L'àcid aristolòquic indueix fibrosi renal i senescència en ratolins
Mar 23, 2022
Resum:El ronyó és un dels òrgans més susceptibles a les alteracions relacionades amb l'edat. En general, l'envelliment renal va acompanyat de fibrosi renal, que és la via comuna final de la malaltia crònica.malalties renals. L'àcid aristolòquic (AA), un agent nefrotòxic, causa nefropatia AA (AAN), que es caracteritza per una fibrosi renal progressiva i un deteriorament funcional. Tot i que la fibrosi renal s'associa amb l'envelliment renal, encara no està clar si l'AA indueix l'envelliment renal. L'objectiu del present estudi és investigar l'ús potencial de l'AAN com a model d'envelliment renal. Aquí, vam examinar els factors relacionats amb la senescència en models AAN mitjançant l'administració crònica d'AA a ratolins C57BL / 6. En comparació amb els controls, el grup AA va demostrar l'envellimentronyófenotips, com ara l'atròfia renal, el deteriorament funcional renal i la fibrosi tubulointersticial. A més, AA va promoure la senescència cel·lular específicament a laronyonsi l'augment de l'expressió d'ARNm p16 renal i l'activitat de la galactosidasa associada a la senescència. A més, els ratolins tractats amb AA van mostrar anomalies mitocondrials tubulars proximals, així com acumulació d'espècies reactives d'oxigen. Klotho, un gen antienvelliment, també es va reduir significativament a laronyonsde ratolins tractats amb AA. Col·lectivament, els resultats del present estudi indiquen que l'AA altera els factors relacionats amb la senescència i que la fibrosi renal està estretament relacionada amb l'envelliment renal.
Paraules clau:malaltia renal crònica; fibrosi renal; àcid aristolòquic; envelliment; senescència cel·lular
CISTANCHE MILLORARÀ LA MALALTIA RENAL/RENAL
IntroduccióAmb l'augment contínua de l'esperança de vida dels humans, més persones pateixen deficiències relacionades amb l'edat.Ronyonsnormalment es veuen afectats per danys tissulars relacionats amb l'edat i la incidència de malalties cròniquesmalaltia de ronyóaugmenta amb l'edat [1]. L'envelliment renal accelera l'envelliment general, el que resulta en una vida útil més curta. Per tant, la investigació sobre l'envelliment renal és necessària, tot i que no s'han desenvolupat completament models animals adequats. L'envelliment renal s'acompanya de diversos canvis patològics, com ara l'atròfia renal, la glomeruloesclerosi i la fibrosi tubulointersticial [2]. La fibrosi tubulointersticial renal és l'última via comuna en la majoria de les formes de malaltia renal progressiva, la qual cosa suggereix que la fibrosi renal està estretament associada amb la gent gran.ronyó. En la investigació sobre l'envelliment, els ratolins són una eina fiable per la seva proximitat genètica als humans, la capacitat de manipular genèticament el seu genoma i el fet que presenten fenotips relacionats amb l'envelliment als humans durant la seva vida [3]. Les observacions longitudinals amb ratolins endogàmics són ideals com a model d'envelliment, tot i que requereix molt de temps seguir els ratolins durant tota la seva vida útil. A més, hi ha diversos models de ratolí d'envelliment modificats genèticament. El ratolí amb deficiència de Klotho és un model d'envelliment prematur que s'utilitza en la investigació sobre l'envelliment. Tanmateix, en aquest model, la funció renal no es veu afectada i diversos òrgans diferents dels ronyons estan deteriorats [4]. Per tant, aquest model de ratolí pot ser inadequat per a la investigació sobre l'envelliment renal.L'administració d'àcid aristolòquic (AA) provoca un tipus específic de lesió renal coneguda com a nefropatia AA (AAN), que es caracteritza per una fibrosi intersticial extensa [5,6]. L'AA és tòxic per a l'epiteli tubular renal perquè promou la formació d'adductes d'ADN als teixits renals [7]. És poc probable que l'AA afecti òrgans diferents del sistema urinari i pot ser útil per a l'avaluacióronyó-Alteracions específiques. Per tant, l'AA s'utilitza habitualment per establir models de fibrosi renal en ratolins [8,9]. Tanmateix, encara no està clar si les alteracions induïdes per AA estan relacionades amb l'envellimentronyons. En aquest estudi, vam examinar fenotips i factors moleculars relacionats amb l'edat en AAN en ratolins
