Potencial antioxidant, antiinflamatori i antienvelliment d'un extracte de Kalmia Angustifolia i identificació d'alguns compostos principals Part 1

Siusplau contactaoscar.xiao@wecistanche.comper a més informació

Resum:L'envelliment de la pell és l'element més visible del procés d'envelliment, donant lloc a una gran preocupació per a moltes persones. Les plantes de la família de les Ericaceae generalment tenen propietats antioxidants i antiinflamatòries, cosa que les converteix en potencials ingredients actius anti-envelliment. Aquest estudi tenia com a objectiu avaluar la seguretat i l'eficàcia anti-envelliment d'un extracte de Kalmia angustifolia mitjançant substituts de la pell reconstruïts. L'avaluació de la seguretat es va realitzar mitjançant un assaig de 3-(4,5-dimetil tiazolil-2)-2,5-bromur de difeniltetrazoli (MTT), mentre que l'eficàcia va ser determinat mitjançant l'avaluació de l'activitat antioxidant i antiinflamatòria i l'anàlisi de substituts de la pell reconstruïts segons el mètode d'autoassemblatge per histologia i tinció d'immunofluorescència (elastina, col·lagen-1, col·lagen-3, aquaporina-3) . L'assaig de viabilitat cel·lular va establir la seguretat de l'extracte a una concentració de fins a 200 ug/mL. L'assaig de capacitat d'absorció de radicals d'oxigen (ORAC) i un assaig basat en cèl·lules amb 2',7'-diclorofluoresceïna-diacetat (DCFH-DA) van revelar una forta activitat antioxidant amb un valor ORAC de 16 μmol Trolox Equivalent/mg i mig- concentració inhibidora màxima (IC50) de 0,37 ± 0,02 ug/mL, mentre que es va trobar una activitat antiinflamatòria interessant en la inhibició de la producció de NO, amb un percentatge d'inhibició de la producció de NO del 49 ± 2 per cent a 80 ug/mL. L'aïllament i caracterització de l'extracte va permetre identificar els compostos que podrien ser responsables d'aquestes activitats biològiques, amb dos d'ells identificats per primera vegada a K.tija de cistancheAngustifolia: avicularia i epicatequina-(2 -O-7, 4 -6)-ent-epicatequina. Les anàlisis histològiques dels substituts de la pell tractats amb l'extracte van mostrar un augment del gruix dèrmic en comparació amb els controls. L'extracte de K. Angustifolia millora l'expressió d'elastina i col·lagen-1, que solen disminuir amb l'envelliment de la pell. Aquests resultats suggereixen que K. Angustifolia té una eficàcia antioxidant prometedora i un potencial anti-envelliment.

Feu clic aquí per saber-ne més

Paraules clau: substituts de la pell; envelliment de la pell; productes naturals; ingredients actius; Llorer ovella; activitat antioxidant; activitat antiinflamatòria; enginyeria de teixits

1. Introducció

L'envelliment de la pell és un procés fisiològic natural que preocupa a moltes persones. És el primer "un signe visible de l'avançament de l'edat i la degeneració de la pell. Així, la formulació d'anti-envelliment: els productes cosmètics han guanyat importància en els últims anys per la voluntat de limitar aquesta aparició d'envelliment. L'envelliment de la pell es caracteritza per múltiples canvis a nivell biològic, que inclouen una disminució de la proliferació cel·lular, que resulta en atròfia epidèrmica, i una disminució dels components dèrmics com els fibroblasts i les fibres d'elastina i de col·lagen, i per tant una disminució del gruix dèrmic en adults grans [1,2] El bosc boreal està ple de recursos inexplorats amb un gran potencial per al desenvolupament d'actius cosmètics.Kalmia angustifolia, també coneguda com a llorer d'ovella, és una planta angiospermes de la família de les Ericaceae.Beneficis i efectes secundaris de cistanche tubulosaAquesta planta és originària de l'est d'Amèrica del Nord, però es troba principalment al bosc boreal canadenc [3]. En la medicina tradicional nativa americana, K. Angustifolia s'utilitzava per tractar diversos problemes de salut que implicaven inflamacions, com ara mals d'estómac, esquinços i inflor. cosa que suggereix que aquesta planta té propietats antiinflamatòries [4]. Diverses plantes de la família de les Ericaceae també posseeixen propietats antiinflamatòries i antioxidants, que els converteixen en ingredients actius cosmètics interessants. La composició química de K.angustifolia encara no està ben documentada. Alguns estudis han identificat compostos tòxics, com ara les grayanotoxines, que són neurotoxines verinoses per als humans quan s'ingereixen, però rarament mortals, i l'arbutina (4-hidroxifenil -D-glucopiranòsid), un inhibidor de la tirosinasa que es troba a les fulles de K. Angustifolia. i s'utilitza com a agent despigmentant [5-8]. Malgrat aquests compostos potencialment tòxics que es troben a K. Angustifolia, altres investigacions també han establert que els flavonoides, els àcids fenòlics, els tanins i els terpens es poden trobar en abundància a la planta [9-15]. Alguns d'aquests compostos tenen activitats biològiques interessants i, per tant, podrien donar a K. Angustifolia un efecte anti-envelliment prometedor, com ho fan per a altres plantes.

