb la producció de melanoidina [23]. Les melanoidines tenen alguns efectes biològics, entre ellsantioxidant, activitats antitumorals i antihipertensives, així com la modulació del sucre en sang [30]. Aquests compostos són macromolècules polimèriques de color marró formades a través de la reacció de Maillard a partir d'interaccions entre sucres i aminoàcids a altes temperatures [21]. Així, com més melanoidines en l'extracte escalfat, més alt serà l'índex d'enrossament. El color de l'extracte de regalèssia no escalfat (WC) mostrava un color marró clar, però el color va ser gradualment més fosc amb una temperatura elevada (130 graus). El procés d'escalfament també pot induir alguns canvis en les estructures químiques dels compostos fenòlics i provocar la ruptura de les parets cel·lulars de les plantes, alliberant fenòlics, donant lloc a activitats antioxidants [31]. Així, el contingut fenòlic dels extractes de regalèssia pot augmentar amb el tractament tèrmic [21]. Informes anteriors van demostrar que el tractament tèrmic de la mel va augmentar la formació de melanoidina i el grau de dauració va coincidir amb l'augment de l'activitat antioxidant [24]. Per tant, WH-130 va mostrar una capacitat antioxidant més gran que WC en els assajos d'eliminació de radicals ABTS plus i DPPH, que s'han utilitzat àmpliament per determinar les activitats antiradicals de mostres basades en la capacitat de transferir electrons o àtoms d'hidrogen [32].
El natural més comúantioxidanti els compostos anti-melanogènics són fenòlics. La tricina i l'àcid 9-hidroxioctadecadienoic es van identificar com els principals fenòlics del sorgo bicolor. A més, aquests components van mostrar efectes antioxidants i anti melanogènics mitjançant la inhibició de l'activitat de la tirosinasa [19]. A més, s'ha demostrat que l'àcid p-cumàric, compost anactiu de Sasa quelpaertensis Nakai, inhibeix fortament l'activitat de la tirosinasa i redueix la producció de melanina a les cèl·lules del melanoma [27]. Segons investigacions anteriors, ISL, un conegut compost flavonoide en el producte d'hidròlisi de l'arrel de regalèssia [6–8], presenta activitats antioxidants i anti-melanogèniques mitjançant la inhibició de l'activitat TYR, el transport de melanosomes i la inducció de la degradació de la melanina [10,31] .Per tant, ens vam centrar en el contingut d'ISL dels extractes i en l'acció de l'ISL en els mecanismes relacionats amb la melanogènesi. L'ISL s'aplica com a agent terapèutic per a moltes malalties a causa de les seves nombroses activitats biològiques, com ara efectes antiinflamatoris, antimicrobians, antioxidants, anticancerígens, immunoreguladors, hepatoprotectors i cardioprotectors [33]. En aquest estudi, es va mesurar un contingut d'ISL més alt a WH-130 que a WC. La hiperpigmentació de la pell està relacionada amb l'estrès oxidatiu. S'ha informat que els eliminadors de radicals lliures tenen un paper important en la supressió de la hiperpigmentació [17,34]. En conjunt, aquests resultats mostren que el tractament tèrmic de la regalèssia pot millorar les seves activitats d'eliminació de radicals ianti-melanogènicactivitats mitjançant nivells creixents de compostos fenòlics antioxidants com l'ISL. Segons la literatura anterior, hi ha glabrene, glabridina, glabrol, liquiritigenina en regalèssia (Glycyrrhiza uralensis, G. glabra), que presenten inhibició de la tirosinasa. Per tant, aquests compostos també poden tenir un impacte en les activitats anti-melanogèniques [10,11,15,35]. Més estudis sobre ells són importants per dilucidar els efectes anti-melanogènics de la regalèssia.