Resultats 2.1. L'administració d'AA va induir una pèrdua de pes significativa, atròfia renal i una disminució de la funció renalEl pes corporal inicial (BW) i la pressió arterial sistòlica (BP) eren idèntics entre els grups de control de vehicles i AA. El peso corporal en el grup de control de vehicles va augmentar constantment durant 8 setmanes. Tanmateix, l'augment de pes es va inhibir per l'administració d'AA i el grup AA va tenir un BW significativament més baix a les 4 i 8 setmanes després de l'inici de l'administració d'AA (figura 1A). No hi va haver cap diferència significativa en la PA sistòlica o la freqüència cardíaca entre els grups de control de vehicle i AA (figura 1B, C). La relació pes del cor/BW no va mostrar cap diferència entre els grups a les 8 setmanes després de l'inici de l'administració d'AA (figura 1D), mentre que elronyóLa relació pes/BW va ser significativament menor al grup AA a les 8 setmanes després de l'inici de l'administració d'AA (figura 1E). A continuació, vam examinar la funció renal en els grups de control de vehicles i AA. Les concentracions de creatinina plasmàtica i nitrogen d'urea (UN) van ser significativament més altes en el grup AA que en el grup control amb vehicle a les 8 setmanes després de l'inici de l'administració d'AA. A més, el tractament amb AA va reduir significativament l'eliminació de creatinina en comparació amb el grup de control del vehicle a les 8 setmanes després de l'inici de l'administració d'AA (figura 1F-H).
2.2. L'administració d'AA va induir una fibrosi tubulointersticial oberta i una regulació significativa de l'expressió gènica relacionada amb la fibrosi als ronyonsL'examen histològic mitjançant la tinció periòdica d'àcid Schiff (PAS) va revelar que l'àrea glomerular es va reduir significativament al grup AA en comparació amb el grup control del vehicle (figura 2A). Es va observar una fibrosi tubulointersticial extensa, avaluada mitjançant la tinció de tricrom (MT) de Masson, al grup AA (figura 2B), així com amb la regulació a l'alça dels nivells d'ARNm dels gens relacionats amb la fibrosi renal, el col·lagen I i III i el factor de creixement transformador ( TGF)- (Figura 2C–E).
2.3.Administració d'AA Senescència cel·lular accelerada, disfunció mitocondrial i acumulació d'espècies d'oxi/gen de reacció (ROS) als ronyonsPer avaluar la senescència cel·lular, es va examinar l'expressió d'ARNm renal de p53, p21, p16 i glutaminasa (GLS), el grup AA va demostrar nivells d'ARNm significativament més alts d'aquests gens relacionats amb la senescència en elronyons(Figura 3A-D). A més, la intensitat de tinció de -galactosidasa (SA- -gal) associada a la senescència a laronyonsva augmentar en el grup AA i gairebé absent en el grup de control del vehicle (figura 3E). En el grup AA, la microscòpia electrònica va revelar la desaparició de les crestas mitocondrials, la fragmentació mitocondrial, la vacuolització citoplasmàtica i els autolisosomes a les cèl·lules tubulars proximals, concomitant amb el regulació a la baixa de la proteïna 3 que interacciona BCL2/adenovirus E1B 19-kDa (Bnip3), un gen relacionat amb els mitocondris (figura 3FG). Expressió d'ARNm renal de Nox2. un component de la nicotinamida adenina dinucleòtid fosfat (NADPH) oxidasa, va augmentar significativament al grup AA en comparació amb el grup control del vehicle (figura 3H). A més, l'anàlisi de western blot va revelar que el nivell renal 4-hidroxi-2-nominal ({4-HNE) va augmentar significativament al grup AA (figura 3I). Aquests resultats van indicar que l'administració d'AA va induir la senescència cel·lular, la disfunció mitocondrial i l'acumulació de ROS alronyons.
2.4. Expressió de proteïna Klotho renal reduïda AAEs va examinar l'expressió renal de proteïnes antienvelliment en els grups de control de vehicles i AA. L'expressió de Klotho es va reduir significativament al grup AA en comparació amb el grup de control del vehicle (figura 4A), mentre que les expressions renals de nicotinamida fosforibosiltransferasa (NAMPT) i sirtuïna1 (SIRT1) eren similars entre els grups (figura 4B, C).