Cistanche pot anti-envelliment

Encara que calgui desenvolupar nous productes dermocosmètics que ajudin a prevenir l'envelliment de la pell, les noves lleis que prohibeixen o restringeixen les proves amb animals a la indústria cosmètica dificulten fer-ho. Per tant, calen altres opcions per provar l'eficàcia del producte. L'ús de cultius cel·lulars in vitro, o substituts de la pell, és una bona alternativa per al cribratge d'ingredients cosmètics. Diversos models estan aprovats pel Centre Europeu per a la Validació de Mètodes Alternatius (ECVAM, Ispra, Itàlia) i es venen comercialment a empreses de cosmètics, per tal que puguin executar proves de seguretat i evitar el patiment innecessari que comporta l'ús d'animals [16,17] . Tanmateix, la majoria dels models disponibles comercialment només presenten una epidermis diferenciada i no tenen la interacció entre queratinòcits i fibroblasts [16]. En els darrers anys han sorgit nous models de gruix total que han permès, entre d'altres, la investigació de vies d'envelliment i compostos antienvelliment, convertint-los en eines útils per a la substitució de l'ús animal en l'àmbit cosmètic [18,19].extracte de cistanche tubulosaL'objectiu d'aquest estudi va ser primer avaluar l'activitat biològica d'un extracte de K. Angustifolia sobre monocapes de cèl·lules cultivades i després avaluar el potencial anti-envelliment d'aquest extracte mitjançant substituts de la pell reconstruïts segons el mètode d'autoassemblatge [20,21] . La força d'aquest model de substitut de la pell és que està lliure de materials exògens i es basa en la capacitat de l'àcid ascòrbic per afavorir la producció de matriu extracel·lular per fibroblasts dèrmics, fent que el model sigui completament humà.ressenyes de cistanche tubulosaAquest estudi presenta un nou ingredient actiu que es podria utilitzar en productes dermocosmètics i suggereix l'ús de models in vitro com a alternativa en la investigació cosmètica.

2. Materials i Mètodes

2.1. Preparació de material vegetal i extracte

K.angustifolia es va collir el 2 de maig015 a la regió de Lac-St-Jean del Quebec, Canadà. La planta va ser identificada per M. Patrick Nadeau i es va dipositar un exemplar de val (núm. QFA0617265) a l'herbari Louis Marie de la Universitat de Laval, Ouébec, Canadà. Les parts aèries de K.angustifolia (2,1 kg) es van triturar amb un molí de tall Fritsch Pulverisette 25 (Fritsch, Laval, QC, Canadà) i es van extreure sota reflux amb etanol anhidre (1,5 L, tres vegades) i EtOH-H2O3:1 ( 1,5 L, dues vegades). Els extractes obtinguts després de les primeres extraccions (en EtOH i EtOH-H, O) es van filtrar i agrupar. Després de l'evaporació d'EtOH al buit, la fase aquosa es va repartir amb diclorometà (DCM, CHCl; 300 ml, cinc vegades) i acetat d'etil (EtOAc; 300 ml, cinc vegades). La fase EtOAc es va evaporar a pressió reduïda fins a sequedat per produir extracte de K. angustifolia (222,6 g, 10,6 per cent). El dia abans dels tractaments, l'extracte, en forma de pols, es va dissoldre en sulfòxid de dimetil (DMSO; Sigma, Oakville, ON, Canadà) per obtenir la solució d'emmagatzematge, i després es va emmagatzemar a -20 grau fins que es necessitava. Les concentracions desitjades de K.angustifolia es van obtenir diluint la solució madre (12,5 o 25 mg/mL) directament en el medi de cultiu el dia de l'experiment. La concentració final de DMSO va ser del 0,2 per cent (ofo) per evitar la toxicitat del dissolvent.