La síntesi de melanina està regulada per TYR, TRP-1, TRP-2 (dopacrom tautomerasa) i MITF (figura 8). TYR, una glicoproteïna que conté coure, actua com a enzim limitador de la velocitat i té un paper crucial en la producció de melanina. TYR catalitza la hidroxilació de la tirosina a 3,4-dihidroxifenilalanina (DOPA). TYR també catalitza l'oxidació de DOPA a dopaquinona i la conversió de dopaquinona a dopacrom. Aleshores, el dopacrom es converteix en dihidro-indolizina (DHI) o indol 5,6-quinona-2-àcid carboxílic (DHICA) [36–38]. En aquesta via, el TRP-2 catalitza la conversió del dopacrom a DHICA, que és oxidat pel TRP-1 per formar eumelanina. MITF és un factor de transcripció específic que juga un paper crític en la melanogènesi com a principal regulador de l'expressió de TYR, TRP-1 i TRP-2 (figura 8) [28,37]. L'inductor químic de la melanogènesi és la 3-isobutil-1-metilxantina (IBMX), que augmenta l'activitat TYR a través de la via de senyalització cAMP [13]. IBMX augmenta la concentració intracel·lular d'AMPc inhibint la fosfodiesterasa d'AMPc. L'augment dels nivells d'AMPc activa la proteïna cinasa A (PKA) i la PKA activada millora l'activitat i l'expressió de la proteïna d'unió relacionada amb l'AMPc (CREB) [39]. CREB s'uneix al promotor MITF, donant lloc a la regulació de l'expressió gènica MITF. L'activació de MITF promou l'expressió de TYR i TRP [13, 19]. Per tant, la regulació a la baixa del MITF provoca hipopigmentació.
L'extracte de regalèssia escalfat (WH-130) va inhibir el TYR dels bolets i l'activitat cel·lular TYR de manera més eficaç que l'extracte de regalèssia no escalfat (WC). La inhibició de l'activitat TYR cel·lular en extractes de regalèssia pot ser causada per la baixada de TYR. Aquests resultats estan relacionats amb el contingut de melanina de les cèl·lules de melanoma B16F10. A les cèl·lules B16F10, els tractaments amb WH-130 van suprimir la producció de melanina induïda per IBMX millor que el tractament amb WC. A més, WH 130 va regular a la baixa la transcripció i la traducció de marcadors relacionats amb la melanogènesi (MITF, TYR, TRP-1, TRP{-2) a les cèl·lules B16F10 en major mesura que WC. Aquests marcadors poden contribuir col·lectivament a la globalitatanti-melanogènicactivitat [40].
La calefacció deregalèssiaL'extracte va augmentar l'abundància de compostos fenòlics antioxidants com l'ISL, i aquest augment es va relacionar amb un augmentantioxidantactivitats (ABTS plus i DPPH). L'extracte de regalèssia escalfat (WH-130) també va mostrar una major activitat inhibidora de TYR i una disminució de la síntesi de melanina. Hi ha una nova tendència en el desenvolupament de materials naturals a causa del potencial de seguretat. La regalèssia s'ha utilitzat en cremes cosmecèutiques per a la hiperpigmentació [41]. Hem demostrat el potencial de Wongam com a noublanqueig de la pellagent per al seu ús en cosmètica i comprovat que el tractament tèrmic pot millorar el seu potencial.
Glycyrrhiza uralensis Fischer (regalèssia) té activitats antioxidants i fotoprotectores UV en fibroblasts dèrmics humans [22]. Tanmateix, els estudis de comparació entre Wongam (regalèssia) i altres espècies autòctones s'han de dur a terme després. A més, s'han de dur a terme estudis addicionals sobre els components no identificats, com ara el glabrene, la glabridina, de Wongam associats amb el seu efecte anti-melanogènic mitjançant mètodes adequats. És necessari investigar els efectes sinèrgics o antagònics entre els compostos fenòlics després de l'anàlisi dels components de l'extracte de regalèssia [40]. Per examinar com actuen aquestes substànciesantioxidanti s'han d'avaluar els mecanismes anti-melanogènics, la transferència d'àtoms d'hidrogen o els sistemes de transferència d'un sol electron i les vies de senyalització de la proteïna cinasa activada per mitogens [32,37].
5. Conclusions
En aquest estudi, hem investigat el potencial dels extractes de Wongam, un nou cultivar deregalèssia, com unblanqueigagent d'aplicació en cosmètica i efecte del tractament tèrmic sobre la seva bioactivitat. Els extractes de Wongam (WC i WH-130) van mostrar altes activitats d'eliminació de radicals i van inhibir la síntesi de melanina en melanòcits induïts per IBMX en suprimir l'activitat de TYR. El tractament tèrmic va augmentarantioxidanti activitats anti-melanogèniques de Wongam. Com a resultat, WH-130 va mostrar un antioxidant superior ianti-melanogènicactivitats que WC. Els nostres resultats suggereixen que l'extracte de Wongam tractat tèrmicament (WH-130) és un agent reductor de pigments potent amb possibles aplicacions en diversos trastorns dermatològics d'hiperpigmentació, com ara taques marrons, pigues i melasma, i demostren que el processament tèrmic es pot utilitzar per millorar la activitat anti-melanogènica de la regalèssia.
Beneficis de cistanche tubolosa: blanqueig de la pell