3. DiscussióSegons el nostre coneixement, el present estudi és el primer que se centra en l'avaluació de les alteracions associades a l'envelliment renal en l'AAN mitjançant marcadors de senescència, com l'activitat p16 i SA- -gal. El tractament amb AA va promoure l'atròfia renal, la fibrosi tubulointersticial i la disminució de la funció renal, que van anar acompanyades d'una regulació de l'ARNm p16 renal i de la tinció positiva de SA- -gal. A més, el grup AA va demostrar característiques dels mecanismes relacionats amb l'envelliment renal, com ara anomalies mitocondrials, augment de l'estrès oxidatiu i la baixada del gen antienvelliment, Klotho. En conjunt, les nostres observacions suggereixen que l'administració crònica d'AA imita parcialment l'envelliment renal.
La senescència cel·lular és l'aturada permanent de la proliferació cel·lular en resposta a diversos factors d'estrès, com el dany a l'ADN, i contribueix a l'envelliment i malalties relacionades amb l'envelliment. L'expressió de p16, un inhibidor de la cinasa dependent de la ciclina, es correlaciona amb l'envelliment en diversos òrgans, inclosos els ronyons. La restricció calòrica augmenta la vida útil inhibint l'expressió de pl6 [10]. A més, l'eliminació de cèl·lules senescents que expressen p16-en ratolins INK-ATTAC mitjançant la injecció d'AP20187, un dimeritzador de proteïnes d'unió FK{506-[11], provoca l'atenuació dels fenotips d'envelliment renal, com l'esclerosi glomerular i renal. declivi funcional. Per tant, p16 és un dels factors més importants relacionats amb l'envelliment. Les cèl·lules senescents es poden detectar mitjançant la tinció de SA- -gal, que demostra una major activitat de -galactosidasa a pH 6,0 [12], i és un biomarcador àmpliament utilitzat de cèl·lules senescents i envellides. L'expressió d'ARNm renal de pl16 augmenta en rata envellidaronyonsi s'acompanya d'una activitat SA- -gal augmentada a l'epiteli renal [13I. En el present estudi, vam demostrar un augment de l'expressió d'ARNm p16 renal i la tinció de SA- -gal, cosa que indica que l'AA indueix la senescència renal. Recentment, es va informar que el GLS era essencial per a la supervivència de les cèl·lules senescents mitjançant la glutaminòlisi millorada i la neutralització del pH intracel·lular [14]. Es va demostrar que la inhibició de la glutaminòlisi dependent de GLS en ratolins vells elimina les cèl·lules senescents i millora la disfunció d'òrgans relacionada amb l'edat. En el present estudi, la regulació de l'ARNm del GLS renal va indicar l'acumulació renal de cèl·lules senescents al grup. Així, l'administració crònica d'AA va provocar una senescència cel·lular als ronyons.
CISTANCHE MILLORARÀ LA FUNCIÓ RENAL/RENAL
A més de la senescència cel·lular, la disfunció mitocondrial és un mecanisme essencial subjacent al dany tissular relacionat amb l'edat i s'acompanya de l'acumulació de ROS [15,16. La disfunció mitocondrial impulsa i manté la senescència cel·lular [17] mentre que la senescència cel·lular contribueix directament a la disfunció mitocondrial [18]. Bnip3, situat principalment a la membrana mitocondrial externa, pot tenir un paper en la regulació de la mitofagia en cèl·lules tubulars proximals renals cultivades en resposta a l'estrès oxidatiu i la hipòxia. En ratolins vells, la restricció calòrica augmenta l'autofàgia a les cèl·lules tubulars, mitjançant la regulació de Bnip3, i millora la degeneració de la funció renal induïda per l'edat [19]. En el present estudi, la microscòpia electrònica va revelar les característiques de les anomalies mitocondrials que es poden veure afectades per la reducció de l'expressió renal de Bnip3 o la senescència cel·lular. Els mitocondris són la principal font intracel·lular de ROS. Per avaluar els efectes de les anomalies mitocondrials sobre les ROS renals, vam examinar l'acumulació renal de 4-HINE i vam demostrar l'acumulació de ROS induïda per AA a laronyons.Les NADPH oxidases són una font important de ROS. Durant la fase aguda de l'AAN en ratolins, l'expressió d'ARNm renal de Nox2 es va elevar i es va reduir la disponibilitat d'òxid nítric, cosa que va provocar hipòxia i isquèmia sostingudes [20. En rata envellidaronyons, l'acumulació de ROS s'acompanya d'una expressió augmentada de Nox2 [21]. Aquestes troballes suggereixen que l'AA pot induir fenotips relacionats amb l'edat mitjançant l'acumulació de ROS causada per la disfunció mitocondrial i la regulació de les NADPH oxidases.