2.2.Aïllament dels principals compostos de l'extracte de K. Angustifolia

De l'extracte d'EtOAc descrit anteriorment, es van separar 30 g per cromatografia sobre una columna Diaion (Mitsubishi Chemicals, Charlotte, NC, EUA), utilitzant MeOH/H2O com a eluent en condicions de gradient (40 per cent). , 50 per cent , 60 per cent , 70 per cent i 100 per cent ), per donar quatre fraccions enriquides (AD). La fracció B (2 g) es va sotmetre a una columna de gel de sílice (200 g) i es va eluir amb condicions de gradient de MeOH-DCM del 5% al ​​15% per donar quatre fraccions (B1-B4). La fracció C (6 g) també es va sotmetre a una columna de gel de sílice (300 g) i es va eluir amb condicions de gradient de MeOH-DCM del 5% al ​​25% per donar set fraccions (C1-C7). La fracció C3 (500 mg) es va purificar mitjançant cromatografia de fase inversa en una columna C18 (120 g, FLH-R33230B-IS120 SiliaSepTM C18, Silicycle, Quebec, QC, Canadà) utilitzant un 0,1 per cent d'àcid fòrmic en H, O-MeOH de del 40 al 60 per cent. Es van obtenir quatre subfraccions: C3A-C3D, amb C3B, i C3C amb alta puresa, que contenen els compostos principals. La fracció C4 (2g) també es va purificar mitjançant cromatografia en fase inversa en una columna C18 utilitzant un 0,1% d'àcid fòrmic en H2O-MeOH del 30% al 45%. De la separació es van obtenir tres subfraccions: C4A-C4C, amb C4A i C4C d'alta puresa, que contenien cadascuna un sol compost. La fracció D (8,7 g) es va sotmetre a columnes de gel de sílice (2 × 200 g) i es va eluir amb condicions de gradient de CHCl3-MeOH (15:1;10:1;5:1) per obtenir vuit fraccions (D). 1-D8). Les fraccions D1 a D4 presentaven cadascuna un compost principal.

2.3. Anàlisi RMN i GC-MS

Els espectres de ressonància magnètica nuclear (RMN) es van registrar amb un espectròmetre Bruker Avance 400 (Bruker, Milton, ON, Canadà) a 400 MHz per a nuclis H i 100 MHz per a nuclis 13C, utilitzant cloroform deuterat (CDCl3) o metanol deuterat (CH3OD) com a dissolvent. Els canvis químics es mostren en ppm en relació amb el pic residual del dissolvent. L'espectrometria de masses d'alta resolució (HRMS) es va registrar en un espectròmetre de masses Agilent 6224 MS-TOF (Agilent, Saint-Laurent, QC, Canadà) equipat amb una font d'electrospray.

2.4.Biòpsies i Extracció Cel·lular

Els queratinòcits i els fibroblasts primaris es van obtenir a partir de biòpsies de cirurgies de reducció de mama. Les donants eren dones caucàsiques d'entre 18 i 52 anys. Els queratinòcits i els fibroblasts es van extreure de les biòpsies mitjançant el mètode d'aïllament descrit anteriorment [22,23]. Les biòpsies es van incubar en termolisina a 4 graus durant 16 h per tal de separar l'epidermis de la dermis. Posteriorment, es van aïllar els queratinòcits de l'epidermis mitjançant tripsina durant 30 min, mentre que els fibroblasts es van aïllar de la dermis mitjançant col·lagenasa durant 4 h. A continuació, es van cultivar les cèl·lules fins al pas desitjat. Es van utilitzar queratinòcits al pas 1 i fibroblasts al pas 4.