L'expressió del gen Klotho renal es va reduir al grup AA, mentre que l'expressió de NAMPT i SIRTl era similar entre els grups. Klotho és un gen antienvelliment que codifica una proteïna transmembrana d'un sol pas que actua com a supressor de l'envelliment. El procés d'envelliment dels ratolins amb deficiència de Klotho s'assemblava al dels humans, incloent una vida útil més curta, infertilitat, arteriosclerosi, atròfia de la pell, osteoporosi i emfisema [22]. Els ratolins Klotho mutants hipomòrfics també van mostrar un fenotip d'envelliment accelerat, que es va restaurar mitjançant l'ablació de p16 [23]. Atès que Klotho és un factor important en l'envelliment, els ratolins modificats pel gen Klotho s'han utilitzat àmpliament en la investigació sobre l'envelliment. Tanmateix, els ratolins modificats amb el gen Klotho poden ser inadequats per a la investigació sobre l'envelliment renal a causa de les deficiències sistèmiques associades a l'envelliment d'aquests ratolins i el fet que la funció renal no està certificada (és a dir, els nivells de creatinina). En canvi, el model de ratolí AAN es pot utilitzar com a model d'envelliment renal induït per fàrmacs amb finalitats d'investigació, ja que té diversos avantatges, com ara la relativa facilitat d'implementació i la capacitat d'estimar els efectes de les intervencions sobre el declivi funcional renal. .
El present estudi tenia algunes limitacions. Hem avaluat l'envelliment renal, centrant-nos principalment en la senescència cel·lular, la morfologia mitocondrial i l'expressió gènica relacionada amb l'envelliment. No obstant això, els mecanismes de l'envelliment són complexos i es mantenen poc coneguts. A més, tot i que l'expressió del gen de Klotho es va reduir en resposta a l'AA, no vam poder demostrar una relació causal amb els canvis patològics de l'AAN. Es requereixen estudis addicionals per determinar el paper de les diferents molècules implicades en el desenvolupament de l'AAN. No obstant això, el present estudi proporciona nous coneixements sobre l'ús d'Avan com a model d'envelliment renal. És important tenir en compte que els canvis fenotípics en elronyóestan fortament relacionats amb la vida útil. Encara que elronyóes veu fàcilment afectat pels canvis associats a l'envelliment, la inhibició de l'envelliment renal pot allargar la vida útil general. Per tant, més investigacions sobre l'envelliment renal utilitzant models d'AAN poden augmentar la longevitat en el futur.
4. Materials i Mètodes4.1. AnimalsAquest estudi es va realitzar d'acord amb les directrius de l'Institut Nacional de Salut per a l'ús d'animals d'experimentació. Tots els experiments amb animals van ser aprovats pel Comitè d'Estudis Animals de la Universitat de la ciutat de Yokohama (número d'aprovació: FA20-027) i es van realitzar d'acord amb les directrius ARRIVE. Es van fer esforços per minimitzar el nombre d'animals utilitzats i el seu patiment. Els ratolins es van allotjar en un entorn controlat sota un cicle de 12-h llum/12-h fosc a una temperatura de 25 graus C. Els ratolins tenien accés lliure al menjar i l'aigua.
CISTANCHE MILLORARÀ LA INFECCIÓ RENAL/RENAL
Els ratolins C57BL/6 mascles d'edat de vuit setmanes es van comprar als laboratoris Charles River (Wilmington, MA, EUA) i es van assignar als grups de control de vehicles o AA després d'una setmana d'aclimatació, els ratolins es van administrar per via intraperitoneal amb vehicle o AA (Sigma). -Aldrich, St.Louis, MO, EUA), que es va dissoldre en una petita quantitat de sulfòxid de dimetil. Abans del present estudi, vam realitzar un estudi preliminar utilitzant diversos protocols. El primer protocol va incloure l'administració d'AA (3 mg/kg) a ratolins C57BL/6 per via intraperitoneal dues vegades per setmana durant 4 setmanes sense temps de remodelació; en aquest protocol, l'AA va provocar lesions renals agudes obertes, com ara túbuls proximals dilatats amb pèrdua de la vora del raspall (figura suplementària S1). En el segon protocol, els ratolins C57BL/6 es van administrar amb AA (2,5 mg/kg) per via intraperitoneal un cop a la setmana durant 4 setmanes seguit d'un temps de remodelació durant 4 setmanes; La creatinina plasmàtica en aquests ratolins va ser de 0,19 ± {{20}}.080 mg/dL versus 0,18 ± 0,010 mg/dL (control del vehicle versus AA, respectivament; mitjana ± error estàndard de la mitjana (SEM), p=0.86, prova t de Student no aparellada, n=4 per grup) i UN plasmàtica va ser de 31,3 ± 5,95 mg/dL versus 30,4 ± 3,87 mg/dL (control del vehicle versus AA, respectivament; mitjana ± SEM, p=0,90, prova t de Student no aparellada, n=4 per grup). Per tant, vam determinar que aquest protocol no era adequat per a un model de lesió renal perquè l'AA no va induir una disminució funcional renal significativa. En el tercer protocol, els ratolins C57BL/6 es van administrar amb AA (3 mg/kg) per via intraperitoneal dues vegades per setmana durant 10 setmanes sense temps de remodelació; en aquests ratolins, la taxa de mortalitat del grup AA va ser del 83 per cent (n=6), mentre que cap dels ratolins del grup de control de vehicles va morir (n=4). En aquest protocol, no hem pogut avaluar estadísticament el fenotip renal induït per AA a causa de l'alta mortalitat. En el quart protocol, els ratolins C57BL/6 es van administrar amb AA (3 mg/kg) per via intraperitoneal dues vegades per setmana durant 4 setmanes seguit d'un temps de remodelació durant 4 setmanes; En aquests ratolins es van observar lesions renals cròniques, com la fibrosi tubulointersticial i la disminució de la funció renal [9]. Per tant, a partir dels resultats d'aquestes investigacions preliminars, vam adoptar el quart protocol per dur a terme els experiments del present estudi.
4.2.Mesura de BPLa pressió arterial sistòlica i la freqüència cardíaca es van mesurar mitjançant el mètode del puny de la cua descrit anteriorment (BP-Monitor MK-2000; Muromachi Kikai Co., Tòquio, Japó)[24,25]. Totes les mesures es van realitzar entre les 9:00 i les 14:00. Es van realitzar almenys 10 mesures a cada ratolí i es va utilitzar el valor mitjà per a l'anàlisi.
4.3. Anàlisi PCR de transcripció inversa quantificada en temps real L'ARN total es va extreure dels teixits renals mitjançant ISOGEN (Nippon Gene, Tòquio, Japó) i es va sintetitzar ADN complementari (ADNc) mitjançant el SuperScript IⅢFirst-Strand System (Invitrogen, Waltham, MA, EUA). L'anàlisi de PCR de transcripció inversa quantitativa en temps real es va realitzar mitjançant el sistema de detecció de PCR en temps real CFX96 Touch (Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA, EUA) i els productes de transcripció inversa es van incubar amb TaqMan PCR Master Mix i un TaqMan personalitzat. sonda (Applied Biosystems, Waltham, MA, EUA), tal com es va descriure anteriorment [26]. Es van utilitzar sondes TaqMan contra els següents gens: col·lagen I (Mm00801666_g1), col·lagen II (Mm01254476_m1), TGF- (Mm01178819 m1), p53 (Mm00441964 g1), p21 ( Mm04205640 g1).p16(Mm00494449 m1)GLS (Mm01257297_m1), Bnip3 (Mm{01275600_g1) i Nox2 (Mm{00627011_m1). Els nivells d'ARNm es van normalitzar als de ARN ribosòmic 18S.
4.4. Anàlisi Western Blot L'expressió de proteïnes es va analitzar mitjançant l'anàlisi western blot dels homogeneïtats de teixit mitjançant un mètode descrit anteriorment [27, 28]. Els extractes de proteïnes totals es van preparar a partir dels teixits mitjançant tampó de mostra que conté dodecilsulfat de sodi. La concentració de proteïnes de cada mostra es va mesurar mitjançant el kit d'assaig de proteïnes compatibles amb detergents (Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA, EUA) i el NanoDrop One (Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, EUA), amb albúmina sèrica bovina com a estàndard. Es van fraccionar quantitats iguals d'extractes de proteïnes de les mostres de teixit en gels de poliacrilamida del 5-20 per cent (ATTO Corp., Tòquio, Japó). A continuació, les proteïnes separades es van transferir a membranes de difluorur de polivinilidè mitjançant el sistema de transferència semi-sec (ATTO Corp., Tòquio, Japó). Les membranes es van bloquejar durant 1 h a temperatura ambient amb solució salina tamponada amb fosfat que contenia un 5% de llet desnatada en pols. Les membranes es van incubar amb anticossos primaris contra Klotho (ab181373 1:1000; Abcam, Cambridge, Regne Unit), NAMPT (sc{-67020 1:5000; Abcam), SIRT1 ({07-131 1:1000, MilliporeSigma). , Burlington, MA, EUA), 4-HINE(MHN-100P 1:1000; JaICA, Fukuroi, Japó) i gliceraldehid-3-fosfat deshidrogenasa (GAPDH) (2118, 1:2000; Cell Signaling Technology, Danvers, MA, EUA). Les membranes es van rentar i es van incubar amb anticossos secundaris durant 60 min a temperatura ambient. Els llocs per a les reaccions anticossos-antigen es van visualitzar mitjançant un substrat de quimioluminescència millorat (Merck, Kenilworth, NJ, EUA). Es va utilitzar GAPDH com a control de càrrega. Les imatges es van analitzar quantitativament mitjançant el ChemiDoc Touch (Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA, EUA).