2.5. Cultiu cel·lular

Els fibroblasts primaris (pas 4) es van sembrar a 4 × 103 cèl·lules/cm² i es van cultivar en el medi d'àguila modificat de Dulbecco (DMEM) complementat amb un sèrum FB Essence a l'10 per cent (FBI; Seradigm, Salt Lake City). , UT, EUA), 100 UI/ml de penicil·lina G (Sigma, Oakville, ON, Canadà) i 25 ug/ml de gentamicina (Gemini, West Sacramento, CA, EUA). Els queratinòcits primaris (pas 1) es van sembrar a 4 × 103 cèl·lules/cm² en una capa alimentadora de fibroblasts murins 3T3 irradiats i es van cultivar en una combinació de DMEM amb Ham's F12 en una proporció de 3:1 (DMEMH), complementada amb un 5% de clon fetal. Ⅱ sèrum (Hyclone, Scarborough, ON, Canadà), 5 ug/ml d'insulina (Sigma, St. Louis, MO, EUA), 0,4 ug/ml d'hidrocortisona (Galen-ova, Saint-Hyacinthe, QC, Canadà), 0,212 ug /mL de clorhidrat d'isoproterenol (Sandoz Canada, Boucherville, QC, Canadà), 10 ng/mL de factor de creixement epidèrmic humà (EGF; Austral Biological, San Ramon, CA, EUA), 100UI/mL de penicil·lina G (Sigma, Oakville, ON, Canadà). ) i 25 ug/ml de gentamicina (Gemini, West Sacramento, CA, EUA). Els cultius cel·lulars es van incubar a 37 °C en una atmosfera amb un 8% de diòxid de carboni (CO2). Els medis de cultiu cel·lular es van canviar cada dos dies, un total de tres vegades per setmana.

2.6. Assaig de citotoxicitat

La toxicitat de l'extracte de K.angustifolia es va avaluar en queratinòcits primaris mitjançant un {{0}}(4,5-dimetil tiazolil-2)-2,{{5} }assaig de bromur de difeniltetrazoli (MTT). L'assaig MTT és un assaig colorimètric basat en la reducció enzimàtica d'una sal de tetrazoli groc (MTT) a cristalls de formazan violeta. Aquesta reacció enzimàtica és catalitzada per la succinat deshidrogenasa mitocondrial en cèl·lules metabòlicament actives. Així, s'utilitza per avaluar la viabilitat cel·lular en funció de l'activitat metabòlica cel·lular. Breument, el dia 0, es van sembrar queratinòcits a P3 de donants sans a 5 × 103 cèl·lules/pou en una placa de 96-pou sobre una capa alimentadora de fibroblasts murins 3T3 irradiats. El dia 2, es va afegir el tractament. El dia 4, el colorant MTT (bromur de tetrazoli blau de tiazolil, Sigma, St. Louis, MO, EUA) es va afegir a la placa a una concentració de 0,5 mg/ml en solució salina tamponada amb fosfat (PBS) estèril (PBS) 1X. A continuació, es va incubar la placa durant 3 h (37 graus, 8 per cent de CO) i es va extreure formazà amb una solució fresca d'isopropanol i àcid clorhídric (HCl). L'absorbància es va llegir a 570 nm mitjançant un lector de microplaques (SpectraMax Plus 384 Microplate Reader, Molecular Devices, San José, CA, EUA). 2.7. Assaig de capacitat d'absorció de radicals d'oxigen (ORAC).

Per tal d'avaluar les propietats antioxidants de l'extracte de K.angustifolia, es va realitzar un assaig de capacitat d'absorció de radicals d'oxigen (ORAC) tal com descriu Ou et al. amb algunes modificacions [24]. Breument, l'assaig es va realitzar en una placa de 384-pou en un lector de plaques Fluoroskan Ascent FLTM (Labsystems, Milford, MA, EUA). Es van preparar diferents concentracions d'àcid carboxílic Trolox (6-hidroxi{-2,5,7,{8-tetrametil croman-2-; un anàleg de la vitamina E) per fer una corba estàndard en ordre per comparar mostres de prova amb aquest control positiu. L'experiment es va realitzar a una temperatura de 37,5 graus i mig 7,4 amb una mostra en blanc en paral·lel.cistanche Regne UnitLa fluorescència de la fluoresceïna es va registrar cada 60 s amb el fluoròmetre després de l'addició de diclorhidrat de 2,2'-azobis (2-amidino-propà). La fluorescència es va mesurar a una longitud d'ona d'excitació de 485 nm i una longitud d'ona d'emissió de 538 nm. Els resultats es van calcular utilitzant les diferències entre les àrees sota la desintegració de la fluoresceïna del blanc i la corba de la mostra. Els resultats dels valors ORAC es van expressar en micromols d'equivalent Trolox (TE) per mil·ligram (μmol TE/mg) o micromoles de TE per micromoles (umol TE/mol).