4.5. Anàlisi histològica es va realitzar tal com es va descriure anteriorment [29]. Els teixits renals dels ratolins es van fixar amb un 4% de paraformaldehid i posteriorment es van incrustar en parafina. Les seccions (4 um de gruix) es van tacar amb taques PAS i MT. Per avaluar l'àrea glomerular, es van mesurar i fer una mitjana de 50 glomèruls per ratolí. Totes les imatges es van adquirir mitjançant el microscopi BZ-9000 (Keyence Corp., Osaka, Japó).
CISTANCHE MILLORARÀ LA DIÀLISI RENAL/RENAL
4.6. Tinció SA- -al Els teixits renals de ratolins es van congelar ràpidament i es van muntar en un compost de temperatura de tall òptima (Sakura FinetekJapan, Co., Ltd., Tòquio, Japó). Les seccions (4 μm de gruix) es van preparar mitjançant un criostat (HM550-VPD; Thermo Fisher Scientific) i muntat sobre portaobjectes de vidre. L'activitat SA- -gal es va mesurar mitjançant un kit de detecció de senescència (Bio Vision Inc., Milpitas, CA, EUA) segons els protocols del fabricant. Les mostres es van veure en camp brillant amb un augment de ×100 mitjançant el microscopi BZ-9000 (Keyence Corp.. 4.7. Microscòpia electrònicaL'anàlisi de microscòpia electrònica es va realitzar tal com es va descriure anteriorment [30]. Els ratolins es van anestesiar amb isoflurà i es van perfondre a través de l'arc aòrtic dret amb solució salina fisiològica heparinitzada (5 U/mL) i glutaraldehid al 2,5 per cent en tampó fosfat de 0,1 mol/L a pH 7,4. Les mostres per a la microscòpia electrònica de transmissió es van submergir en tetròxid d'osmi a l'1 per cent durant 2 h, es van deshidratar en sèrie en etanol i es van incrustar en una barreja d'Epon. Les seccions d'Ulitrathin es van tenyir amb acetat d'uranil i citrat de plom i es van examinar mitjançant el microscopi electrònic de transmissió Hitachi H-7500 operat a 80 kV (Hitachi, Ltd., Tòquio, Japó). Les seccions es van observar amb un augment de × 5000 i es van fotografiar amb una càmera de dispositiu acoblada a càrrega.
4.8.Anàlisi BioquímicaEs van recollir mostres de sang mitjançant punció cardíaca en estat alimentat. Les mostres de sang sencera es van centrifugar a 3000 rpm (MR-150; Tomy Seiko Co., Ltd., Tòquio, Japó) durant 10 minuts a 4 graus per separar el plasma. Les mostres de plasma resultants es van emmagatzemar a -80 graus. La creatinina plasmàtica, l'ONU i els nivells de creatinina urinària es van mesurar mitjançant l'autoanalitzador Hitachi 7180 (Hitachi, Ltd., Tòquio, Japó).
4.9. Anàlisi estadística Les anàlisis estadístiques es van realitzar mitjançant el programari GraphPad Prism (GraphPad Software Inc., San Diego, CA, EUA). Les dades es presenten com a mitjana ± SEM. La prova f d'Student no aparellada es va utilitzar per comparar les diferències entre els grups de control de vehicle i AA.p<0.05 was="" considered="" statistically="">
5. ConclusionsCauses de l'administració AAronyósenescència, juntament amb fibrosi tubulointersticial i atròfia renal. Els resultats suggereixen que la fibrosi renal està estretament relacionada amb l'envelliment renal i que l'AAN pot ser útil com aronyó- Model d'envelliment específic.