2.8. Activitat antioxidant avaluada mitjançant un assaig basat en cèl·lules

L'activitat antioxidant es va avaluar amb un assaig basat en cèl·lules utilitzant 2',7/-diclorofluoresceïna-diacetat (DCFH-DA) tal com descriu Girard-Lalancette et al. amb algunes modificacions [25]. Breument, els fibroblasts WS1 de pell humana (ATCC⑧ CRL-1502, Manassas, VA, EUA) es van incubar durant 60 min amb 100 μL de 5μM DCFH-DA en una solució de sal equilibrada Hanks (HBSS, HyClone, Marlborough, MA, EUA) . A continuació, per avaluar l'activitat antioxidant de l'extracte, les cèl·lules es van incubar durant 60 min amb concentracions creixents de l'extracte de K.angustifolia i els controls positius (quercetina i Trolox). Per a l'estrès oxidatiu, es van afegir 100 μL d'hidroperòxid de tertbutil 400 μM (t-BuOOH) per obtenir una concentració final de 200 μM t-BuOOH als pous. La fluorescència es va mesurar immediatament i després de 90 minuts mitjançant un lector de plaques Fluoroskan Ascent FLTM automatitzat (Labsystems, Milford, MA, EUA). La fluorescència es va avaluar a una longitud d'ona d'excitació de 485 nm i una longitud d'ona d'emissió de 538 nm. L'activitat antioxidant es va expressar com el percentatge d'inhibició de l'oxidació de DCFH.

2.9. Activitat antiinflamatòria avaluada per quantificació de nitrits

L'activitat antiinflamatòria es va avaluar avaluant la inhibició de la producció d'òxid nítric (NO) per part de l'extracte de K.angustifolia tal com descriu Legault et al. [26]. Breument, els macròfags murins RAW 264.7 (ATCC⑧ TIB-71, Manassas, VA, EUA) es van incubar amb concentracions creixents d'extracte de K. Angustifolia i després es van estimular amb 100 ng/mL de lipopolisacàrid (LPS). També es va utilitzar un control positiu, clorhidrat d'èster metílic de Nw-nitro-L-arginina （L-NAME） a dues concentracions diferents ∶250 μM (67 ug/mL) i 1 mM (270 ug/mL). Els sobrenedants lliures de cèl·lules es van recollir 24 hores després de l'estimulació LPS i es va avaluar immediatament la concentració de NO mitjançant la reacció de Griess. L'absorbància es va llegir a 540 nm mitjançant un lector de plaques Multiskan (Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, EUA). La presència de nitrit es va quantificar mitjançant una corba estàndard de NaNO. Les cèl·lules inactivades (exposades només al medi) es van utilitzar com a control negatiu i les cèl·lules activades com a control positiu.

2.10.Producció de substituts de la pell

Els substituts de la pell saludables es van produir segons el mètode d'autoassemblatge, parcialment modificats mitjançant 6-plaques de pou [20,21]. Breument, es van sembrar fibroblasts a P5 de donants sans a 1,5 × 105 cèl·lules/pou i es van cultivar durant 26 dies en DMEM suplementat amb 50 ug/mL de (més)-L-ascorbat de sodi (Sigma, St. Louis, MO, EUA) fins que van formar làmines manipulables. A continuació, es van separar dues làmines de fibroblast i es van superposar per formar l'equivalent dèrmic. Els equivalents dèrmics es van incubar a 37 graus en una atmosfera al 8 per cent de CO durant dos dies més per permetre la fusió de les làmines i així formar la nova capa dèrmica dels substituts de la pell. Després d'aquest període, els queratinòcits a P2 de donants sans es van sembrar a l'equivalent dèrmic a 1 × 10 graus de cèl·lules/equivalent per formar la capa epidèrmica dels substituts de la pell i es van cultivar durant set dies en DMEMH suplementat amb 50 ug/mL de (plus) -L-ascorbat de sodi (Sigma, St. Louis, MO, EUA) per permetre la proliferació de queratinòcits. A continuació, es van elevar els substituts de la pell a la interfície aire-líquid per promoure la diferenciació cel·lular. A la interfície aire-líquid, es van cultivar substituts de la pell amb un medi sense EGF per obtenir un epiteli estratificat representatiu de la pell in vivo. Catorze dies després de ser elevats a la interfície aire-líquid, els substituts de la pell es van tractar tres cops per setmana durant una setmana amb la solució d'extracte diluïda en un medi de cultiu (amb una concentració final d'extracte de K. Angustifolia de 25 ug/mL). Després d'un total de 56 dies de cultiu, es van prendre biòpsies de substitut de la pell i es van analitzar per histologia i tinció d'immunofluorescència.

2.11. Anàlisis histològics

Les biòpsies de substitució de la pell de cada condició es van fixar a la solució HistoChoice (Amresco, Solon, OH, EUA) i es van incrustar en cera de parafina. A continuació, es van tallar seccions de 5 μm de gruix i es van tenyir amb Trichrome de Masson mitjançant l'hematoxilina de Weigert, la fucsina-ponceau i els colorants blaus d'anilina. El gruix de la dermis i de l'epidermis viva es va mesurar amb el programari ImageJ (Instituts Nacionals de Salut (NIH), Bethesda, MD, EUA). Per a les mesures de gruix, es van analitzar tres poblacions cel·lulars diferents, i per a cadascuna d'elles es van fer dues imatges representatives per condició i es van fer 10 mesures per imatge per a un total de 60 mesures per condició.

2.12. Tinció d'immunofluorescència

Les biòpsies de substitució de la pell de cada condició es van incrustar al compost Tissue-Tek OCT (Sakura Finetek, Torrance, CA, EUA), es van congelar en nitrogen líquid i després es van mantenir a -80 grau fins que es necessitava. Com a controls positius es van utilitzar seccions congelades de pell humana normal. La tinció d'immunofluorescència indirecta es va realitzar en crioseccions de 6 um de gruix fixades en acetona. Els anticossos primaris utilitzats van ser: anti-elastina policlonal de conill (gG) (dilució 1:800, Abcam, Cambridge, MA, EUA), anti-colagen policlonal de conill-1 (IgG) (dilució 1:300, Cedarlane, Burlington, ON, Canadà), anticolagen policlonal de conill-3 (IgG) (dilució 1:200, Cedarlane, Burlington, ON, Canadà) i anti-aquaporina policlonal de conill-3 (IgG) (dilució 1:500, Abcam, Cambridge, MA, EUA). L'anticòs secundari utilitzat va ser IgG anti-conill d'ase (H més L) Alexa 488 (dilució 1:1600, Life Technologies, Eugene, OR, EUA). Els nuclis cel·lulars es van marcar després de l'anticòs secundari amb el medi de muntatge DAPI Fluoromount-G (SouthernBiotech, Birmingham, AL, EUA). Per semiquantificar la intensitat de fluorescència de cada proteïna, es va mesurar la intensitat del píxel de la tinció d'immunofluorescència mitjançant el programari ImageJ (National Institutes of Health (NIH), Bethesda, MD, EUA). Breument, es va analitzar tota la capa de pell (dermis o epidermis viva) de la proteïna estudiada mesurant el valor gris mitjà de cada zona. La intensitat de fluorescència dels substituts de la pell tractats es va comparar amb la intensitat de la fluorescència dels substituts de la pell de control per avaluar el canvi en l'expressió de proteïnes observat amb els tractaments.

2.13. Anàlisi estadística

Els resultats es van expressar com a mitjanes ± desviació estàndard. L'anàlisi estadística de l'assaig MTI, l'assaig basat en cèl·lules antioxidants i l'activitat antiinflamatòria es va realitzar amb una anàlisi unidireccional de la variància (ANOVA) seguida d'una prova post hoc de Dunnett (valor p).<0.05 compared="" to="" control="" at="" 0="" μg/ml）="" or="" a="" bonferroni's="" post="" hoc="" test=""><0.05 compared="" to="" controls).="" thickness="" measurements="" were="" analyzed="" with="" a="" t-test.="" results="" were="" considered="" significant="" when=""><0.05. statistical="" analyses="" were="" performed="" with="" r="" software="" (v3.5.2,="" rcmdr="" v2.5-1,="" r-core="" team="" 2018,="" r="" foundation,="" vienna,="">

Aquest article està extret de Antioxidants 2021, 10, 1373. https://doi.org/10.3390/antiox10091373 https://www.mdpi.com/journal/antioxidants